五、其他动物疫病其他动物疫病犬致病性大肠杆菌的分离和鉴定*纪雪，孙洋，赵相胜，佟盼盼，郭学军，刘军，祝令伟，周伟，周博，冯书章** （军事医学科学院，军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春，130062） 摘 要 从 9 份病犬犬血便和 6 份健康犬粪便样品中分离出 17 株大肠杆菌，对 17 株大肠杆菌分别进行了生化鉴定， 耐药基因 blaCTX-M、blaTEM 和 blaSHV 的 PCR 扩增，13 种抗菌药的药敏检测，以及 MLST 分型、菌株分群和质粒 分型。 研究发现， 病犬分离出的大肠杆菌为致病性的多药耐药菌， 携带多种质粒以及 blaCTX-M 和/或 blaTEM-1 基因， 健康犬分离出的大肠杆菌对多数抗菌药敏感，绝大部分未检测到质粒及 blaCTX-M、blaTEM 和 blaSHV 耐药基因。本 研究从健康犬大肠杆菌分离株检测到 3 种新的 ST 型，分别为 ST4001、ST4002 和 ST4003。结果表明，犬致病性大肠 杆菌耐药情况严重，应予以重视。 关键词 犬；大肠杆菌；多重耐药；耐药基因大肠杆菌是临床感染中最常见的条件致病菌，近年来，由于广谱抗生素的广泛使用，大肠杆菌产 超广谱 β-内酰胺酶（extended-spectrum-β-lactamases, ESBLs）菌株的检出率日益增高[1]。ESBLs 能水 解青霉素类和头孢菌素类抗生素，是介导革兰氏阴性杆菌对 β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制之一。 ESBLs 由细菌质粒编码，可通过水平转移使耐药基因在细菌间扩散，造成严重的院内感染和耐药菌株 的广泛传播。ESBLs 属于 Ambler 分类的 A 类，按 Bush 分类属 2be 群，主要包括 TEM、SHV、CTX -M 等基因型[2]。 工作犬和宠物犬在人和动物细菌耐药性传播中均起到重要的作用，因为它们与人类关系密切，且 使用的治疗药物也与人类相似，所以，犬源耐药菌很容易传染人，也容易造成耐药元件水平转移到人 源细菌中。随着犬携带的耐药菌对人类的威胁日益严重，犬作为耐药菌贮存宿主的问题需要得到更多 关注。 研究表明， 犬携带的人兽共患病病原菌呈现耐药性升高的趋势， 且耐药谱也越来越广[3]。 因此， 对犬源耐药菌的深入研究，可为指导工作犬和宠物犬的临床用药以及耐药性监测提供理论依据，并将 有助于我们更好地预防人兽共患病，避免疫情爆发。本研究对 2012 年分离自工作犬和宠物犬的大肠 杆菌进行了分离、鉴定，检测了大肠杆菌分离株的耐药基因和对常规抗菌药的耐药性，分析比较了病 犬和健康犬的耐药情况。11.1材料与方法菌株2012 年分离自某地工作犬培养基地病犬大肠杆菌 4 株，健康工作犬大肠杆菌 8 株，宠物犬病犬 大肠杆菌 5 株。药敏试验质控菌为大肠杆菌 ATCC 25922。 1.2 试剂和培养基 PCR 试剂、DNA Marker DL2000、限制性内切酶均购自日本 TaKaRa 公司；药敏片均购自 OXOI D 公司；麦康凯琼脂购自青岛高科园海博生物技术有限公司，尿道定位显色培养基购自法国科玛嘉公 司，MH 琼脂购自法国梅里埃公司。 1.3 细菌分离鉴定 将病犬犬血便用无菌生理盐水重悬，上清接种于 LB 培养基中，37℃培养 16h，增菌液腹腔注射 Balb/c 小鼠（16-18g） 。取死亡小鼠的心脏，在麦康凯琼脂平板上划线，37℃培养 16h，挑取若干典型 单菌落，用 Phoenix100 全自动微生物鉴定仪（Bio Rad）进行生化鉴定。 将健康犬粪便用无菌生理盐水重悬，上清在尿道定位显色培养基平板上划线，37℃培养 16h，挑 取若干典型单菌落，用 Phoenix100 全自动微生物鉴定仪（Bio Rad）进行生化鉴定。*国家科技重大专项（No.-217-002） ，863 项目（） 作者简介：纪雪（1979-） ，女，硕士，军事医学科学院军事兽医研究所助理实验师。 通讯地址：吉林省长春市净月开发区柳莺西路 666 号军事兽医研究，130122 **通讯作者 Email: 1165第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集1.4 药敏试验 参照美国临床和实验室标准化协会（Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI, 2012）推荐方 法，采用 Kirby-Bauer 纸片扩散法，根据抑菌圈大小判断耐药（R） 、中介（I）和敏感（S） 。选用 13 种 药物：氨苄西林、头孢他啶、头孢噻肟、头孢曲松、美洛培南、庆大霉素、氯霉素、磺胺甲基异恶唑、 四环素、阿米卡星、多黏菌素、环丙沙星和左氧氟沙星。 1.5 ESBL 表型耐药基因检测依据文献，对 blaTEM 和 blaSHV 基因的全长进行 PCR 扩增[4]，扩增产物测序并比对。对 blaCT X-M 基因先进行短片段 PCR 扩增，阳性菌株再进行 blaCTX-M 基因全长扩增[5]，扩增产物测序并比 对。序列比对均利用 BLAST 程序（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST） 。 1.6 质粒分型 根据文献，采用多重 PCR 方法，利用 18 对引物对质粒进行复制子分型[6]。 1.7 细菌的分群和分型 利用多重 PCR 方法对大肠杆菌分离株进行分群[7]。采用 PCR 方法对大肠杆菌进行 MLST 分型： 扩增 7 个管家基因，adk、fumC、gyrB、icd、purA、mdh 和 recA 基因，引物序列参考 http://mlst.ucc.i e/mlst/dbs/Ecoli，将扩增产物进行测序，测序结果在 http://mlst.ucc.ie/mlst/dbs/Ecoli 上进行比对分型。2结果2.1 细菌鉴定结果 经全自动微生物鉴定仪生化鉴定，17 株分离株均为大肠杆菌。 2.2 药敏试验结果 17 株犬源大肠杆菌分离株对 13 种抗菌药的耐药结果见表 1。病犬对绝大多数头孢菌素类抗菌药 和常用喹诺酮类抗菌药呈现耐药，健康犬则对大多数抗菌药普遍保持了敏感性。健康工作犬对阿米卡 星和氯霉素已产生了一定的耐药。表1 抗菌药物 氨苄西林 头孢噻肟 头孢他啶 头孢曲松 美洛培南 庆大霉素 阿米卡星 左氧氟沙星 环丙沙星 四环素 磺胺甲基异恶唑 氯霉素 多粘菌素 药物浓度（ug） 10 30 30 30 10 10 30 5 5 30 25 30 300 17 株大肠杆菌药敏结果 耐药率%（耐药菌株数） 工作犬病犬 健康工作犬 100%（4） 12.5%（1） 100%（4） 12.5%（1） 100%（4） 0（0） 100%（4） 12.5%（1） 0（0） 12.5%（1） 100%（4） 12.5%（1） 100%（4） 75%（6） 75%（3） 0（0） 75%（3） 0（0） 100%（4） 25%（2） 100%（4） 25%（2） 100%（4） 50%（4） 0（0） 0（0） 宠物病犬 100% （5） 80%（4） 0（0） 80%（4） 0（0） 0（0） 0（0） 60%（3） 60%（3） 60%（3） 60%（3） 20%（1） 0（0）抑菌圈大小 （mm） Q13 Q22 Q17 Q19 Q19 Q12 Q14 Q13 Q15 Q11 Q10 Q12 Q82.3 耐药基因检测结果 三种 ESBLs 表型耐药基因检测结果显示：病犬分离大肠杆菌 TEM-1（n=7） ，CTX-M（n=7） ，SH V 均阴性；健康犬分离大肠杆菌，TEM-1、CTX-M 和 SHV 均阴性，见表 2。 2.4 质粒分型结果1166其他动物疫病9 株大肠杆菌鉴定出了所携带质粒的类型，FIB（n=8） ，N（n=4） ，L、B/O（n=2） ，P、I1（n=1） ， 见表 2。表2 耐药基因 SHV 17 株大肠杆菌鉴定结果 TEM TEM-1 TEM-1 TEM-1 TEM-1 TEMTEM-1 TEM-1 质粒分型 FIB、N、L N、L FIB、N FIB、N、P、I1 unidentified unidentified FIB unidentified FIB unidentified unidentified unidentified FIB、B/O FIB、B/O unidentified unidentified FIB 菌株 ST 型 117 5 02 1
92 92 92 617 菌株分群 D B2 D A B1 B1 A A A A A A B2 B2 B2 B2 B1菌株名称 AD3 AD5 AD7 AD8 CO1228c CO1160a CO1158c CO1141a CO1130d CO1123a CO1123b CO1123c D1 D2 D3 D4 D5CTX-M CTX-M CTX-M CTX-M CTX-M CTX-M CTX-M CTX-M -2.5 菌株分群和分型结果 17 株大肠杆菌分群结果：病犬分离大肠杆菌 B2 群（n=5） ，D 群（n=2） ，A 群、B 群（n=1） ；健 康犬分离大肠杆菌，A 群（n=6） ，B1 群（n=2） ，见表 2。菌株分型结果：工作犬病犬分离大肠杆菌有 2 株 ST 型一致，宠物犬病犬分离大肠杆菌有 4 株 ST 型一致，健康犬分离大肠杆菌有 4 株为新 ST 型 菌株，分别为 ST4001、ST4002 和 ST4003，见表 2。3讨论我们从 4 份工作犬犬血便样品中分离出 4 株大肠杆菌， 从 6 份健康工作犬粪便样品中分离出 8 株 大肠杆菌，从 5 份宠物犬犬血便样品中分离出 5 株大肠杆菌。工作犬病犬分离出的大肠杆菌对头孢类 抗菌药、氨基糖苷类抗菌药、喹诺酮类抗菌药等 11 种抗菌药几乎全部耐药，对碳青霉烯类抗菌药和 多粘菌素敏感，耐药种类与犬临床治疗经常使用的药物几本一致，而健康工作犬分离出的大肠杆菌则 对 13 种抗菌药的绝大多数（除阿米卡星和氯霉素）保持了敏感性，此外，宠物犬病犬分离出的大肠 杆菌对头孢类抗菌药和喹诺酮类抗菌药等 7 种抗菌药几乎全部耐药，对氨基糖苷类抗菌药、碳青霉烯 类抗菌药和多粘菌素敏感。由此可见，临床大量和频繁使用抗菌药使条件致病性大肠杆菌的耐药谱扩 大，大大增加了临床治疗病犬的难度。 根据系统进化分析，大肠杆菌可分为四个群，即 A、B1、B2 和 D 群，其中致病性菌株主要属于 B2 和 D 群[7]。我们从病犬分离出的 9 株大肠杆菌在分群上 78%（n=7）属于致病性的 B2 和 D 群，从 健康犬分离出的 8 株大肠杆菌均属非致病的 A 和 B1 群，可以看出，大肠杆菌的致病性与分群类型基 本符合。同时，本研究中属于 B2 群和 D 群的致病性大肠杆菌分离株均为多药耐药菌。 我们从健康工作犬分离出了 4 株新的 ST 型大肠杆菌，分别为 ST4001、ST4002 和 ST4003。工作 犬病犬分离出的致病性大肠杆菌有 2 株 ST 型一致（ST117） ，初步推测，该型菌株应为导致此次工作 犬腹泻的病原菌。宠物犬病犬分离出的致病性大肠杆菌有 4 株 ST 型一致（ST92） ，因其为同一批发 病的犬分离株，我们认为该型菌株为宠物犬腹泻的主要病原菌。 在多药耐药致病性大肠杆菌中，我们均检测到 blaCTX-M 和/或 blaTEM-1 基因，并检测到其携带 有一种或几种质粒。健康犬分离的大肠杆菌未检测到 blaCTX-M、blaTEM 和 blaSHV 基因，且 75% （n=6）的分离株未检测到质粒，这初步验证了 ESBLs 是通过质粒传播的。 大肠杆菌是造成动物尿道和肠道感染的最主要细菌之一，感染率较高，而且极易产生耐药性[8]。 由于人类经常和宠物亲密接触，从而会发生耐药菌从宠物向人的传播，已有研究发现，从尿道感染的 犬分离的大肠杆菌和肠道感染的人体内分离的肠道致病性大肠杆菌（EPEC）的系统发生和致病型均 相似[9-10]。因此，重视犬源致病性大肠杆菌耐药性的研究，将有助于控制耐药性的人兽传播，有利于1167第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集公共卫生安全。本研究对犬致病性大肠杆菌分离株的耐药谱、耐药基因以及菌株类型等已进行了初步 的鉴定和分析，下一步我们还将对其耐药基因的遗传背景和水平转移等做更深入的探索。