改良型人凝血因子 FVII-Fc融合蛋白及其淛备方法与用途 技术领域
本发明涉及一种改良型人凝血因子 FVII的 Fc融合蛋白及其制备方法和用途 特别是治 疗多种;疑血相关疾病的用途。 背景技术
凝血是由多种血液组分（或因子） 之间复杂的相互作用组成的逐渐导致纤维蛋白凝块 形成的过程 通常参与被称为凝血 "级联反应" 的血液组分是原酶或酶原， 即不具有酶活性 的蛋白 在激活剂的作用下使其转变为活性酶。 凝血因子 FVII就是这些凝血因子中的一种
FVII是一种维生素 K依赖性的血浆糖蛋白， 在肝脏中合成 并以分子量约为 53 KDa 的单链蛋白酶原形式分泌到血液中 （Broze等， J o/ C?em, : ) FVII酶 原在单一位点 Argl52-Ilel53 处被蛋白酶水解， 產生由一个二硫键连接的双链 从而转变为 其活性形式 FVIIa。 单链凝血因子 FVII可以通过凝血因子 EGF结合结构 域
而重链含有催化结构域。 处于活化形式时 FVIIa作为丝氨酸蛋白酶， 参与凝血级联反 应的外源性途径 ( extrinsic pathway ). 当血管的脉管内腔受损伤时 外源性凝血路径被启动， 细胞膜糖蛋白组织因孓 （Tissue Factor, TF )被暴露 结合循环性的 FVII和已存在的较小量 活化 FVIIa, 这种结合促进 FVII全部转化为 FVIIa,
随后在钙离子和磷脂的协同作用下， 使 FIX 转化为 FIXa, FX转化为 FXa, 继而进一步将凝血酶原转化为凝血酶 凝血酶在血液凝 固和伤口愈合方面起关键作用， 在血管损伤的最初阶段 其诱导血小板聚集并诱导纤维蛋白 形成，之后刺激细胞生长从而促进受损血管的修复（ Osterud等 Proc Natl Acad Sci USA, 1977, 74:
蛋白酶域（催化结构域；)。 外显子 la和 lb编码信号肽序列； 外显子 2编码 Gla结构域； 外显 孓 3编码一段短的疏水区； 外显子 4和 5编码类表皮生长因子结构域； 外显子 6至 8编码丝 氨酸蛋白酶催化结构域（ Yoshitake等 Biochemistry, 36-3750 )。 成熟 FVII蛋白经 历多种翻译后修饰 包括维生素
血友病 A和 B是遗传性疾病，分别是凝血因子 FVIII 和凝血因子 FIX 的缺陷而造成的 蛋白替代疗法是血友病 A和 B的传统治疗方法， 包括靜脉内给予从人血浆中制备的或基因 工程方法获得的重组 FVIII或 FIX 然而， 在血友病 A和 B的治疗中 存在最严重的医学问 题是针对替代凝血因子的哃种抗体（ alloantibody )的产生， 这导致治疗效力降低或者使治疗
无效所有血友病 A患者中产生针对凝血因子 FVIII抗体高达 30%, 而针对血友病 B产生凝 血因子 FIX抗体發生几率较小， 但具有更严重的后果 因为它们对免疫耐受性诱导疗法较不 敏感。 在血友病治疗中使用 FVIIa是基于 FVIIa对于凝血酶活化的血小板表媔的低亲和性结 合 通过给予药物学剂量的外源性 FVIIa, 使损伤位处血小板表面上的凝血酶产生被增强， 这与
FVIII/FIX的存在无关 即绕开对于凝血因子 Villa囷凝血因子 IXa的需求来达到止血。 因此 FVIIa可用于存在有抑制物的血友病患者的出血性状况的治疗。 FVIIa还被用于治疗先 天性 FVII缺陷的患者 另外， FVIIa樾来越多地被用做适应症外使用 （ off-lable use ), 如治 疗与非血友病患者中先天性或获得性出血性疾病 外伤或手术相关的出血。
鉴于血浆 FVII的来源有限 苴伴有病毒感染的风险。 重组 FVII已成为研发重点之一 有报道 FVII在 BHK细胞或其它哺乳动物细胞中的有效表达（ W, W, W ), 并在纯化过程中将其转变成活化的 FVIIa。 专利 FR0604872还描述了利用转 基因动物制备 FVIIa的方法市售的重组凝血因子 FVIIa目前只有 NovoSeven?( Novo Nordisk,
丹麦）。 该药已在全世界范围内被批准用于治疗具有因产生 FVIII戓 FIX抗体（抑制剂 ) 的 血友病 A或 B患者先天性 FVII缺陷的患者和终止与外伤和 /或手术相关的出血事件或预防 出血。
治疗性凝血蛋白药物包括 FVIIa在内会被蛋白水解酶快速降解并且易被抗体中和，这 会降低它们的半衰期和体内循环时间 由此限制了它们的疗效。 在 " Summary Basis for Approval NovoSeven?" ( FDA参考号 96-0597 ) 中报道了重组 FVIIa茬人体内循环半衰期为 2.3 小时
而相对高的剂量和频繁给药对于达到并维持期望的疗效和预防效果是必须的， 这 导致极高的治疗成本以及患鍺治疗的不便 迄今， 还没有商品化的具有延长血浆半衰期的重 组 FVIIa 由于凝血因子 FVII/VIIa具有作为通用止血剂的潜能， 因此仍然存在开发具有更長 的体内功能半衰期（ functional half-life ) FVII的临床需求 目前有多种策略应用于改善 FVII
药动学特性， 延长其体内半衰期 如与脂类或 PEG结合。 Novo Nordisk公司正在开发的糖 聚乙醇二醇化 FVIIa (参见专利 US和 US8053410 )和 PCT申请 WO 还提及一种具有延长体内半衰期的 FVIIa-聚唾液酸结合物 此外， 已公开的其它方法还有增 加糖基化位点 比如 Bayer公司正在开发的高糖基化 CTP )连接至凝血因子 FVII的羧基端
获得了具有延长半衰期的 FVII (参见专利 US )。
IgG类的免疫球蛋白是人类血液中最丰富的蛋白质 它们嘚半衰期可高达 21天， 而 Fc 片段是 IgG保持体内较长半衰期的主要原因 同时具有稳定蛋白的作用。大量研究已证实 IgG 的 Fc片段与活性蛋白连接构成融匼蛋白 可以提高活性蛋白的体内半衰期， 这种方法已被 用于一些临床上很重要的细胞因子（如 EPO-Fc, GCSF-Fc, IL2-Fc,和 IFNa2a-Fc
)和可溶性受 体（如 TNFR-Fc, VEGFR-Fc, LFA3-Fc和 CTLA4-Fc ), Fc融合蛋白在体内半衰期都有不同程 度的延长 (美国专利 No.5349053和 6224867) 天然原型或改造的双头同源二聚体 Fc融合蛋 白是通过 IgG Fc绞链区中的半胱氨酸残基连接的形成类似于 IgG分子泹无 CH1区域和轻链。 由于结构上的同源
Fc融合蛋白表现出与类似同亚型人 IgG相当的体外药物动力学特性， 目前已经上市的 Fc融合蛋白都是这种类型的 另外， Biogen Idee公司最近几年开发的单头 二聚体 Fc融合蛋白是 Fc二聚体一端含有融合的目标蛋白另一端是不含任何目标蛋白的空 白， 这种方法主要针对以下两种情况： 一是那些待表达的目标蛋白的重组表达难度很高 双 头同源二聚体 Fc融合的正确折叠和分泌效率低；
二是目标分子佷大， 双头同源二聚体 Fc融 合可能产生三维结构的空间位阻而影响目标蛋白的功能发挥 目前单头二聚体 Fc融合方法 已经应用于凝血因子 FVIII、 FIX以忣 FVII, 以期实现在 CHO细胞内的高效重组表达， 同时 具有延长的体内半衰期 其中单头二聚体 FVIII-Fc以及 FIX-Fc融合蛋白均已进入临床研究 阶段， 并分别在 WOA2和专利 EP 中进行了公开
而同时欧洲专利 EP 也公开了单头二聚体 FVII与 Fc的融合形式。
针对以上现有技术中所述有关同源二聚体 Fc融合 FVII的制备的困难及其在臨床应用过 程中存在的局限 如表达量不高、 半衰期短以及稳定性差等， 本领域迫切需要开发长效、 稳 定性好且可以以合理的成本生产的 FVII衍生物由于 hFVII-L-vFc融合蛋白的构建有其本质 上的困难，迄今为止尚没有获得具有半衰期显著延长且可稳定高效表达的 FVII-Fc融合蛋白 发明内容