参考文献（略）犬类布鲁氏菌的分离与鉴定?王宁，王真，胡蒙蒙，吴清民* （中国农业大学动物医学院，农业部人畜共患病重点开放实验室，北京海淀，100193）自 2009 年以来， 我们对本校动物医院宠物门诊送检样品以及全国各养犬爱好者送检流产物样品， 共计 257 份， 通过涂片染色镜检、 分离培养、 形态观察、 生化鉴定和 PCR 鉴定， 确定 37 株布鲁氏菌， 细菌分离率 14.39%。在此基础上，通过菌落结晶紫染色、R 型单因子血清凝集试验、A 因子和 M 因 子血清凝集试验、吖啶黄溶液沉淀试验及生化鉴定，确定其中犬种布鲁氏菌 25 株、羊种布鲁氏菌 6 株、牛种布鲁氏菌 5 株，另外 1 株疑似为绵羊附睾种布鲁氏菌。在分离菌株的样品来源方面，批量养 殖（犬场）犬 29 株，占分离菌株总数的 78.38%；个人养殖的宠物犬分离菌 8 株，占总数的 21.62%， 其中 1 例饲养宠物犬的主人呈现发热、全身肌肉关节疼痛等类似布鲁氏菌病症状，从该宠物犬流产物 分离获得 1 株犬种布鲁氏菌。 上述结果表明，近年犬感染布鲁氏菌分离率有所上升，犬类感染布鲁氏菌种类复杂，包括犬种布 鲁氏菌、 羊种布鲁氏菌和牛种布鲁氏菌， 这些布鲁氏菌对人类健康和公共卫生安全都具有重要的影响， 提示我们应密切关注犬在人布鲁氏菌病传播中的作用以及防控技术方法的研究。林麝肠道可培养微生物的分离、鉴定、分型及乳酸菌的应用马炳存，王红宁，徐鹏伟，杨鑫，张安云，邹立扣 （四川大学生命科学学院，动物疫病防控与食品安全四川省重点实验室，生物资源与生态环境，教育部重点实验室， “985 工程”西南资源环境与灾害防治科技创新平台，四川成都，610064）近年来，人工养麝场中林麝肠炎疾病导致幼麝死亡率居高不下，为研究林麝肠道正常微生物菌群 多样性，找到适应林麝肠道环境，对林麝肠炎疾病有预防和治疗作用的乳酸菌菌种。本研究对林麝肠 道可培养微生物进行了分离、鉴定和分型研究，并对林麝肠道乳酸菌的益生作用指标进行了测定。 本研究从健康林麝粪便中分离林麝正常肠道微生物菌群，并对分离到的菌株进行了常规鉴定、分 子生物学鉴定和基因分型分析，对分离到的乳酸菌进行了耐酸性、耐盐性、生长性、抑菌性、安全性 和耐药性等生物学特性测定。 本研究共分离得到了 11 种 38 株细菌，通过形态学、生理生化和分子生物学鉴定，其中大肠杆菌 （Escherichia coli，11 株）和蒙氏肠球菌（Enterococcus mundtii，5 株）分别为林麝肠道优势肠杆菌 和优势乳酸菌菌群。脉冲场凝胶电泳分析结果表明分离到的 38 株菌株可分为 16 种基因型，其中大肠 杆菌和耐久肠球菌分别有 3 种基因型，种间基因型差异较大，其余各菌种每种仅有一种基因型。乳酸 菌的生物学特性实验结果表明，植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和明串球菌在 pH2.0 和 0.9%胆盐条件下可 正常生长；耐久肠球菌能够耐受较高环境温度（70℃） ；对致病性大肠杆菌（ATCC25922） 、肠炎沙门作者简介：王宁，女，中国农业大学预防兽医学硕士生，主要从事布鲁氏菌病病原特性和流行病学研究。 通讯作者：吴清民 wuqm@cau.edu.cn。 1168其他动物疫病氏菌（CVCC527）和金黄色葡萄球菌（ATCC29213）的生长有较好的抑制作用；不产吲哚和硫化氢， 攻毒昆明鼠未见临床病理症状，无致病性；适于制备微生态制剂。以植物乳杆菌 104 CFU/ml+嗜酸乳 杆菌 103 CFU/ml+明串球菌 103 CFU/ml 的比例混合配伍，制备复合微生态制剂饲喂昆明鼠，结果表 明此配伍比例的乳酸菌对肠炎沙门氏菌（CVCC3377）感染的保护率为 100%。 林麝肠道可培养微生物以大肠杆菌和乳球菌为主要优势菌群且各个菌种种内变异很小， 表明林麝 肠道微生物群落结构较为稳定。以乳酸菌复合配伍的微生态制剂对动物肠道环境有较好的调节作用， 对林麝肠炎疾病的预防与治疗提供了新方法。猫杯状病毒的分离鉴定及其 ORF2 基因的序列分析陈小庆 1，应瑛 1，范胜涛 2，赵艳丽 1，姜雪 1，刘秋艳 1，高玉伟 2，胡桂学 1* （1. 吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春，. 军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春， 130122） 摘 要 为了解猫杯状病毒（feline calicivirus, FCV）在吉林省健康猫群中的流行情况，阐明其 ORF2 基因的遗传变异 特性，本实验采用实时荧光定量 PCR 检测了采自临床健康宠物猫的口腔棉拭子。将阳性病料处理液接种 F81 细胞，分 离病毒。以电镜观察、半巢式 PCR 等方法鉴定分离病毒；RT-PCR 扩增出 ORF2 基因，进行克隆、序列测定，最后用 生物学软件对基因序列进行分析。结果显示，成功分离出 1 株猫杯状病毒，暂命名为 CH-JL1 株。测序获得 ORF2 基 因序列，全长为 2 007nt。序列分析显示，其与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为 68.8%-78.4%。核苷酸分子遗传衍 化分析显示，CH-JL1 株可能起源于 UTCVM HI 株。 关键词 猫杯状病毒；分离鉴定；ORF2猫杯状病毒（feline calicivirus, FCV）能诱发猫科动物口腔和上呼吸道感染，具有高度传染性。 FCV 感染猫可产生上呼吸道感染、口腔溃疡、慢性口炎、鼻炎、结膜炎、肺炎与跛行等症状，与猫疱 疹病毒（feline herpesvirus, FHV）引起的猫传染性鼻炎十分相似，二者也常混合感染[1]。该病发病率 极高，成年猫的死亡率较低，幼猫的死亡率较高可达 40%以上。自然条件下，仅猫科动物易感，常发 于 6-84 日龄的幼猫。猫杯状病毒主要在口腔和呼吸道的组织中增殖，可以通过唾液、眼泪、鼻液等扩 散传播。临床康复猫可长期排毒，是重要的传染源。 猫杯状病毒全基因组分三个开放性阅读框（ORFs） ，其中 ORF2 主要编码衣壳蛋白，分为 A-F 六 个区域。A 区经蛋白酶切割形成成熟的衣壳蛋白，B、D、F 区相对保守，C、E 区变异较大。E 区含 有主要 B 细胞表位，可作为毒株分型的参照[2]。因为 FCV 大多数的抗原位点都在 ORF2 所编码的衣 壳蛋白上，所以研究 ORF2 的基因序列具有重要的意义。1材料及方法1.1 主要材料 猫口腔棉拭子采集自吉林省临床健康的宠物猫， F81 细胞由军事医学科学院军事兽医研究所惠赠。 DMEM 培养基购自 Hyclone 公司，新生牛血清购自杭州四季青生物公司，pMD18-T-simple 载体试剂 盒均购自 TaKaRa 公司，反转录试剂盒购自全式金生物公司，胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自 索莱宝生物公司。 1.2 方法 1.2.1 样本处理与检测 将采集的猫口腔棉拭子加 500μL PBS 缓冲液溶解 5min， 13 000r/min 离心 5min， 将棉试纸弃去， -80°C 保存备用。采用本实验室已经建立的实时荧光定量 PCR 方法[3]对上述处理的 9 份猫口腔棉拭子 制备液进行检测。 1.2.2 病毒的分离 将检测呈阳性的病料处理液接种于 F81 细胞进行传代培养，观察细胞病变效应。1169第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集1.2.3 分离病毒的鉴定 采用电镜负染观察、巢式 PCR[4]和 RT-PCR 方法对病毒进行鉴定。 1.2.4 ORF2 的克隆与测序 利用本实验室设计合成的 FCV-ORF2 引物扩增 ORF2 基因，纯化回收后与 pMD18-T 载体连接、 转化至感受态细胞、筛选阳性克隆。将鉴定的阳性克隆重组质粒送往 Invitrogen 公司测序、拼接。利 用 DNAStar、DNAMAN、MEGA 等生物学软件对 ORF2 进行同源性和遗传衍化分析。2结果2.1 荧光实时定量 PCR 检测结果 从吉林地区收集的 9 份样品中， 有 4 份呈阳性， 其他均为阴性。 核酸阳性检出率为 44.4% （4/9） 。 2.2 分离培养结果 在 4 份经荧光实时定量 PCR 检测呈阳性的病料中，有 1 份病料在接种 F81 后传至四代，细胞出 现葡萄串样病变，最后细胞完全脱落悬浮。未接种对照细胞生长良好。 2.3 分离病毒的鉴定结果 电镜负染观察病变细胞培养物，发现病毒粒子呈球形，无囊膜，直径约为 40nm。提取病毒液的 RNA 并反转录，再经巢式 PCR 和普通 PCR 检测，结果均呈阳性。由此说明，从病料中分离到 1 株猫 杯状病毒，暂命名为 CH-JL1 株。 2.4 ORF2 的克隆及测序分析提取 CH-JL1 株细胞培养物总 RNA，RT-PCR 扩增出 ORF2 基因，并进行克隆。将克隆后的菌液 提取质粒，送往生物公司进行序列测定。测序结果显示，该病毒株的 ORF2 全长为 2 007nt。与 NCB I 上发布的美国、英国、德国、加拿大、澳大利亚等国家 FCV 分离株 ORF2 基因进行核苷酸分子同源 性分析，结果发现，CH-JL1 株与 CH-GD 株的同源性最高，为 78.4%，与 DD-GE 株的同源性最低， 为 68.8%。CH-GD 株分离自中国广东，DD-GE 分离自德国。核苷酸分子遗传衍化分析显示，CH-JL1 株可能是由 UTCVM H1 株进化而来，同时与 CH-GD 株处于同一分支，说明亲缘关系较近。利用 M EGA 生物学软件[5]对 CH-JL1 株与 F9 株的氨基酸序列进行比对，结果发现，CH-JL1 株比 F9 株少 3 个氨基酸，主要的氨基酸变异出现在 5'HVR_E 和 3'HVR_E。CH-JL1 株在 439-441 处变异为 NQS，与 F9 株 5'HVR_E 中线性表位 ITTATGYDTADII（446-459）相比，CH-JL1 株在 446-459 处发生变异，而 另两个线性表位未发生变异。3讨论从本研究的阳性检出率和分离病毒结果来看，吉林地区健康猫带毒占有一定的比例。猫杯状病毒 是高度接触性传染的病原，健康猫带毒危害猫群健康。 目前大多数 FCV 的基因工程疫苗都是依据 ORF2 基因特点进行研制，此类疫苗可诱导产生针对 FCV 的中和抗体，所以对 FCV ORF2 基因的研究具有重要的意义。本试验对 CH-JL1 的 ORF2 进行 序列测定，并用生物学软件比对分析，不仅丰富了 FCV ORF2 基因数据库，更为 FCV 疫苗的研制奠 定了一定的基础。从 ORF2 核苷酸同源性分析和衍变进化分析结果来看，各 FCV 分离株呈现出一定 的地域差异。与 F9 株比较发现，CH-JL1 株在 439-441 处发生变异，而据报道 F9 株 5'HVR_E 中 439 -441（NGT）能与抗体发生强烈反应[6]，因此推测 CH-JL1 可能是弱毒株，要做进一步的动物实验才 能确定。线性表位分析显示，CH-JL1 株与 F9 株的线性表位变异不明显。 猫杯状病毒感染的流行广泛，该病毒的变异性很大，严重影响宠物的健康。本实验通过对吉林地 区健康宠物猫的口腔棉拭子进行检查，核酸阳性率为 44.4%（4/9） ，并分离到 1 株猫杯状病毒，证实 该病毒在临床健康宠物猫中带毒率较高。健康猫带毒常呈持续感染状态，导致病毒发生变异，易产生 致死性毒株， 使疾病难于控制。 基于上述实验结果， 吉林地区健康宠物猫中存在一定比例的带毒现象。 因此，应加强宠物猫的疫苗接种，减少健康猫带毒排毒，有效控制疾病流行。参考文献（略）1170其他动物疫病甲鱼源沙门氏菌的分离及耐药性研究潘海建 1，旷代1,2，杨筱薇 1，张建民 1 （1. 上海交通大学农业与生物学院，上海，. 华南农业大学兽医学院，广州，510642） 摘 要 沙门氏菌病是一种重要的人畜共患病，甲鱼是沙门氏菌的健康携带者，甲鱼可在正常情况下携带沙门氏菌， 但并不表现出任何的临床症状，但它会通过粪便不断地向体外排泄沙门氏菌，造成环境污染，导致其它动物和人感染 沙门氏菌，从而造成严重后果。目前为止，我国还没有关于甲鱼携带沙门氏菌的报道。