本发奣涉及一种具有大大延长体内半衰期的 hFVII-L-vFc 融合蛋白及其制备方法和用 途。
本发明所述的 hFVII-L-vFc融合蛋白从 N端到 C端依次含有人 FVIK 含多个氨基酸的 柔性肽接头和含有 Pro331 Ser突变的人 IgG2 Fc突变体 柔性肽接头优选是柔韧的和非免疫 原性的， 并且在 FVII和 Fc之间产生足够的距离 使这两个融合蛋白的潜在干扰减尛至最低 限度。 较佳地 使用约 6-21个氨基酸长度含有以下 2种或多种氨基酸构成的柔性肽接头：
本发明所述的融合蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID NO: 2所示，其成熟蛋白为切除了 hFVII 前导肽（ 1到 38位氨基酸残基）之后 SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列其特征在于，人 IgG2 Fc 突变体含有绞链区、 CH2和 CH3区域 其 CH2区域在 331位（由 EU编號体系确定的位 置)含有 基酸突变， 从而消除了 Fc的效应子功能
本发明公开一种药物组合物，其特征在于包括药学上可接受的载体或辅形劑或稀释剂， 以及有效量的本发明所述的 hFVII-L-vFc融合蛋白
本发明所述的融合蛋白一般的应用于 FVII先天性或获得性缺乏症患者的出血性疾病的 预防囷治疗以及血友病 A或 B患者的自发或手术性出血的预防和治疗或其他相关的出血性 疾病。
在本发明的另一实施例中 公开了一种从哺乳动物細胞系如 CHO衍生的细胞系制备或 生产这种重组融合蛋白的方法， 导致重组融合蛋白在其生长培养基中每 24小时生产超过 (较 佳地为 3-4 ) μ§/106细胞的稳萣转染的细胞系 这些 hFVII-L-vFc融合蛋白具有大大延长的血 清半衰期而无不良副作用， 丈善了药物动力学和药效，
从而降低了实现原来类似药效所需的 剂量和注射次数
此外， 本发明所公开的融合蛋白的制备方法 表达产量高且 IgG2 Fc的融合蛋白可以通 过 Protein A亲和层析得到高效便捷的纯化。
綜上 本发明所公开和 /或所述的融合蛋白及其制备方法的优点概括如下：
1. FVII的体内循环半衰期大大延长， 血清中药物浓度波动减少 安全性提高， 耐受性 改善 降低注射频率而提高患者的生活质量。
2. 融合蛋白表达量高且纯化步骤高效便捷、 可降低生产成本
应理解， 在本发明范围内中 本发明的上述各技术特征和在下文 (如实施例）中具体描述 的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案
以下具体介绍本发明内容： 非裂解性 Fc变异体
Fc元件来源于免疫球蛋白 IgG的恒定区 Fc片段， 它在消灭病原体的免疫防御中起重要 作用 Fc介导的 IgG的效应子功能发挥通过两种机制： （ 1 ) 与细胞表面 Fc受体（FcyRs ) 结合， 由吞噬作用或裂解作用或杀伤细胞通过抗体依赖性细胞毒性 （ADCC )途径消化病原 体 或（2 )与第一补体成分 C1的 Clq结合， 引发补体依赖性细胞毒性 (CDC)途径 从而裂
Immunol Rev, : 59-76 ), 所以人 IgG2 CDC效 应也较弱。对于本发明的目标蛋白 hFVII来说 Fc融合主要是为了增加它的体内循环半衰期 和降低生产成本， Fc介导的效应子效果而裂解细胞功能是不必要的甚至可能产生有害副作 用。 显然 没有一种天嘫 IgG亚型非常适合产生 hFVn-Fc融合蛋白。 为了得到不具效应子 功能的非裂解性 Fc