我们对分离自上海地区甲鱼的 82 株沙门氏菌进行研究。 血清型鉴定显示它们隶属于 22 个不同的血清型， 其中 S.Thompson 14 株 （17.1%） ， S.Hvittingfoss 8 株（9.8%） ，S.Typhimurium 7 株（8.5%）和 S.Wandsworth 7 株（8.5%）等。采用琼脂稀释法检测这些沙门氏菌的最 小抑菌浓度（Minimium Inhibitory Concentration, MIC） ，结果显示这 82 株甲鱼源沙门氏菌对多种抗生素有很高的耐药 性：磺胺异f唑（100%） 、甲氧S啶/磺胺甲f唑（96.3％） 、四环素（69.5%） 、氨苄西林（63.4%） 、卡那霉素（62.2％） 、 阿莫西林/克拉维酸钾（51.2%） 、氯霉素（42.7％） 、链霉素（34.1％） 、萘啶酮酸（26.8％） 、庆大霉素（12.2％） 、环丙 沙星（6.1％）和头孢曲松钠（3.7％） 。对左氧氟沙星和阿米卡星全部敏感。有 69 株（84.1%）沙门氏菌至少可抗 3 种 或 3 种以上的抗生素产生耐药性。通过对甲鱼源沙门氏菌和人源沙门氏菌进行 PFGE 分析，发现部分甲鱼源沙门氏菌 与人源菌株具有相同的 PFGE 模式，提示甲鱼源沙门氏菌可能是人沙门氏菌的一个重要的储存器。 关键词 沙门氏菌；流行病学；耐药性；PFGE；甲鱼蝙蝠轮状病毒分离与鉴定夏乐乐 1，2，何彪 2，杨凡力 2，徐琳 2，涂长春 2 （1. 吉林农业大学动物科技学院，吉林长春，. 军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春，130122） 摘 要 蝙蝠因能携带和传播多种人兽共患病毒，在病原生态学上具有重要意义。为了了解我国蝙蝠携带病毒情况， 本研究对采自云南省不同种类蝙蝠进行病毒宏基因组学研究，发现了轮状病毒序列。通过泛轮状病毒 RT-PCR 方法， 检测到两份阳性蝙蝠肠道组织样品。通过细胞培养分离，成功从两份阳性样品中分离到病毒，并用电镜观察到典型的 成熟的轮状病毒颗粒。进一步基因分析发现来自小菊头蝠的毒株（ MSLH14 ）为 G3P[3] 型，来自三叶蹄蝠的毒株 （MYAS33）为 G3P[10]型。本研究通过病毒宏基因组学从食虫蝙蝠体内检测到轮状病毒，结合传统的 RT-PCR、细胞 分离、电镜观察等获得了两株轮状病毒形态和基因信息。本研究首次报道食虫蝙蝠携带轮状病毒，为今后人和动物轮 状病毒病的防控提供了新的思考。 关键词 蝙蝠；轮状病毒；分离鉴定A 群轮状病毒（Rotavirus, RVA）是导致婴幼儿及 5 岁以下儿童急性重症腹泻及胃肠炎的重要病 原体，世界范围内每年引起 453，000 人死亡，特别是在发展中国家。RVA 为典型的人兽共患病毒， 其宿主范围广泛，可以感染人及多种幼龄动物包括马、猫、狗、猪、牛等。RVA 属于呼肠孤病毒科轮 状病毒属，基因组包含 11 个分节段的双链 RNA，除最后一个片段外每个片段单独编码一个多肽，病 毒共表达 6 个非结构蛋白（NSPs）和 6 个结构蛋白（VPs） 。成熟的病毒粒子形似轮子，具有轮辐及 三层蛋白质衣壳。最外层衣壳由 VP7 和 VP4 蛋白组成，这两个蛋白可以诱导产生中和抗体。编码这 两个蛋白的基因分别决定 G 基因型与 P 基因型，这两个基因型常用于轮状病毒的二命名法。 蝙蝠是重要的病毒储藏库，可以携带大约 130 种病毒，其中许多对人类具有致病性，包括埃博拉 病毒、尼帕病毒、亨德拉病毒、狂犬病病毒等。随着第二代高通量测序技术的发展，病毒宏基因组学 方法已经成功应用于蝙蝠携带病毒的调查，在过去的 4 年时间里，发现了许多新的病毒，例如蝙蝠圆作者简介：潘海建（1987- ） ，男，山东人，博士，研究方向：食源性致病微生物 通讯作者：张建民（1983- ） ，男，河南人，博士后，从事人畜共患病与食品微生物研究，E-mail：，Tel：021- 基金项目：中国博士后科学基金第 50 批面上项目（） ，中国博士后科学基金第 5 批特别资助项目 （） 。 1171第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集环病毒、蝙蝠乳头瘤病毒、蝙蝠博卡病毒、蝙蝠星状病毒以及蝙蝠肝炎病毒。Esona 及其同事于 2010 年首次报道了一株来自非州黄毛果蝠的轮状病毒部分基因组序列，但没有进行病毒的分离培养。本研 究从云南地区采集蝙蝠，进行病毒的宏基因组学研究，结果在芒市的小菊头蝠与勐远县的三叶蹄蝠肠 道组织样品中各分离到一株轮状病毒。1材料和方法1.1 蝙蝠样品 芒市 16 只小菊头蝠 （Rhinolophus hipposideros） 及勐远县 30 只三叶蹄蝠 （Aselliscus stoliczkanus） 用网进行捕捉，然后在当地的疾控中心进行氯化钾静脉注射安乐死，每只蝙蝠收集肺脏和肠道及内容 物，分别冻存与液氮罐中，运送到实验室后冻存于-80℃超低温冰箱中。 病毒宏基因组学分析发现二种 均携带有轮状病毒序列（结果另处发表） 。 1.2 轮状病毒 RT-PCR 方法检测 依据病毒宏基因组学分析获得的轮状病毒序列，利用 Primer 5.0 设计了针对轮状病毒 NSP5 基因 的 PCR 引物，用于上述样品的筛查。每份组织取少许，用 SM 缓冲液（50 mM Tris, 10 mM MgSO 4, 0.1 M NaCl, pH7.5）研磨，然后用 RNeasy Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）在核酸自动提取 仪 QIAcube（Qiagen）上完成 RNA 的提取。利用 1st cDNA synthesis kit（TaKaRa, Dalian, China） 反转录 RNA 为 cDNA，PCR 扩增体系使用 PCR Master Mix（Tiangen, Beijing, China） ，扩增步骤如 下：94℃预变性 30s，54℃退火 30s，72℃延伸 40s，共 40 个循环。PCR 阳性产物测序由 ABI 3730 测 序仪完成（Invitrogen, Beijing, China） 。 1.3 病毒阳性样品分离培养 RT-PCR 检测阳性的肠道组织样品用双无 DMEM（Thermo, Beijing, China）研磨，研磨液 4℃下 12，000g 离心 10 min。上清通过 0.22 μm（Sartorius, G?ttingen, Germany）针头滤器过滤后，加入终 浓度为 20 ug/mL 的胰酶 37℃感作 1h 后接种于铺满单层的 Marc145 细胞。 接毒后的细胞放入 5% CO 2，37℃温箱中吸附 2h，其间每 0.5h 晃动一次细胞。吸附完成后，弃接毒液，换含有 5 ug/mL 胰酶的 双无 DMEM 维持液，放入温箱中继续培养。每天观察接毒细胞是否出现 CPE，连续盲传 5 代，出现 CPE 的细胞培养物收集后冻存于-80℃冰箱。 1.4 病变细胞电镜观察 出现明显 CPE 的 F4 代细胞培养物冻融 3 次后，取 1mL 于 1.5mL 离心管中，12，000g 离心 30 m in，留 50μL 上清将沉淀悬浮，磷钨酸负染后进行电镜观察。 1.5 病毒 RNA PAGE 电泳银染鉴定 细胞培养获得的病毒提取 RNA，经 5%聚丙烯酰胺分离胶电泳 30 min，12%聚丙烯酰胺浓缩胶电 泳 18h 后，进行硝酸银染色。 1.6 VP7、VP4 片段基因系统进化分析为了确定这两株病毒的分型，利用 Primer 5.0 软件设计了针对 VP7 与 VP4 的扩增引物。病毒 cD NA 的获得同上描述，全序列 PCR 扩增使用 Fast HiFidelity PCR Kit（Tiangen） ，扩增产物连接 pZer oBack 载体（Tiangen） ，转化 TOP 10 感受态细胞（Tiangen） ，每个样品最少选取 5 个单克隆由 ABI 3 730 测序仪完成测序（Invitrogen） 。所获得的序列及下载的序列用 Clustal W 法完成比对，由 MEGA 5.0 软件以邻接法（Neighbor-joining）构建进化树，步展值检验（Bootstrap）1000 次重复。2结果2.1 病毒宏基因组学结果及 RT-PCR 方法筛查阳性样品 病毒宏基因组学结果显示，有 100 条序列注释到了轮状病毒的 VP3 基因，同源性为 85%。通过 RT-PCR 方法对蝙蝠组织样品进行筛查，结果在小菊头蝠（1/16）及三叶蹄蝠（1/30）中各检测到一份 阳性肠道样品，分别命名为 MSLH14 和 MYAS33。1172其他动物疫病2.2 病毒的分离与电镜观察 阳性肠道组织研磨物接种 Marc145 后，盲传至第三代 72h 可以观察到轻微的细胞病变。培养至第 四代 72h 即可以观察到明显 CPE，细胞大面积圆缩脱落（图 1B） 。MYAS33 毒株 F4 代培养物冻融三 次后，经焦磷酸负染后，电镜下可以看到典型的轮状病毒样颗粒（图 1C） 。图1分离毒株 F4 代接种细胞 72h 的细胞病变与病毒电镜观察2.3 病毒核酸 PAGE 电泳分型 为了使病毒的 11 个核酸片段尽可能的分开， 浓缩胶电泳时间为 18h， 从银染的结果可以看出所有 条带都已分开， 从图中可以看出两个毒株的核酸电泳分型都为典型的 A 群轮状病毒 4-2-3-2 型 （图略） 。 2.4 VP7 与 VP4 系统进化分析为了确定分离到毒株的基因分型及与其他毒株的亲缘关系，从 GenBank 中下载不同分型的毒株 的 VP7 和 VP4 基因序列。下载的序列与 MLSH14 和 MYAS33 毒株测序获得的序列一起构建系统进 化树（图 2） 。从图中可以看出两个毒株的基因型分别为 G3P[3]与 G3P[10]型。两个毒株的 VP7 基因 的同源性达 89.6%，都是 G3 型，MLSH14 毒株 VP7 基因与一株来自印度的牛轮状病毒同源性最高达 93%，而 MYAS33 毒株 VP7 基因与一株来自阿根廷的马轮状病毒同源性最高达 93%。然而两个毒株 的 VP4 基因差异较大，同源性只有 76.8%。MLSH14 毒株 VP4 基因型为 P[3]型，与来自泰国的一株 人轮状病毒同源性最高达 88%；MYAS33 毒株为 P[10]型，与来自泰国的另一株人轮状病毒同源性最 高达 94.8%。本研究中发现的两株轮状病毒与之前报导的来自肯尼亚的蝙蝠轮状病毒亲缘性较低，V P4 核酸同源性不足 65.1%，VP7 核酸同源性不足 74.5%，为不同的基因型。图2VP7、VP4 基因系统进化分析3讨论MA 104 细胞常用于轮状病毒分离，本研究使用的 Marc145 细胞是从 MA104 细胞克隆而来，故 两种细胞对轮状病毒同样易感。轮状病毒的分离需要胰酶的作用，因为胰酶可以裂解外层衣壳纤突蛋 白 VP4 为膜穿透蛋白 VP5 和血凝素 VP8，VP5 介导病毒吸附细胞。本研究中，接毒前加入终浓度为 20 ug/mL 的胰酶 37℃感作 1h 后，再接种细胞，病毒吸附过程中每隔一段时间晃动一次细胞，最后加 入含有 5ug/mL 胰酶的无血清 DMEM 培养病毒。使用该方法成功的分离到两株蝙蝠轮状病毒 MSLH1 4 和 MYAS33。从蝙蝠体内分离到轮状病毒为全球首次报导。 MSLH14 与 MYAS33 毒株 VP7 基因分型一致，但同源性只有 89.6%，分别与来自印度的牛轮状 病毒和阿根廷的马轮状病毒同源性最高。VP4 基因差异较大，MSLH14 毒株为 P[3]型，而 MYAS33 毒 株为 P[10]型，但与两株病毒 VP4 基因同源性最高的两个序列都是来自泰国的人轮状病毒。轮状病毒 基因组分为 11 个节段，因此不同基因片段的重配经常发生。本研究中分离到病毒的蝙蝠均来自云南1173第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集边境地区，所以推测这两株毒株有可能是不同地区不同宿主的轮状病毒感染蝙蝠后，在蝙蝠体内产生 的新的重配毒株。这两株毒株的起源及致病性等还需要进一步的研究。 轮状病毒感染引起急性重症腹泻，严重威胁儿童的健康。据调查，中国 48%的儿童腹泻是由 RV As 引起的。自 1998 年起，与 WHO 合作的定点医院开始执行人类 RVA 感染的监查，这些调查研究表 明中国人群中流行的主要毒株为 G1P[8]，G3P[4]和 G3P[8]基因型。此外，有证据表明一些人轮状病 毒起源于动物，例如牛、猫、猪、狗等动物的轮状病毒发生种间传播，进一步发生动物-人轮状病毒的 基因片段重组。因此，为了更好的控制及预防人类感染 RVA，调查与监测动物 RVA 流行情况是十分 必要的。 然而， 国内动物 RVA 的监查工作执行的并不系统， 致使动物感染轮状病毒的背景并不清楚。 本研究从蝙蝠体内分离到轮状病毒，突显了蝙蝠作为轮状病毒宿主的潜在作用，具有重要的公共卫生 学意义。参考文献（略）缅甸蝙蝠携带病毒的宏基因组学分析徐琳，何彪，涂长春 （军事医学科学院军事兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春，130122） 摘 要 蝙蝠是许多人兽共患病毒的储存宿主， 并可以将其传播给人类和其他动物。 为了掌握边境地区蝙蝠病毒情况， 防范蝙蝠病毒跨境传播，本研究在邻近中国云南省的缅甸的两个县采集到 816 只蝙蝠，分属 2 个种，然后通过基于 Solexa 高通量测序的病毒宏基因组学技术对蝙蝠组织进行病毒组学研究， 最终获得平均长度为 114 个碱基的读长 （Reads） 3742314 条，并拼接成 1649512 条重叠序列（Contigs） 。通过序列注释发现，2%（26698 条）的重叠序列与病毒相关， 能进一步注释到 24 个病毒科，其中 45%的病毒序列（）系脊椎动物病毒，28%的（）系昆虫病 毒，27%（）的系噬菌体，还有 95 条序列系植物病毒。根据病毒宏基因组学结果，对所有蝙蝠样品进行特 异性的 PCR 或 RT-PCR 扩增鉴定，发现许多新的蝙蝠病毒，包括星状病毒、博卡病毒、圆环病毒、软化病毒，获得了 它们在蝙蝠中的流行情况。本研究旨在了解缅甸蝙蝠携带的病毒组的构成，初步明确了边境地区蝙蝠病毒的生态学， 为防范蝙蝠病毒跨境传播提供了数据，同时也进一步丰富了蝙蝠携带病毒种类。 关键词 病毒宏基因组学；蝙蝠；高通量测序；病毒组1前言蝙蝠属于翼手目（Chiroptera） ，是哺乳动物中仅次于啮齿类的第二大类群，现共包含 19 个科，9 62 个种，除南北两极外全球皆有分布。蝙蝠是许多重要病毒的宿主，从其体内已检测到 130 多种病 毒，其中包括一些对人高致病性的病毒，如亨尼帕病毒（Henipaviruses） 、埃博拉病毒（Ebola virus） 、 马尔堡病毒（Marburg virus） 、登革病毒（Dengue virus） 、狂犬病病毒（Lyssavirus）和 SARS 样冠状 病毒（SARS-like coronavirus）等。最近，Bokeloh 和 Shimoni 蝙蝠病毒、博卡病毒（Bocavirus） 、圆 环病毒（Circovirus） 、呼肠孤病毒（Retrovirus） 、星状病毒（Astrovirus）和松湾病毒（Cedar virus） 作为新病毒在蝙蝠体内发现，表明蝙蝠可能是病毒的巨大储库和繁殖载体。在中国，越来越多的病毒 在蝙蝠体内被检测或分离到，如冠状病毒（Coronavirus） 、圆环病毒、星状病毒、西江病毒（Xi Rive r virus） 、日本脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV） 、基孔肯雅病毒（Chikungunya virus,CHI KV） 、小核糖核酸病毒（Picornavirus）和腺病毒（Adenovirus）等。最引人注目的是引起全球 8000 多 人感染、至少 800 人死亡的 SARS 冠状病毒，其自然宿主很可能是我国携带有 SARS 样冠状病毒（S ARS-like coronavirus）的菊头蝠。然而，迄今为止，尚未完全了解蝙蝠病毒的病原生态学。 近年来，基于第二代测序技术的病毒宏基因组学成为检测动物携带已知或未知病毒的有力工具。 这项技术已成功用于探索海洋、湖泊、各种动物（包括蝙蝠）组织（如肠道和粪便）等环境中的病毒 组结构，无疑为了解上述环境中的病毒多样性开辟了新的途径，并为将来快速检测自然界中的新病毒 提供了成功的范例，同时该技术也用到了蝙蝠病毒的研究，所获得的结果大大拓展了人们对蝙蝠病毒 的认识。 近年来， 东南亚和中国南部地区已发现了多种人兽共患病， 如尼帕病毒、 SARS 样冠状病毒、1174其他动物疫病基孔肯雅病毒、乙脑病毒等，同时由于该地区人口密度高、公共卫生系统发展不完善、野生动物资源 丰富多样以及贸易频繁，使得这些病毒很容易通过载体动物跨境传播。为了掌握我国边境地区蝙蝠病 毒的情况，本研究从毗邻云南省的缅甸地区采集蝙蝠样品，利用病毒宏基因组学方法对其进行病毒组 学研究。结果显示，这些蝙蝠携带的病毒属 24 个科，除脊椎动物病毒外还包括噬菌体、植物病毒、 昆虫病毒。 其中， 发现了多种有意义的新型哺乳动物病毒， 如正嗜肝 DNA 病毒 （Orthohepadnavirus） 、 哺乳动物腺病毒（Mastadenovirus） 、哺乳动物星状病毒（Msmastrovirus）和博卡病毒等。本研究有助 于了解我国边境地区蝙蝠病毒的生态情况，为防范蝙蝠病毒跨境传播提供了数据，同时也丰富了人们 对蝙蝠病毒的的认识。2材料和方法2.1 样品采集 2008 年 10 月和 12 月，从毗邻云南省的缅甸居民区购得新鲜食虫蝙蝠共 816 只，包括亚洲长翼 蝠（Miniopterus fuliginosus） 、马铁菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum） 。其详细地理和数量信息见 表 1。蝙蝠现场解剖后，肠道、肺脏、肝脏等组织分开收集，存放于-20°C。本研究样品的采集和处理 严格按照中国军事医学科学院军事兽医研究所动物福利委员会相关规定执行。表 1 宏基因组学分析获得的蝙蝠种类和病毒检出阳性率 昔董坝县 吴涛县 亚洲长翼蝠 马铁菊头蝠 亚洲长翼蝠 马铁菊头蝠 病毒 n=320 n=92 n=320 n=84 AstV 0 0 12（4%） 2（2%） IfV 0 0 26（8%） 56（18%） CV 0 0 0 6（7%） AdV 0 0 0 1（1%） BoV 0 0 6（2%） 20（6%） AstV：星状病毒；IfV：软化病毒；CV：圆环病毒；AdV：腺病毒；BoV：博卡病毒。n=蝙蝠数量（只） 。2.2 病毒宏基因组学分析 将所有蝙蝠样品根据其采集地和种类分为以下四组：XM（昔董坝县亚洲长翼蝠） 、XO（昔董坝 县马铁菊头蝠） 、WM（吴涛县亚洲长翼蝠）和 WO（吴涛县马铁菊头蝠） 。所有组织样品按照已发表 的方法进行病毒宏基因组学处理。 2.3 病毒验证 根据病毒宏基因组学给出的结果，挑选星状病毒、软化病毒、博卡病毒、腺病毒、圆环病毒以及 正嗜肝病毒进行验证。根据已发表的文献或测序结果，利用 Primer 5（Premier Biosoft Internationa, Palo Alto, CA）和 Genefisher（http://bibiserv. techfak.uni-bielefeld.de/bibi/Tools.html）设计引物，扩增 待鉴定的病毒序列。 所有样品利用 RNA 和 DNA 提取试剂盒 （RNeasy and QIAamp DNA mini kits） 在自动化工作站 QIAcube 上进行核酸提取，然后进行 PCR 检测。病毒 RNA 利用 RT-PCR 或 RT-巢式 PCR 扩增，DNA 直接 PCR，并设置阴性对照以防假阳性结果。核酸扩增所用反应液为天根公司的 P CR Master Mix。阳性 PCR 产物纯化后直接用 ABI 3730 DNA Analyzer（Invitrogen, 中国北京）进 行双向测序。为了或的博卡病毒的全长序列，使用染色体步移试剂盒（Genome Walking Kit, TaKaR a；中国大连）几乎扩增了全基因组序列。 2.4 系统进化分析 测序结果用 Clustal W 软件 （2.0.版本） 同其它已知病毒参考株的核苷酸和氨基酸序列进行比对； 使用 MEGA5 软件邻接法（Neighbor-joining）绘制系统进化树，步展值检验（Bootstrap）设定为 1000 次重复。使用 NCBI ORF Finder（http://www. ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）确定开放阅读框的位 置；利用 Mold Web Server（http://mfold.rna.albany.edu/?q=mfold）预测圆环病毒基因组的二级结构。3结果3.1 病毒宏基因组学结果1175第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集Solexa 测序后，共获得 3742314 条 reads，进一步拼接得到平均长度为 114 碱基的 1649512 条重 叠序列。其中，1569373 条（95%）为未知序列，33501 条（2%）注释到真核生物，19940 条（1%） 注释到细菌， 26698 条 （2%） 为病毒序列。 这些病毒序列可分为 24 个病毒科： 13 个 dsDNA 病毒科， 2 个 ssDNA 病毒科，2 个反转录病毒科，1 个单负链 RNA 病毒科，5 个单正链 RNA 和 1 个 dsRNA 病 毒科。脊椎动物病毒序列最数量多，占病毒序列总数的 45%（） ，可注释到 14 个科：腺病 毒科（Adenoviridae） ，鱼类疱疹病毒科（Alloherpesviridae） ，疱疹病毒科（Herpesviridae） ，乳头瘤病 毒科（Papillomaviridae） ，多瘤病毒科（Polyomaviridae） ，痘病毒科（Poxviridae） ，小双节 RNA 病毒 科（Picobirnaviridae） ，嗜肝 DNA 病毒科（Hepadnaviridae） ，反转录病毒科（Retroviridae） ，圆环病毒 科（Circoviridae） ，细小病毒科（Parvoviridae） ，星状病毒科（Astroviridae） ，黄病毒科（Flaviviridae） 和小 RNA 病毒科（Picornaviridae） 。其次是昆虫病毒序列，占 28%（） ，共 5 个科：杆状病 毒科（Baculoviridae） 、多 DNA 病毒科（Polydnaviridae） 、虹膜病毒科（Iridoviridae） 、软化病毒科浓 核病毒亚科（Iflaviridae Densovirinae） 。噬菌体序列占 27%（） ，共 3 个科：肌病毒科（M yoviridae） 、短尾病毒科（Podoviridae）和管状病毒科（Siphoviridae）植物病毒序列有 95 条，分属 3 个科：雀麦花叶病毒科的黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus，Bromoviridae） 、布尼亚病毒科的番茄斑萎 病毒属（Tospovirus，Bunyaviridae） 、藻 DNA 病毒科的海洋球石藻病毒属和绿藻病毒属（coccolithov irus and chlorovirus，Phycodnaviridae） ，上述植物病毒是首次在蝙蝠体内检测到。 3.2 PCR 验证宏基因组学结果3.2.1 星状病毒（Astrovirus） 哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus）属于星状病毒科（Astroviridae） ，根据 ORF2 可分为 19 个 种。在本研究中，XM 组和 WO 组分别获得哺乳动物星状病毒相关序列 35 条和 22 条。对于蝙蝠肺脏 和肠道样品，通过半套式 PCR 扩增星状病毒 422nt 的 ORF1b 部分片段，分别从 XM 组和 WO 组肠道 样品检出阳性样品 12 个和 2 个。XM 组亚洲长翼蝠（Miniopterus fuliginosus）的阳性率为 4%（12/3 20） 。WO 组马铁菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum）阳性率为 2%（2/84） 。