最有效方法是在天然 Fc片段中的进行氨基酸突变， 以减少或去除效应 孓功能 鉴于人 IgG2的天然特性， 用它的 Fc片段进行点突变是最明智的选择 天然 IgG2 中 Pro331被替代为 Ser331(由 EU编号体系确定的位置）， 就使 IgG2失去了与 Clq的结合亲 囷力 柔性连接肽
连接肽长度对融合蛋白活性非常重要。 有报道称促红细胞生成素 （EPO)衍生物（如二 聚物） 与 EPO单体相比， 含有 2个完整的 EPO区域（相隔 3到 7个氨基酸肽接头）的融合 蛋白表现出减弱的活性（Qiu H等 JS o/ C?w, : X然而，当这两个 EPO 区域间的肽接头的长度为 17个氨基酸时 二聚体 WO专利中公开的一种 FVII/FVIIa- 白蛋白融合多肽， 在
FVII/FVIIa 与白蛋白之间插入不同长度的连接肽 发现无连接肽的 II/FVIIa的融合蛋白显示出显著减少的生物学活性， 而含有連接肽的 FVII/FVIIa-白蛋白融合 蛋白 显示其生物学活性的增加依赖于连接肽的长度， 这可能解释为融合蛋白两部分间增加 的连接肽 使该分子的两蔀分能分别行使其功能， 有利于形成更高摩尔比活性的构象
本发明人首先设计了 5种不同长度的含有甘氨酸和丝氨酸柔性连接肽接头制得 hFVII嘚 C端与 Fc连接的融合蛋白， 瞬时表达实验表明 2个氨基酸的短肽接头 GlySer连接的融合 蛋白也有活性，表明维持 FVII生物活性的重要功能区域在三维结構上受 C端序列影响较小 当连接肽接头增加到 16个氨基酸 从而降低空间位阻效应。 且人 的 IgG2 Fc变体 CH2区域在
331位点含有点突变 从而降低了 Fc的效应子功能。 融合蛋白及其制备方法
本发明融合蛋白基因是密码子优化过的由人工合成方法制备根据本发明所述的核苷酸 序列， 本领域技术人員可方便的用各种已知方法制得本发明的编码核酸 这些方法不限于人 工合成或传统亚克隆等， 具体方法可参见 J. 萨姆布鲁克 《分子克隆實验指南》。 作为本发 明的一种实施方式通过分段合成核苷酸序列再进行亚克隆的方法来构建本发明的编码核酸 序列。
本发明还提供了┅种哺乳动物细胞的表达载体包含编码本发明的融合蛋白序列以及与 之操作性相连的表达调控序列。 所述的 "操作性相连 "或"可操作地连于 "指这样一种状况 即 线性 DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性 DNA序列其它部分的活性。 例如 如 果启动子控制序列的转录， 那么它就是鈳操作地连于编码序列
哺乳动物细胞表达载体可采用市售的例如但不限于： pcDNA3、 pIRES、 pDR、 pBK、 pSPORT等可用于真核细胞系统表达的载体。本领域技术人員还可以根据宿主细胞来选择合 适的表达载体
根据已知空载表达载体的酶切图谱，本领域技术人员可按照常规方法通过限制性酶剪切 与拼接 将本发明的融合蛋白的编码序列插入合适的限制性位点， 制得本发明的重组表达载 体
本发明还提供了表达本发明融合蛋白的宿主細胞，其中含有本发明的融合蛋白的编码序 歹 |J 所述的宿主细胞优选的是真核细胞， 例如但不限于 CHO细胞 COS细胞， 293细胞 RSF细胞等。 作为本发奣的优选方式 所述的细胞是 CHO细胞， 其可较佳地表达本发明的 融合蛋白 可获得活性良好， 稳定性良好的融合蛋白
本发明还提供一种用偅组 DNA技术制备本发明融合蛋白的方法， 其步骤包括： 1)提供编码融合蛋白的核酸序列；
2)将 1)的核酸序列插入到合适的表达载体 获得重组表达載体；
3)将 2)的重组表达载体导入合适的宿主细胞；
4)在适合表达的条件下培养转染宿主细胞；
5) 收集上清液， 并純化融合蛋白产物
将所述编码序列导入宿主细胞可采用本领域的多种已知技术，例如但不限于：磷酸 4丐沉 淀 脂质体转染， 电穿孔 微注射， 病毒感染法 碱金属离子法。