15 条序列中，挑出 8 条 做进一步测序，与 19 个种的哺乳动物星状病毒代表株的同一段序列进行系统进化分析。从昔董坝县 亚洲长翼蝠检测出的 BatAstv XMM137 与香港蝙蝠中发现的哺乳动物星状病毒 14 同源性最高，为 6 9%，根据国际病毒分类委员会新标准，此株病毒为新型哺乳动物星状病毒， 暂命名为哺乳动物星状病 毒相关病毒 1；其他 7 株之间同源性为 68%-76%，是一个新的病毒组，与香港蝙蝠中分离到的星状病 毒 18 同源性最高（67%-75%） ，至少包含一个新的星状病毒种，据国际病毒分类委员会新标准分类为 哺乳动物星状病毒相关病毒 2。 3.2.2 软化病毒（Iflaviruses） 软化病毒科（Iflaviridae）仅包括一个属，即软化病毒属（Iflavirus） ，包括 7 个病毒种。Solexa 测 序数据中，XM 组和 WO 组分别有 191 条和 286 条序列注释到软化病毒科，与软化病毒属的茶尺蠖病 毒（Ectropis obliqua virus，EOV）和榕透翅毒蛾病毒（Perina nudavirus，PNV）有很高的同源性。巢 式 RT-PCR 扩增 369nt 的 3’端片段，以确认 Solexa 的测序结果，检出 WM 组和 XM 组亚洲长翼蝠肠 道样品中软化病毒阳性率分别为 18%（56/320）和 8%（26/320） 。 3.2.3 博卡病毒（Bocavirus） Solexa 测序结果显示 20 条序列注释到博卡病毒（Bocavirus, BoV） 。通过特异 PCR 扩增 VP1 部 分片段，结果发现 XM 组和 WM 组亚洲长翼蝠肠道样品，阳性率分别为 2%（6/320）和 6%（20/32 0） 。 进化分析显示新检测到的博卡病毒与其他已知序列的氨基酸同源性为 39%-53%， 其中与犬细小病 毒最高为 53%； 同中国发现的第一株蝙蝠博卡病毒――鼠耳蝠博卡病毒序列的同源性为 43%。 同时本 研究的 10 条序列可分两个组，之间的氨基酸的同源性最高为 85%，组内最高为 97%。这表明从蝙蝠 体内发现两株新的博卡病毒。为进一步鉴定博卡病毒，利用基因移步法几乎获得组 1 的 Bt BoV XM 30 和组 2 的 Bt BoV WM40 的基因组全长序列。缺少 5’-端的 Bt BoV XM30 和 Bt BoV WM40 全长 分别为 4832nt 和 4995nt，包括四个 ORF：NS1，NP1，VP1 和 VP2。将 NS1 的氨基酸序列与其他参 考序列共同构建系统进化树。 多重比对显示， Bt BoV XM30 和 Bt BoV WM40 氨基酸同源性为 76%； 与其他博卡病毒的氨基酸同源性为 35%-54%（与犬博卡病毒 HK882U 同源性为 54%，与鼠耳蝠博卡 病毒同源性为 40%） ，核苷酸同源性为 44-56%；利用 VP1 做比对，结果相同。 3.2.4 腺病毒（Adenovirus） 腺病毒科（Adenoviridae）成员的宿主范围很广泛，可感染哺乳动物、鸟类、两栖类、爬行类以及 鱼类等， 并能造成各种疾病。 本研究中， 仅 WO 组的一条序列与哺乳动物腺病毒属 （Mastadenovirus）1176其他动物疫病一致。利用 PCR 扩增哺乳动物腺病毒的 Hexon 基因部分片段，来检测蝙蝠肺脏和肠道样品，确定一 份马铁菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum）肠道样品阳性，将其命名为 WOR1。进一步测序和系统 进化分析显示此株蝙蝠腺病毒与现有哺乳动物腺病毒的氨基酸同源性为 40%-55%，与中国天津 TJM 株蝙蝠腺病毒性和德国 PPV1 株蝙蝠腺病毒 2 的氨基酸同源分别为 55%和 53%。这表明 WOR1 为一 株新的哺乳动物腺病毒。 3.2.5 圆环病毒（Circovirus, CV） CV 基因组为环状，长 nt，编码一个复制相关蛋白（Rep） ，反向编码衣壳蛋白（Cap） 。 CV 于 2010 年在美国蝙蝠样品中首次发现。本研究中，Solexa 结果显示仅 XO 组包含 CV 序列，经 P CR 检出 XO 组马铁菊头蝠肠道样品中 CV 阳性率为 7%（6/92） 。利用反向 PCR 扩增 BtCV XOR1 和 BtCV XOR7 这两株病毒的序列全长。测序显示 XOR1 和 XOR7 的基因序列长度分别为 1862nt 和 17 98nt，包含方向相反的两个 ORF。与其它 CV 基因组一样，这两株蝙蝠 CV 的两个 ORF 之间存在一个 茎环结构，九聚物基序为 TAGTATTAC 然而，在 BtCV XOR1 的第 1862 至 26 个核苷酸之间有三个串 联的 CGGCACA 结构，该结构是病毒核酸滚环复制时结合复制酶的位置，与猪圆环病毒-1 和猪圆环 病毒-2（PCV-1 和 PCV-2）具有很高的相似度。BtCV XOR7 的串联结构稍短，为 CGGCAG 六聚体结 构。 基于 Rep 氨基酸的系统进化分析和多重比对显示这两株蝙蝠圆环病毒氨基酸同源性为 44%， 表明 它们属于不同种群。与 XOR1 和 XOR7 同源性最高的分别是 2012 年分离到的纽约犬圆环病毒 NY412 株（44%）和 PCV-1（70%） 。 3.2.6 嗜肝 DNA 病毒（Hepadnavirus） 嗜肝 DNA 病毒科（Hepadnaviridae）成员为环状部分双链基因组，包含两个属：正嗜肝 DNA 病 毒属（Orthohepadnavirus）和禽嗜肝 DNA 病毒属（Avihepadnavirus） ；前者能够感染多种哺乳动物， 包括人类、北美土拨鼠和地松鼠。本研究中，病毒宏基因组学测序得到四个组共有 10000 多条嗜肝 D NA 病毒相关序列，与土拨鼠肝炎病毒（WHV）和乙肝病毒（HBV）核苷酸同源性低于 70%。PCR 扩 增其 S 基因 432bp 的片段，比对发现它们之间核苷酸同源性大于 97%，同 WHV 和 HBV 的核苷酸同 源性分别为 77%和 74%，表明本研究中的蝙蝠嗜肝病毒可能是一种新的正嗜肝 DNA 病毒。4讨论蝙蝠是多种病毒的自然宿主，在病原生态学上具有重要意义。截止到 2006 年，传统的病毒学方 法已在全球范围内发现 60 多种蝙蝠病毒。随着基于第二代测序技术的宏基因组学的诞生，新蝙蝠病 毒的发现频率激增，到目前为止，所发现的蝙蝠病毒已超过 130 种，在短短几年间，发现的蝙蝠病毒 超过 60 种，这堪比以前几十年的工作。本研究应用此技术研究缅甸蝙蝠病毒，发现其携带病毒有脊 椎动物、昆虫、植物和细菌病毒、共 24 个科。序列比对发现了多种蝙蝠携带的新病毒，进一步扩大 了蝙蝠群体中病毒的组成，同时也发现了大量的新蝙蝠病毒。 本研究中，45%的病毒序列注释到脊椎动物病毒，28%的病毒序列注释到昆虫病毒，27%的病毒 序列注释到噬菌体， 而先前的病毒宏基因组学研究中注释到脊椎动物病毒的病毒序列不到 10%。 另外， 在检出的 24 个病毒科里，哺乳动物病毒占 54%（13 个科） ，较之前的病毒宏基因组学研究报道中比 例更高。这些不同点可能归因于我们使用的样品包含了蝙蝠的多种组织器官及肠道内容物，而之前研 究的样品仅仅是粪便或鼻咽拭子。哺乳动物病毒的复制要在宿主细胞内进行，有的通过粪便或口鼻排 出到外界环境中。此外，有些病毒的排出是间歇性的，故从排泄物或分泌物中得到的病毒组并不能代 表宿主体内携带的全部病毒。因此，混合的组织样品更可能提供完整的病毒组资料。例如，嗜肝 DN A 病毒是严格的血液病毒，通常不会通过粪口途径排出，这可能是先前的宏基因组学研究未在蝙蝠体 内检出嗜肝病毒科成员的原因。本研究中嗜肝 DNA 病毒可能来自蝙蝠肝脏。嗜肝 DNA 病毒在缅甸 拥有丰富多样的蝙蝠物种，并与中国云南省共有一条很长分界线，本研究为缅甸蝙蝠病毒组学的研究 提供了初步的数据。吴涛县的蝙蝠样品检出有 23 个科的病毒，无圆环病毒科；昔董县的蝙蝠样品检 出 17 个科的病毒，显示出这两县病毒组的多样性且存在差异。PCR 和 RT-PCR 检测结果显示亚洲长 翼蝠（Miniopterus fuliginosus）和马铁菊头蝠（Rhinolophus ferrumequinum）样品能够检出上述六种 病毒。这两种蝙蝠携带病毒亦有区别：亚洲长翼蝠携带星状病毒、软化病毒、嗜肝 DNA 病毒和博卡 病毒，而马铁菊头蝠携带星状病毒、圆环病毒、腺病毒和腺联病毒，表明两种蝙蝠都存在病毒共感染 现象。另外，即使是同一种蝙蝠，采集自不同地区的病毒组成也相异。例如采集自昔董县的亚洲长翼 蝠携带星状病毒，而吴涛县的则无；昔董县的马铁菊头蝠仅携带有圆环病毒，而吴涛县的携带星状病 毒、腺病毒和腺联病毒。这些数据显示蝙蝠病毒组随着蝙蝠物种和地理分布的不同而不同，可看出蝙1177第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集蝠群体的病毒组成复杂。 此次缅甸蝙蝠样品中检出的星状病毒、腺联病毒、腺病毒和圆环病毒序列同样在北美和中国蝙蝠 病毒组中检测到，表明它们是不同地区蝙蝠的共有病毒。例如，中国的菊头蝠属三个种（菲菊头蝠、 大菊头蝠、马铁菊头蝠）被发现携带圆环病毒，同本研究结果一致。另外，中国的折翼蝠和中华菊头 蝠被发现携带有星状病毒，同样在本研究中缅甸的亚洲长翼蝠和马铁菊头蝠中检测到。 本研究的病毒宏基因组学处理所用的样品包含从胃到肛门的整个消化道及其内容物， 因此也能发 现昆虫病毒，这反映出蝙蝠的食谱。研究发现，感染茶尺蠖和榕透翅毒蛾的软化病毒只在 XM 组和 W M 组的亚洲长翼蝠中发现， 表明此蝙蝠经常以这些昆虫为食。 同时因为蝙蝠捕食的昆虫又以植物为食， 因此植物病毒也在本研究中被发现，这也反映出了自然界的食物链，并且植物病毒也曾在北美和中国 的蝙蝠粪便中被检测到。 嗜肝 DNA 病毒科成员的宿主谱较窄，能够感染啮齿类、灵长类和鸟类，但从未报道在蝙蝠中检 出过。本次分析数据显示嗜肝 DNA 病毒相关序列是第二大类，并与鼠肝炎病毒（WHV）和乙肝病毒 （HBV） 有遗传相似性。 S 基因部分片段的 PCR 扩增和测序显示蝙蝠肝炎病毒与鼠肝炎病毒 （WHV） 和乙肝病毒（HBV）的同源性低于 80%，暗示其为一种新的正嗜肝 DNA 病毒科病毒。圆环病毒科有 圆环病毒属（Circovirus）和圆圈病毒属（Gyrovirus）两个属，宿主范围广泛。圆环病毒是重要的猪病 病原体，对养猪业具有很大影响，也能导致禽类的免疫抑制和生长阻滞。北美蝙蝠粪便的病毒宏基因 组分析首次在蝙蝠体内发现圆环病毒。此后，蝙蝠体内经常检出圆环病毒并有很大的遗传多样性[9,10,3 5] 。此次检出的 BtCV XOR1 与已知圆环病毒序列的氨基酸同源性低于 60%，依据 ICTV 圆环病毒新 种判定标准，可将其认定为一种新的圆环病毒。 博卡病毒属（Bocavirus）仅有两个种，种间序列同源性为 43%。动物博卡病毒能够导致呼吸性、 胃肠道和生殖疾病。人类博卡病毒首次报道于 2005 年的瑞典，随后 2006 年在中国也有报道，并与呼 吸道感染和胃肠道疾病有关。2012 年，Wu 等首次报道博卡病毒在鼠耳蝠中出现。本研究将博卡病毒 的存在范围扩大到了缅甸的亚洲长翼蝠。 序列分析发现缅甸分离株与犬细小病毒的氨基酸同源性最高 （53%） ，与鼠耳蝠博卡病毒氨基酸同源性仅为 43%，全基因组比对得到了相同的结果。依据 ICTV 判 定标准，Bt BoV XM30 和 WM40 可定义为博卡病毒属的新种。星状病毒科包括禽类星状病毒属（A vastrovirus）和哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirus） ，是很重要的病原体，通常导致人类和许多动物 （包括家畜、家禽、宠物、被毛动物和海洋生物）的急性胃肠炎。蝙蝠星状病毒首次报道于 2008 年， 并且在 2009 年版的 ICTV 分类报告中， 哺乳动物星状病毒包括 6 个种， 然而两年后的 2011 年版报告， 哺乳动物星状病毒就扩大到了 19 种，其中 7 种与蝙蝠有关，这说明蝙蝠病毒发现之快，同时蝙蝠携 带的病毒具有复杂的多样性。 本研究发现了更多新的蝙蝠星状病毒， 与现有的 19 种星状病毒皆不同， 可能为哺乳动物星状病毒属的新种。 本研究利用基于 Solexa 测序技术的病毒宏基因组学分析蝙蝠组织样品，并辅以 PCR 验证，获得 的缅甸蝙蝠病毒组包含多种新的哺乳动物病毒。