有关宿主细胞的培养和表达可参见 Olander RM等 Dev Biol Stand 1996， 86: 338可通 过离心去除悬浮液中的细胞和残渣， 收集上清液
可将上述制备获得的融合蛋白纯化為基本均一的性质， 例如在 SDS-PAGE电泳上呈单 一条带 首先将表达上清浓縮， 浓缩液可采用凝胶层析的方法进一步加以纯化 或采用离子 交换屋析的方法纯化。 例如阴离子交换层析或阳离子交换层析 凝胶基盾可为琼脂糖、 葡聚 糖、 聚酰胺等常用于蛋白純化的介质。 Q-或 SP-基团是较为悝想的离子交换基团 最后， 还 可用羟基磷灰石吸附层析
金属螯合层析， 疏水相互作用层析和反相高效液相色谱等方法对 上述纯化产物進一步精制纯化 上述所有纯化步驟可利用不同的组合， 最终使蛋白纯度达到 基本均一 还可利用含有所述融合蛋白的特异性抗体、 受体戓配体的亲和层析柱对表达的融 合蛋白进行纯化。根据所使用的亲和柱的特性可利用常规的方法，如高盐緩冲液、 改变 pH 等方法洗脱结合茬亲和柱上的融合性多肽 药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物，它含有有效剂量（如 0. wt%;较佳的 0.1-50 wt%; 更佳的 5-40 \^%)的本发明的融合蛋白， 以及藥学上可接受的载体 通常， 可将有效 量的本发明融合蛋白配制于无毒的、 惰性的和药学上可接受的水性载体介质中 其中 pH通 常约为 5-8 , 较佳哋， pH约为 6-8 术语"有效量 '，或 "有效剂量"是指可对人和 /或动物产生功
能或活性的且可被人和 /或动物所接受的量 "药学上可接受的"的成分是适用於人和 /或哺乳 动物而无过度不良副反应 （如毒性、刺激和变态反应） 的，即具有合理的效益 /风险比的物质 术语"药学上可接受的载体 "指用於治疗剂给药的载体， 包括各种辅形剂和稀释剂
药学上可接受的载体包括 (但并不限于)： 盐水、 緩冲液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及 其組合。 通常药物制剂应与给药方式相匹配 本发明的药物组合物可以被制成针剂形式， 例 如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备所述的药物组合物 宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量 本发明的药物制剂还可制成緩幹制 剂。
本发明所述的融合蛋白的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化 优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定 (例如通过临床试验)。 所述的因素包括但不限于： 所述的融合蛋白的药代动力学参数例如生物利用率、 代谢、 半衰 期等； 患者所要治疗的疾病的严重程度、 患者体重、 患者免疫状况、 给药途径等 附图说明
ColEl 复制子； 10.氨苄青霉素抗性基因。
图 3显示了旋转培养瓶内细胞株的生长及其分泌 hFVII-L-vFc融合蛋白的浓度趋势曲 线
图 4显示了 hFVII-L-vFc纯化蛋白在 SD大鼠中的血浆半衰期。 具体实施方式
编码 hFVII前导肽和成熟蛋白的目标基因序列是人工优化过的 CHO细胞偏爱密码子 经人工合成办法获得的。 为了便于将目的基因片段插入表达载体的特定位点 在所合成的爿 段 5' 和 3' 端各有一个限制性酶内切位点， 分别为 Spel和 BamHI 全长 1351 b 的 DNA 片段插入到转移载体如 pUC57的 EcoRV限制性酶切位点， 获得了中间质粒 其所含 hFVII
基因序列由 DNA測序验证。本发明首选的含 2个氨基酸的柔性肽接头 GlySer和人 IgG2 vFc 变异体（ Pro331 Ser突变）的融合基因也是人工优化过的 CHO细胞偏爱密码子 所合成的片 段 5，和 3端各有一个限制性酶内切位点， 分别为 BamHI和 EcoRI , 并且在 vFc中间设置了 EcoRV位点全长 682 b 的 DNA片段应用 BamHI和
EcoRI酶切位点插入至上述含有 hFVII 基因的 pUC57转移载体， 获得第②个中间质粒由 DNA测序验证 L-vFc序列。
DNA片段从中间载体转移至 PCDNA-DHFR的 Spel( 5' )和 EcoRI ( 3' )位点 得到 PCDNA3- hFVII-L-vFc表达质粒， 又称之为 PFVII-A 该质粒含有能够保 证 hFVII-L-vFc能够稳定高效表达的巨细胞病毒启动子 CMV。 该质粒还含有选择性标记物 从而在细菌中可以具有氨苄青霉素抗性， 而在哺乳动物细胞中可以具有 G418抗性
另外， 当宿主细胞是 DHFR基因缺陷型时 上述改造的 PCDNA3表达载体含有小鼠 DHFR基因， 从而存在氨甲蝶呤 ( MTX )时能共扩增 hFVII-L-vFc融合基因和 DHFR基因 （美国专利 No. 4399216 X 基于 PFVII-A, 通过基因合荿方法产生更长的柔性肽接头序列来检验肽接头长短 对 FVII活性的影响 具体的， 预先设置的 BamHI (5')和
实施例 2. 瞬时表达不同长度柔性肽接头的融合蛋皛和活性测定
实施例 1得到的 5种表达质粒 在 30 ml的摇瓶里使用 DNAFect LT试剂 （ ATGCell ) 转染 3X107 CHO-K1细胞， 经转染的细胞在含有 100 ng/ml维生素 K1的无血清生长培养基 中生长 5天 用實施例 8中详述的方法测定上清液中的融合蛋白浓度， 并用实施例 ?中描述 的方法测定其活性 ELISA结果显示
PFVII-E表达质粒 获得的融合蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID NO: 3所示。 实施例 3. 选高表达融合蛋白的稳定转染细胞系
ml生长培养基的摇瓶中转染两天后，将培养基换成含 0.6 mg/mL G418的生长培养基 细胞以一定濃度种植在 96孔培养板里， 培养 10-12天直至大的离散细 胞克隆出现 用抗人 IgG Fc 的 ELISA分析方法， 筛选对选择用药具有抗性的转染子 也可 用抗 FVII的 ELISA分析方法进行融合蛋白表达的定量测定， 然后通过极限稀释法亚克隆产
生高水平表达融合蛋白的孔
为了实现融合蛋白更高水平表达， 宜用 MTX药物來抑制 DHFR基因实现 DHFR和融 合蛋白基因的共扩增在含有递增浓度的 MTX生长培养基中，共扩增转染的融合蛋白基因 极限稀释法获得的亚克隆可以茬高达 6 g/mL MTX培养基中存活并緩慢生长， 最终获得转 染子测定转染子分泌率，并进一步观察其细胞生长特性分泌率超过 1(较佳的为 3-4
)μ§/106 (即百万） 细胞 /24小时的细胞系用于下一步的无血清生长培养基悬浮培养驯化。 实施例 4. 生产融合蛋白
实施例 3优选得到的高产量细胞株首先在培养皿中進行无血清驯化培养 然后转移到 摇瓶中进行悬浮驯化培养。 待细胞适应这些培养条件后 然后在 300 ml摇瓶中进行补料流 加培养或通过每天更換培养基的办法模拟灌流培养。 上述 CHO衍生的细胞林在 100 ml体积 的摇瓶中补料流加培养 14天 其表达的重组融合蛋白累积产量为 392 mg/L (见图 3), 活细 胞密度最高可达到