比较发现，蝙蝠的病毒组随地理位置和蝙蝠种类的不 同而不同。 未来对更多地区的更多蝙蝠种类的病毒组研究必将加深我们对蝙蝠病毒生态多样性的了解。 然而， 尽管越来越多的新蝙蝠病毒被发现，但其对人和其他动物的致病性尚不明确，这还需要后续的大量工 作来研究。参考文献（略）中国藏羚羊暴发致死性山羊传染性胸膜肺炎疫情于志君 1,3，王铁成 1，孙贺廷 1，夏志平 1，初冬 2，徐钰 2，赵永坤 1，杨松涛 1，黄耕 1，高玉伟 1，夏咸柱 1* （1. 军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春，. 国家林业局野生动物疫源疫病监测总站，辽宁沈阳， . 北京协和医学院，中国医学科学院医学实验动物研究所，北京，100021） 摘 要 山羊传染性胸膜肺炎是由山羊支原体山羊肺炎亚种（Mccp）引起的一种严重的山羊呼吸道疾病。山羊支原体 1178其他动物疫病 山羊肺炎亚种是丝状支原体群（M. mycoides cluster）的一员。山羊支原体山羊肺炎亚种可引起家畜大量死亡，死亡率 和发病率分别高达 60%和 90%。我们报道一起在中国藏羚羊群中暴发的一起山羊传染性胸膜肺炎疫情。 关键词 藏羚羊；山羊支原体山羊肺炎亚种；山羊传染性胸膜肺炎世界自然保护联盟（IUCN）将藏羚羊定义为濒危物种。据估计，藏羚羊的数量约为 15 万只。藏 羚羊主要生活在中国青海和西藏地区海拔 3700 米至海拔 5500 米的高原上。 西藏那曲地区共生活有 15000 只藏羚羊，而 2012 年 9 月到 2012 年 12 月之间，该地区约有 2400 只藏羚羊突然死亡，占生活在该地区的藏羚羊群体数量的 16%。我们随后对该地区申扎、双湖和尼玛 三个区域的 13 只死亡藏羚羊进行了尸检（表 1） 。死亡藏羚羊的眼观病理损伤包括严重的胸膜肺炎和 肺部部分肝样病变（图 1-A） ，部分死亡藏羚羊的肺部出现小叶间隔膜增厚、胸膜炎和稻草色胸膜积 液，并有胸膜渗出物凝固形成一层胶状物覆盖在其肺部表面（图 1-B） 。 选取 5 只死亡藏羚羊的肺组织样品进行组织学检查。 其中 4 只藏羚羊的肺组织样品出现带有浆液 纤维素性液体的纤维素性肺炎和炎症细胞浸润等病理变化，肺泡（图 1-C）和细支气管（图 1-D）中 充满淋巴细胞。另外 1 只藏羚羊的肺组织样品出现带有肺泡蛋白积液的肺水肿。 将 13 只死亡藏羚羊的肺组织剪碎后接种改良的 Hayflick’s 肉汤，该肉汤广泛用于从动物中分离 支原体。将培养物置于在 37℃、5%CO2 条件下进行培养。每日比较接种肉汤和未接种肉汤的变化。 以适度的浊度、 颜色从粉红色变成黄色和当摇晃培养物时出现明显的漩涡来作为评价支原体生长的指 标。经过 2-3 次连续传代，13 份藏羚羊肺脏样品中有 11 份能够观察到支原体生长。电镜观察表明， 这 11 份阳性生长培养物中均存在支原体样颗粒（图 2-B） 。上述实验结果说明，支原体感染可能是此 次藏羚羊疫情的病因。 随后，通过特异性引物和聚合酶链式反应（PCR）对 13 份藏羚羊肺脏样品进行检测，以排除丝状 支原体群（M. mycoides cluster）和牛支原体（M. bovis） 。经检测，13 份藏羚羊肺脏样品中有 11 份 显示山羊支原体山羊肺炎亚种阳性，未检测到其它类型的支原体（表 1 和表 2） 。接着，将山羊支原体 山羊肺炎亚种 arcD 基因作为 PCR 检测的靶标，并按照先前文献描述的条件进行扩增（35 个循环：9 4 摄氏度 30 秒， 47 摄氏度 15 秒，72 摄氏度 15 秒） 。 结果发现， 显示出肺水肿的肺组织样品 SH7 号， 其 PCR 检测结果和组织培养结果均为阴性。另外，还通过聚合酶链式反应（PCR）和反转录-聚合酶 链式反应（RT-PCR）的方法来检测 13 份死亡藏羚羊肺组织样品中是否存在其它 16 种潜在的病原体 （表 1 和表 2） 。结果显示，除了山羊支原体山羊肺炎亚种外，并没有其它病原体被检出。 为了评估从感染藏羚羊体内分离出的山羊支原体山羊肺炎亚种分离株与先前分离的山羊支原体 山羊肺炎亚种分离株及亲缘关系最近的山羊支原体山羊亚种之间的关系，我们根据 Lorenzon 的报道 分析了从感染藏羚羊分离出的山羊支原体山羊肺炎亚种株的 H2 基因的 562 个碱基对片段。 结果发现， 藏羚羊山羊支原体山羊肺炎亚种分离株的 H2 基因部分序列（Genbank 登录号：KC441725）与其它山 羊支原体山羊肺炎亚种株之间有较高的序列相似性 （99.3-99.7%） ， 而与山羊支原体山羊亚种分离株之 间的序列相似性则较低（90.2-91.2%） 。遗传进化分析证明，藏羚羊山羊支原体山羊肺炎亚种分离株与 先前在非洲和亚洲分离的山羊支原体山羊肺炎亚种株属于同一进化分支（图 3） 。 近年来，濒危藏羚羊的栖息地在不停的变化，这样的变化可能会提高藏羚羊与山羊支原体山羊肺 炎亚种的接触几率， 导致类似此次报道这样的致死性疫情的暴发。 在藏羚羊的栖息地， 即海拔 4300 米 至 5000 米的草地上，有山羊和绵羊被放牧。山羊是山羊支原体山羊肺炎亚种的重要储存库，另外， 从与山羊混合放牧的绵羊体内也曾分离到山羊支原体山羊肺炎亚种。 铁路轨道横跨藏羚羊栖息地的牧 场，限制了藏羚羊群体的正常迁徙。该地区的山羊、绵羊和藏羚羊之间的接触，再加上人类对牧场的 侵害，可能会提高疾病发生和传播风险。 我们的实验结果表明，山羊传染性胸膜肺炎可能会对濒危藏羚羊群体构成威胁。对藏羚羊群体以 及家养山羊、 野生山羊和绵羊这些与藏羚羊密切接触的物种中山羊支原体山羊肺炎亚种感染情况进行 监控，可能有助于解决这一威胁。 （此文章已投稿 SCI 期刊“Emerging Infectious Diseases” ，并已被接 收）表1 Sample SZM1 Locality* Shenzha GPS position N30°54.777′ E08°21.170′ 死亡藏羚羊组织病理学观察和病原学检测结果 Gender F Age （years） 5 1179 Histopathologic changes FP? Mccp isolation PCR or RT-PCR Detection? 16 Additional Mccp pathogens# + -第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集 N30°54.776′ E08°21.167′ ND? N31°58.591′ E087°27.822′ N31°58.169′ E087°28.435′ N32°00.173′ E087°29.028′ N31°58.583′ E087°27.825′ N31°58.583′ E087°27.825′ ND N31°58.256′ E087°22.439′ ND N31°58.256′ E087°22.439′ N31°57.492′ E087°22 164′SZM2 SH1 SH2 SH3 SH4 SH5 SH6 SH7 NM2 NM3 NM4 NM5Shenzha Shuanghu Shuanghu Shuanghu Shuanghu Shuanghu Shuanghu Shuanghu Nima Nima Nima NimaF F M M M F F F F F F F 表24 5 6 7 3 4 7 9 3 6 5 4FP ND ND FP FP ND ND SP§+ + + + + + + + + + --ND ND ND ND病原体检测引物 Primers（5’→3’） BTV-251-F: TCGCTGCCATGCTATCCG BTV-251-R: CGTACGATGCGAATGCAG IS111F1-485-F: TACTGGGTGTTGATATTGC IS111F1-485-R: CCGTTTCATCCGCGGTG MVV-87-F: GAGGGATCAAGGATAAAAATGG MVV-87-R: GGTATCGYTGCAGYAACAT CAEV-296-F: CAAGCAGCAGGAGGAGAAGCTG CAEV-296-R:TCCTACCCCCATAATTTGATCCAC CPA-402-F: GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG CPA-402-R: CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC C70/B37-1505-F: AGAGTTTGATYMTGGC C70/B37-1505-R: TACGGYTACCTTGTTACGA FMD-ARS4-F: ACCAACCTCCTTGATGTGGCT FMD-NK61-R: GACATGTCCTCCTGCATCTG RPV-237-P1: ACAAACCNAGGATTGCTGAAATGAT RPV-237-P2: CTGAAYTTGTTCTGAAYTGAGTTCT RspV1/ MR2-739-F: GATCAGGAACTCTTAAAGGC RspV1/ MR2-739-R: TTTTCCCGACCCCTTCTAT Vsp-F: TGCTATTCATTTCTTTGTAGTATTTTATGT Vsp-R: TTTATTTCCTTTACCAATTACATATATTCG 7500bp1L: GTTGGTTTTGGATCAACTGG 3480bp-R: TCTGATTTAGTTGGATTGAGTTCA MMC2-L：CAATCCAGATCATAAAAAACCT MMC1-R: CTCCTCATATTCCCCTAGAA MCCPL1-L: AGACCCAAATAAGCCATCCA MCCPL1-R: CTTTCACCGCTTGTTGAATG SC3NEST1-L: ACAAAAAGAAGATATGGTGTTGG SC3NEST1-R: ATCAGGTTTATCCATTGGTTGG Mccp-spe-F: ATCATTTTTAATCCCTTCAAG Mccp-spe-R: TACTATGAGTAATTATAATATATGCAA LMFI: TGAACGGAATATGTTAGCTT LMRI: GACTTCATCCTGCACTCTGT m-h2a:CGGGGATCCGGTATTGTTGTTGGAAGT m-h2b:CGGGTCGACGCTCCATCAAACATAGATPathogen Bluetongue virus Coxiella burnetii Maedi-visna virus Goat arthritis encephalitis virus Clostridium welchii Pasteurella spp. Foot and mouth disease virus Rinderpest virus Bovine parainfluenza virus 3 Mycoplasma bovis Mycoplasma leachii Mycoplasma mycoides subsp. mycodies large colony type and Mycoplasma mycoides subsp. Capri Mycoplasma capricolum subsp. Capricolum Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony type Mycoplasma capricolum subspecies capripneumoniae Mycoplasma ovipneumoniae H2 gene partial of Mycoplasma capricolum subspecies capripneumoniae1180其他动物疫病图1病死臧玲羊肺脏眼观病变和组织病理变化图片图2山羊支原体山羊肺炎亚种颗粒电镜照片图3山羊支原体山羊肺炎亚种和山羊支原体山羊亚种遗传进化树1181第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集合肥市宠物犬与犬粮携带沙门氏菌情况调查及耐药性研究王元兰，刘军军，陆萍，姚明，孙裴，魏建忠，李郁* （安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥，230036） 摘 要 为了解合肥市宠物犬和犬粮携带沙门氏菌情况，分离菌株的药物敏感性和耐药基因携带情况，本研究利用常 规法和 PCR 技术，对 746 份宠物犬肛棉拭子和 404 份犬粮样品进行沙门氏菌分离鉴定，凝集试验和 K-B 法确定分离 菌株的血清型和耐药表型， PCR 方法检测耐药基因， 同时结合表型确证试验鉴定产超广谱 β-内酰胺酶 （ESBLs） 菌株。 