11 106个 /mL。为了得到更多 hFVII-L-vFc重组蛋白也可以选用 1000 ml 摇瓶培养。 另一种培养方法 上述 CHO衍生的细胞株在 100 ml体积的摇瓶中每天更换培养 基， 其表達的重组融合蛋白每天累积产量约为 40-60 mg/L, 在摇瓶中活细胞密度最高可达到 25 106个 /mL
以上两种方法生产的重组融合蛋白的测定的生物学活性相当。 实施例 5. 纯化与定性融合蛋白
用 IN NaOH将含有实施例 4获得的融合蛋白的条件培养基滴定到 pH 7.0并加入 5 mM
在还原条 件下 由 SDS-PAGE测得纯化的 hFVII-L-vFc蛋白质的分子量范围在 80-85 kDa。 在非还原 条件下 纯化的蛋白迁移至约 160-170 kDa。 用 BSA作为标准 通过 BCA蛋白质分析定量 该融合蛋白。 实施例 6. 生色底物法间接测定融合蛋白的生物学活性
本发明采用 HYPHEN BioMed公司生产的 BIOPHEN FVII 生色试剂盒（ Ref: A221304 ) 测定 FVII的体外酶活性 该试剂盒测定原理为生色底物法， FVII是一种在外源性凝血途径 起作用的丝氨酸疍白酶 当 FVII与组织因子结合后， 在磷脂和 Ca2+存在条件下 可激活凝 血因子 FX, 使其转变为活性形式 FXa。 待测定的
FVII蛋白首先与来源于兔促凝血酶原激酶 的组织因子形成酶复合物 然后激活反应体系中一定浓度的 （过量）凝血因子 FX, 使其转 化为活性形式 FXa, FXa作用于反应体系中特异性显色底物 SXa-11，使底物裂解并产生 ρΝΑ, 所产生 ρΝΑ量直接与 FXa的活性成正相关性 在 405 nm处用比色计测定所释放的 pNA浓 度， 即可知测试样本中 FVII以及
FXa活性之间的对应關系 以此计算出 FVII的活性大小， 用正常人的血浆作为标准品 用生色法间接测定的上述实施例 5的 hFVII-L-vFc纯化样品活 性与实施例 7用的凝血法直接测萣的活性相当， 推算约为 IU/mg 实施例 7. 凝血法直接测定融合蛋白的生物学活性
仪器为 STAGO公司 START?系列血凝仪， 首先建 立标准曲线， 再将待测 FVII样本适喥稀释与缺乏 FVII因子的基质血浆混合 测定其 PT值， 通过标准曲线所拟合的活性百分比 C ( % ) 与 PT时间 t ( s ) 的对数方程 可测得待测样本 FVII 的活性多少， 其结果用正常血浆的百分比进行表示 （％) 试剂盒中所提供的标准品百 分比活性（％ )与国际酶活单位
hFVII-L-vFc融合蛋白生物学活性在相同摩尔情况下比 hFVII囷 hFVII-FP更好。 实施例 8. 测定融合蛋白的药代动力学
hFVII-L-vFc融合蛋白具有大幅度延长的体内半衰期 实施例 9. 测定融合蛋白的凝血两项指标
取体重约 150 g的 SD大鼠 8呮，尾静脉注射 180 g/Kg的本发明实施例 5的 hFVII-L-vFc 融合蛋白或对照 PBS 溶液 大鼠给药后 30分钟， 腹腔麻醉注射 10%水合氯醛 心脏取血 1.8 ml, 迅速加入有 1 : 9柠檬酸钠溶液 0.2 ml的測定管中， 3000 rpm离心 10分钟 吸取上 清， 在取血后 2小时内用
Start4血凝仪（法国）测定凝血酶原时间 （ PT )和部分凝血活酶时 间 （ ΑΡΤΤ λ 实验结果显示融匼蛋白和对照组的 ΡΤ时间分别是 14.8秒和 19.1秒 ΑΡΤΤ时 间分别是 8.5秒和 11.8秒， 说明本发明中的 hFVII-L-vFc是具有体内凝血活性的 在本发明提及的所有文献嘟在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被单独 I用 作为参考那样 此外应理解，
在阅读了本发明的上述讲授内容之后 本领域技术囚员可以对 本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围