结果显示，合肥市宠物犬和犬粮中沙门氏菌的携带率分别 2.55%（19/746）和 2.48%（10/404） ，优势血清型分别为肠炎 沙门氏菌和德尔卑沙门氏菌；29 株沙门氏菌对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林耐药性最强，多重耐药谱为 AMC-AMPSXT-DOX；耐药基因以 strA-B 基因的检出率最高，检出率为 37.93%；共鉴定出 6 株产 ESBLs 菌株。结果表明，合肥 市宠物犬和犬粮中不同程度的携带沙门氏菌，分离菌株耐药性严重，且出现了产 ESBLs 菌株。 关键词 宠物犬；犬粮；沙门氏菌；耐药性；耐药基因沙门氏菌（Salmonella）是一种重要的人兽共患病原菌，在自然界中具有极其广泛的动物宿主。 随着人类文明进程的发展和生活水平的不断提高，人类与动物的关系越来越密切，许多人将各种小动 物（尤其是犬）作为宠物饲养与观赏，不仅带动了犬粮的产销，而且也增加了沙门氏菌由犬-人类、犬 粮-犬、犬-犬等的传播机会，进而扩大沙门氏菌蔓延的可能性。由于临床上存在着长期乱用或滥用抗 生素等不正确的用药方式，以及动物饲料中抗生素添加剂的使用，导致沙门氏菌逐渐产生耐药性，且 日趋严重。 沙门氏菌耐药性的出现和传播与耐药基因通过耐药质粒或染色体在菌群间的广泛传递或扩 散有关。同时，耐药沙门氏菌可在犬粮与犬、犬与犬、犬与人类之间进行传播，从而给临床上防治人 类和动物沙门氏菌病带来了一定的困难。 本研究采用常规法结合 PCR 技术对来自合肥市宠物犬肛拭子和犬粮样品进行沙门氏菌分离鉴定， 凝集试验确定分离株的血清型，纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer）检测其耐药性，结合表型确证试验鉴 定产 EBSLs 菌株，并应用 PCR 技术检测分离菌株的耐药基因携带情况。旨在了解宠物犬和犬粮中沙 门氏菌的携带/污染状况，以及分离菌株的耐药性现状，从而为科学合理使用抗生素，有效防治沙门氏 菌病提供理论依据和技术支撑，在医学、兽医学和公共卫生方面均具有重要意义。1材料与方法1.1 样品来源 于 2010 年 12 月-2012 年 9 月采集样品共 1150 份，其中 746 份犬肛棉拭子样品来自合肥市 10 家 宠物医院就诊病犬、2 个宠物犬养殖场的健康犬，404 份犬粮样品来自合肥市 55 家宠物医院和宠物 店。 1.2 质控菌株 沙门氏菌阳性菌株由安徽农业大学动物传染病实验室保存，大肠杆菌标准菌株 CMCC44113 购自 中国药品生物制品检定所。 1.3 主要试剂 缓冲蛋白胨水（BPW） 、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC） 、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB） 、亚硫酸 铋琼脂（BS） 、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂（XLD） 、胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB） 、三糖铁琼脂（T SI） 、 LB 培养基均购自绍兴天恒生物科技有限公司。 10×PCR Buffer （含 Mg2+） 、 dNTPs （2.5 mol/L） 、 Taq DNA 聚合酶（5 U/μL） 、DNA Marker I、6×Glycerol DNA Loading Buffer 均购自天根生化科技 有限公司；沙门氏菌属诊断血清购自宁波天润生物药业有限公司。 1.4 抗生素药敏试验纸片 24 种抗生素阿莫西林/克拉维酸（AMC） 、头孢唑啉（CFZ） 、头孢他啶（RAD） 、头孢吡肟（FE P） 、头孢哌酮（CFP） 、头孢西丁（FOX） 、头孢呋辛（CXM） 、头孢曲松（CRO） 、氨苄西林（AMP） 、 丁胺卡那（AMK） 、庆大霉素（GM） 、复方新诺明（SXT） 、链霉素（STR） 、强力霉素（DOX） 、四环1182其他动物疫病素（TXT） 、氟苯尼考（FLO） 、左旋氧氟沙星（LVF） 、诺氟沙星（NOR） 、恩诺沙星（ENR） 、磷霉素 （FOM） 、头孢噻肟（CTX） 、头孢噻肟/克拉维酸（CTA/CLA） 、头孢他啶（CAZ） 、头孢他啶/克拉维 酸（CAZ/CLA） ，均购绍兴天恒生物科技有限公司。 1.5 沙门氏菌的分离培养 犬肛棉拭子样品中沙门氏菌的分离参照文献[1]进行， 犬粮中沙门氏菌的分离按 GB0 进 行，符合沙门氏菌属特征的菌株进行 PCR 鉴定。 1.6 沙门氏菌分离株 PCR 鉴定 参考文献[1]进行。 1.7 沙门氏菌分离株的血清型鉴定 按照沙门氏菌属诊断血清说明书进行。 1.8 沙门氏菌分离株的药敏试验 采用纸片琼脂扩散法（Kirby-Bauer）进行药敏试验，根据美国临床和实验室标准化研究所（CLS I）2012 版[2]执行标准判定结果。 1.9 沙门氏菌分离株的耐药基因检测 1.9.1 引物的选择 参考文献[3-4]合成检测 6 大类 32 种耐药基因的引物。 1.9.2 沙门氏菌基因组总 DNA 提取 热裂解法。 1.9.3 四环素类耐药基因 PCR 扩增 反应体系为：10×PCR Buffer 3.0 μL，dNTPs 2.0 μL，上下游引物各 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶 0.25 μL，DNA 模板 1.5 μL，ddH2O 16.25 μL，总共 25 μL。反应条件：扩增循环参数为：95℃预变 性 10 min；94℃变性 30 s，60℃退火 40 s，72℃延伸 60s，共 35 个循环；72℃延伸 10 min。 1.9.4 氯霉素类耐药基因 PCR 扩增 反应体系同上。反应条件：扩增循环参数为：95℃预变性 5 min；94℃变性 40 s，60℃退火 60 s，72℃延伸 90 s，共 35 个循环；72℃延伸 10 min。 1.9.5 氨基糖苷类耐药基因 PCR 扩增 反应体系同上。反应条件：扩增循环参数为：95℃预变性 10 min；94℃变性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 1 min，共 35 个循环；72℃延伸 10 min。 1.9.6 喹诺酮类耐药基因 PCR 扩增 反应体系同上。反应条件：扩增循环参数为：95℃预变性 10 min；94℃变性 30 s， （qnrA 55℃退 火 30 s，qnrB 58℃退火 30 s，qnrS 58℃退火 30 s，qepA 68℃退火 30 s） ，72℃延伸 1 min，共 35 个循环；72℃延伸 10 min。 1.9.7 磺胺类耐药基因 PCR 扩增 反应体系同上。反应条件：扩增循环参数为：95℃预变性 10 min；94℃变性 30 s， （sul1 62℃退 火 30 s，sul2、sul3 60℃退火 30 s） ，72℃延伸 1 min，共 35 个循环；72℃延伸 10 min。 1.9.8 β-内酰胺类耐药基因 PCR 扩增 反应体系同上。反应条件：扩增循环参数为：95℃预变性 10 min；94℃变性 30 s， （blaTEM、bla PSE 60℃退火 40 s，blaSHV 64℃退火 30 s，blaCTX-M-1 群、blaCTX-M-2 群、blaCTX-M-9 群 60℃退火 30 s，blaCY ，72℃延伸 1 min，共 35 个循环；72℃延伸 10 min。 M/LAT 群、blaCYM/MOX 群 62℃退火 30 s） 1.9.9 PCR 产物分析 取 7 ?L PCR 扩增产物与 1 ?L 6×Glycerol DNA Loading buffer 混匀，以 100 V 电压电泳 30 m in 后，于凝胶紫外成像系统观察结果。 1.10 1.10.1 沙门氏菌产超广谱 β-内酰胺酶（ESBLs）分析 ESBLs 菌株表型筛选及确证试验1183第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集选取耐药谱较广的菌株进行 ESBLs 检测的表型筛选与确证试验，按 CLSI 标准方法[2]进行。 1.10.2 序列测定与分析 参照文献[5]进行 PCR 产物的纯化、连接、转化，转化成功的菌液送至上海生工生物科技有限公 司测序，并进行同源序列比对。2结果2.1 合肥市宠物犬和市售犬粮携带沙门氏菌情况 对 1150 份样品进行检测，共分离到沙门氏菌 29 株。其中，10 家宠物医院和 2 个宠物犬养殖场被 检犬肛棉拭子样品共计 746 份，检出沙门氏菌阳性样品 19 份，阳性率为 2.55%（19/746） 。55 家宠物 医院和宠物店被检犬粮样品共计 404 份， 检出沙门氏菌阳性样品 10 份 （包括 3 份试用装， 7 份散装） ， 阳性率为 2.48%（10/404） 。见图 1。图 1 29 株沙门氏菌 PCR 产物电泳图 20，32：阳性对照；21，33：阴性对照；1-19，22-31：沙门氏菌检测阳性株；M：DNA Marker I2.2 沙门氏菌分离株的血清学分型 在 29 株沙门氏菌分离株中，源自犬肛棉拭子样品的 19 株沙门氏菌血清型以肠炎沙门氏菌为优 势，而源自犬粮样品的 10 株沙门氏菌血清型以德尔卑沙门氏菌为优势，见表 1、2。表1 来源 19 株沙门氏菌血清型分布 血清型 肠炎沙门氏菌 德尔卑沙门氏菌 彻斯特沙门氏菌 汤卜逊沙门氏菌 布利丹沙门氏菌 布伦登卢普沙门氏菌 印第安纳沙门氏菌 B 群，4:i:B 群，4:z,r:1,2,3,5,7 A~F+ 10 株沙门氏菌血清型分布 血清型 德尔卑沙门氏菌 肠炎沙门氏菌 布伦登卢普沙门氏菌 B 群，4:z:E1 群，10:-:菌株编号 G2、G4、G5、G6、G9、G10、G11 G7、G16、G18 G12、G15 G13 G14 G1 G17 G19 G8 G3犬肛棉拭子样品表2 来源犬粮样品菌株编号 S2、S3、S4、S5、S7 S1 S6 S8、S10 S92.3 沙门氏菌分离株的药敏试验 29 株沙门氏菌分离株对头孢西丁和磷霉素均敏感， 对阿莫西林/克拉维酸、 氨苄西林耐药性最强， 耐药率均为 27.59%（10/29） ，见表 3。在 10 株耐药沙门氏菌中，具有多重耐药性的菌株占 90%（9/1 0） ，最常见的多重耐药谱为 AMC-AMP-SXT-DOX，见表 4。1184其他动物疫病 表3 抗生素种类 阿莫西林/克拉维酸（AMC） 先锋Ⅴ（CFZ） 先锋Ⅵ（RAD） 丁胺卡那（AMK） 庆大霉素（GEN） 氨苄西林（AMP） 复方新诺明（SXT） 链霉素（STR） 左氧氟沙星（LEV） 强力霉素（DOX） 氟苯尼考（FLO） 诺氟沙星（NOR） 恩诺沙星（ENR） 磷霉素（FOM） 四环素（TXT） 头孢吡肟（FEP） 头孢哌酮（CFP） 头孢西丁（FOX） 头孢呋辛（CXM） 头孢曲松（CRO） 29 株沙门氏菌分离株对 20 种抗生素的感受性分布 药物感受性 耐药菌株 耐药率 中等敏感菌 中等敏感率 数 （%） 株数 （%） 8 27.59 0 0 4 13.79 0 0 4 13.79 12 41.38 4 13.79 0 0 5 17.24 0 0 8 27.59 0 0 7 24.14 1 3.45 7 24.14 0 0 1 3.45 0 0 7 24.14 11 37.93 5 17.24 1 3.45 1 3.45 2 6.90 2 6.90 6 20.69 0 0 0 0 6 20.69 2 6.90 3 10.34 1 3.45 5 17.24 1 3.45 0 0 0 0 4 13.79 0 0 4 13.79 0 0敏感菌株数 21 25 13 25 24 21 21 22 28 11 23 26 21 29 21 25 23 29 25 25敏感率 （%） 72.41 86.21 44.83 86.21 82.76 72.41 72.41 75.86 96.55 37.93 79.31 89.65 72.41 100 72.41 86.21 79.31 100 86.21 86.21菌株编号 G7 S7 G6 G2 G16 G19 S8、S10 G8 G1710 株沙门氏菌分离株的多重耐药谱测定结果 抗生素缩写 DOX SXT-STR-TET AMC-AMP-STR AMC-AMP-STR-CFP AMC-AMP-SXT-STR-DOX-TET AMC-GEN-AMP-SXT-DOX-FLO AMC-CFZ-RAD-AMK-GEN-AMP-SXT-STR-DOX-FLO-TET-FEP-CFP-CXM-CRO AMC-CFZ-RAD-AMK-GEN-AMP-SXT-LEV-DOX-FLO-NOR-ENR-TET-CFP-CXM-CRO AMC-CFZ-RAD-AMK-GEN-AMP-SXT-STR-DOX-FLO-ENR-TET-FEP-CFP-CXM-CRO表42.4 沙门氏菌分离株的耐药基因检测 对 29 株沙门氏菌分离株进行 32 种耐药基因检测，共检出 16 种耐药基因，其中 strA-B 基因的检 出率最高，为 37.93%（11/29） ，其次为 blaPSE、tetB、sul1、flor、sul2、aacc4、tetA、aadA2、blaTEM、 aac（3）-Ia、blaCTX-M-1 群、tetG、aadA1、aph3-IIa、sul3，见表 5。表5 菌株编号 No. of strains G3 S3、S4、S9、G1、G4、S6 S5、G13 S7 S8 S10 G2 G6 G7 G8 G14 G15 G16 29 株沙门氏菌耐药基因的检测结果 检出耐药基因 Resistance genes blaPSE strA-B blaPSE、strA-B sul1、tetB、flor、aadA1、aadA2、aac（3）-Ia sul1、tetA、tetB、flor、aacc4、aadA2 blaPSE、blaCTX-M-1 群、sul1、sul2、tetA、tetB、flor、aacc4、aadA2 blaPSE、blaTEM blaPSE、blaTEM、sul2、strA-B blaPSE、tetB、tetG blaPSE、sul1、sul2、tetA、tetB、flor、aacc4、strA-B aacc4 sul2 blaPSE、blaTEM、sul1、tetA、tetB 1185第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集 G17 G19 blaCTX-M-1 群、sul1、sul2、tetA、tetB、flor、aacc4 blaPSE、sul1、sul2、sul3、tetB、flor、aacc4、aac（3）-Ia、aph3-Ⅱa、strA-B2.5 产超广谱 β-内酰胺酶（ESBLs）菌株试验 经表型确证试验及测序结果显示，编号为 S8、S10、G2、G6、G16、G17 共 6 株菌株为产 ESBL s 菌株。3讨论3.1 合肥市宠物犬携带沙门氏菌状况 本研究在安徽省首次进行宠物犬沙门氏菌调查，共无菌采集犬肛棉拭子样品 746 份，沙门氏菌检 出率为 2.55%（19/746） ，主要以肠炎沙门氏菌为主，其次为德尔卑沙门氏菌。廖志伟等（2008）对台 湾中部地区流浪犬及家犬进行沙门氏菌调查， 分离率分别为 16.0%和 7.4%， 以肠炎沙门氏菌及纽波特 沙门氏菌为主。肠炎沙门氏菌是一种常见而且重要的沙门氏菌，该病菌不仅引起多种动物的急性胃肠 炎，而且是人类食物中毒的主要元凶，应引起人们的关注。 健康犬可能曾沙门氏菌隐形感染而未发病，或曾感染并发病后成为带菌者，会不断向外界排菌， 对于长期与犬密切接触的人类是一个很大的威胁。犬感染沙门氏菌的途径有很多，可能进食被沙门氏 菌污染的水、 饲料或其他食物， 也可经过伤口感染， 甚至是由于人类感染沙门氏菌后将细菌传染给犬， 引起犬和人共同发病，从而在犬和人类之间形成一个循环的感染过程，在公共卫生方面危害极大。 3.2 合肥市犬粮污染沙门氏菌状况 本研究对合肥市犬粮进行沙门氏菌的分离鉴定，共检测样品 404 份，检出率为 2.48%（10/404） ， 以德尔卑沙门氏菌为主。 沙门氏菌在原料选择、 生产加工、 运输储藏乃至销售过程都有可能污染犬粮。 10 份阳性样品包括 3 份独立未开封包装和 7 份散装饲料，散装样品检出明显比独立包装检出多。3 份 阳性独立包装样品中，有两份样品采集自不同时间、不同地点，但为同一品牌的相同类型产品，且批 号相同。可见，在生产过程中，犬粮已被沙门氏菌污染。这提示我们，在犬粮加工过程中对沙门氏菌 进行有效防控是十分必要的，应从源头做到沙门氏菌零污染。在进行散装样品无菌采样中发现，大多 散装犬粮都是成袋聚集堆放，饲料袋口未封紧或直接敞开，将犬粮长期暴露在空气中，这无疑增加了 被沙门氏菌污染的可能性。加强对饲料中沙门氏菌污染的控制，不仅是减少犬发病的需要，也是减少 人类感染沙门氏菌的一项重要措施，在公共卫生方面具有重要的意义。国际标准、国家标准均明确规 定饲料中不得检出沙门氏菌，可见在合肥市场上销售的犬粮卫生安全已是一个不容忽视的问题，应引 起饲料及兽医检疫相关部门的重视。 3.3 沙门氏菌分离株的耐药性状况 药敏试验结果显示，所有菌株对头孢西丁和磷霉素均敏感，对阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林耐药 性最强。在 10 株具有不同程度耐药性的沙门氏菌株中，分离自饲料的 3 株沙门氏菌 S8 和 S10 均对 1 5 种相同的抗生素耐药， 比 S7 耐药谱广， 原因可能是由于人或犬沙门氏菌之间的耐药性传播引起的； 分离自犬的 7 株沙门氏菌 G8 和 G17 耐药谱最广，均对 16 种抗生素耐药，这可能与临床上对犬长期 且大量使用抗生素有关。长期使用或滥用抗生素所引发的耐药菌的产生和传播，将对人类健康构成相 当大的威胁。易感人群若在接触犬的过程中感染耐药性沙门氏菌，易引起广泛传播，造成严重的公共 卫生问题。这提示我们，在临床指导治疗犬病用药时，应合理用药，防止耐药性的产生，避免出现无 药可救的局面，从源头保护人类健康。 耐药基因检测结果显示，以 strA-B 基因的检出率最高，37.93%，可能与链霉素的广泛使用有关； 其次是 blaPSE 和 tetB 基因，分别为 34.48%和 27.59%。blaPSE 基因是抗青霉素羧苄西林的基因，也可导 致细菌对氨苄西林、羧苄西林、头孢孟多等多种 β-内酰胺类抗生素耐药，本调查中 blaPSE 基因的高检 出率应引起有关部门的重视。tet 基因在不同地区的分布不同，存在地域差异。本研究检出的 tet 基因 主要是 tetB 和 tetA，作为四环素外排泵基因，在细菌对四环素产生耐药中起到重要作用。细菌耐药机 制很复杂， 除了具体携带的耐药基因介导耐药， 其外排泵系统也可以介导对多种不相关抗生素的耐药， 这还需要进一步研究。 产生 β-内酰胺酶是细菌产生耐药性的最主要的机制之一，产超广谱 β-内酰胺酶（ESBLs）菌株表 现对多种抗生素使用无效或者效果不明显。目前， 对产 ESBLs 菌株研究较多的主要是大肠杆菌、 肺炎1186其他动物疫病克雷伯菌等细菌，且多在人医临床中出现，在宠物犬和犬粮分离的沙门氏菌中检出的报道甚少。本试 验共分离出 6 株 ESBLs，主要基因型为 TEM 型和 CTX-M 型。CTX-M 型是我国产 ESBLs 菌株的主 要基因型，这与近年来我国临床上大量使用头孢噻肟和头孢曲松有关[6]。细菌由于携带 ESBLs 质粒上 可同时带有对多种抗生素的耐药基因， 致使产 ESBLs 细菌具有多种不同的耐药表型， 本试验中的 6 株 产 ESBLs 细菌即呈现不同程度的多种不同耐药表型，同时由于 β-内酰胺酶基因位于质粒上，可通过 转化、转导等多种方式将耐药性在不同细菌中传递，易造成耐药细菌的流行和扩散，应引起我们的重 视。参考文献（略）长沙城区犬猫弓形虫病血清学调查唐小明，王昌建，何世成，王卫国 （湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙，410128） 摘 要 为了了解长沙城区犬猫弓形虫的感染情况，本实验采用 ELISA 方法对长沙城区的不同性别、不同年龄阶段犬 猫进行弓形虫 IgG 抗体检测，共检测 504 只，其中猫 75 只，犬 429 只。结果表明：长沙地区犬猫弓形虫感染率较高达 24.4%；犬猫弓形虫感染率与年龄有关，随着年龄的增长，感染率增加，小于 6 个月犬弓形虫感染率为 6.6%，6 月～ 1.5 岁犬弓形虫感染率为 10.5%，1.5～3 岁犬弓形虫感染率为 30.5%，大于 3 岁犬弓形虫感染率为 32.7%；小于 6 个月 猫弓形虫感染率为 0，6 月～1.5 岁猫弓形虫感染率为 25%，1.5～3 岁猫弓形虫感染率为 33%，大于 3 岁猫弓形虫感染 率为 40%；不同性别之间感染无明显差异。 关键词 长沙；弓形虫；酶联免疫吸附试验；犬猫弓形虫（Toxoplasmosis）是由龚地弓形虫（Toxoplasma gondii）引起的一种人和动物共患的，寄 生在细胞内的原虫病。由于对人类危害很大，所以备受人类医学工作者的重视。报道称国内孕产妇弓 形虫感染率为 4.3%～26.1%[1]，但人类只是弓形虫的中间宿主，猫科动物才是其终末宿主[2]。许多家 养动物如猪、犬等都是弓形虫的中间宿主。近年来，随着生活水平的提高，城市饲养宠物犬猫数量不 断增加，因此对犬猫进行弓形虫的研究显得很重要。目前全国有些地区对弓形虫已经在做一些血清学 的调查研究，如北京、郑州、兰州、上海等地[3-6]。有些地区开始采取防治措施，并取得明显的效果。 比如上海采取防治措施前犬猫弓形虫感染率 11.67%，采取防治措施后犬猫弓形虫感染率为 3.94%[7]。 因此，为了了解长沙城区犬猫弓形虫感染情况和做好弓形虫防治工作，笔者于 2011 年 6 月至 20 13 年 6 月从长沙市城区所养犬、猫随机采集血清样本，进行弓形虫 IgG 抗体检测，现报道如下。1材料与方法1.1 试剂 动物弓形虫 IGg 抗体酶联免疫检测试剂盒， 深圳海泰生物制药有限公司生产， 批号
等。 1.2 仪器 酶标仪、生化培养箱等。 1.3 被检血清 无菌采集长沙城区居民所饲养宠物犬猫的静脉血 1.0～1.5ml，离心析出血清，共采集 504 只血清 样本，-20℃冷冻备用。 1.4 方法 按照试剂盒说明书操作，检测 IGg 抗体。1187第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集2结果2.1 各种年龄阶段犬弓形虫感染情况 见表 1，表中可知 6 月龄犬感染率为 6.6%；6 月～1.5 岁犬感染率为 10.5%；1.5 岁～3 岁犬感染 率为 30.5%；大于 3 岁犬感染率为 32.7%。 2.2 各年龄阶段猫弓形虫感染情况 见表 2，由表 2 可知 6 月龄犬感染率为 0%；6 月～1.5 岁犬感染率为 25%；1.5 岁～3 岁犬感染率 为 33%；大于 3 岁犬感染率为 40%。 2.3 不同性别犬猫弓形虫感染情况 见表 3、表 4（略） 。由表 3、表 4 可知公犬阳性率为 24.3%；母犬阳性率为 22.9%，公猫阳性率 为 27.2%；母猫阳性率为 28.5%。3讨论（1）本次调查发现长沙城区犬猫弓形虫感染率较高，可能与长沙市民养犬者喜欢遛狗、流浪犬 猫管理不严以及部分畜主喜欢给犬猫饲喂生肉、生乳、生蛋或含有弓形体包囊的动物脏器组织有一定 关系。据 Jantschve（1971）于柏林调查发现犬的分泌物和排泄物中有弓形虫，而宠物犬猫与宠物主人 具有相当密切关系，因此犬猫较高的感染率，可能会造成人类的普遍感染。这应引起有关部门的足够 重视。 （2）调查结果表明：不同年龄犬猫弓形虫 IgG 抗体阳性率差别很大，年龄越大，阳性率越高， 这因为犬猫一旦感染弓形虫后，IgG 抗体在犬猫体内会存很长一段时间，同时也说明犬猫在现