论文发表、论文指导
周一至周五
9：00&22：00
小鼠a基因的克隆及其表达分析
　　[摘 要][目的]从小鼠组织细胞中提取的a基因片段的克隆；[方法]从小鼠组织细胞中提取目的基因片段，采用PCR方法将该目的基因片段扩增，将其与表达载体相连接，构建重组质粒[1]；将该重组质粒转入大肠杆菌Top10内，用蓝白斑筛选法筛选菌株进行电泳等检验。[结果]含目的基因质粒转化效率很高，电泳结果知a基因克隆成功，形成大量可用重组质粒方便下一步进行研究。[结论]从小鼠组织细胞中提取的a基因克隆效率高，菌落PCR与菌液PCR结果相近，对实验结果无明显影响。 中国论文网 /1/view-7344738.htm　　[关键词]目的基因；基因重组；PCR；蓝白斑筛选 　　中图分类号：Q781 文献标识码：A 文章编号：X（1-01 　　PCR技术通过对温度的控制能够成功快速扩增目的基因以进行下一步实验，在基因重组实验中被广泛使用；核酸限制性内切酶酶切所得的末端有粘性末端与平末端两种，其中Tap酶酶切所得为粘性末端，粘性末端连接效率大于平末端；本次实验通过菌落PCR、菌液PCR扩增目的基因后观察电泳条带确定克隆结果。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　Top10大肠杆菌、Taq内切酶、小鼠组织细胞中提取的a基因 　　1.2 试剂 　　LB培养液、氨苄青霉素、6×buffer、上游引物、下游引物、ddH2O 　　2 实验过程 　　1.目的基因PCR扩增 　　使用Taq酶作为聚合酶进行PCR 　　2.扩增产物的纯化 　　3.目的基因与plBuscript连接 　　共分为三组，分别为：①实验组：Inser DNA片段的连接：PCR目的基因之后测得Inser DNA的浓度为37.7ng/ul，则Insert DNA使用量为0.7ul。②阳性对照：Control DNA片段的连接 　　③阴性对照： 　　4.大肠杆菌感受态细胞的制备 　　5.重组质粒转入感受态细胞 　　6.涂布37℃倒置培养，并进行蓝白斑筛选 　　由于第一第二实验组培养12小时的菌落大小不足以进行菌落PCR，故将这两组的培养时间延长至20小时 　　7.第一实验组进行菌落PCR、电泳。 　　8.第二实验组进行挑菌、摇菌 　　9.第二实验组进行菌液PCR、电泳 　　10.将电泳所得结果拍照、分析 　　3 结果与分析 　　本实验通过对目的基因进行PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳估测目的基因浓度大小、纯化目的基因、紫外分光光度计检测目的基因浓度、将目的基因与载体连接形成重组质粒、将重组质粒转化进大肠杆菌TOP10感受态细胞、进行蓝白斑筛选，这些步骤可以筛选出含有重组质粒的菌落，但由于可能出现假阳性，为确定菌中确实含有重组质粒，通过两种方式检测，一种为菌落PCR及电泳，一种为菌液PCR及电泳。 　　（1）由利用Tap酶进行目的基因PCR扩增后的电泳结果可看出，所提供的目的基因大小为200bp左右，整个凝胶板上的电泳条带都普遍模糊，可能是因为上样时时间间隔太长导致样品在电泳槽中扩散。为了保证后续实验进行，对于聚合酶的产物选择两个电泳条带最亮的进行后续实验。。 　　（2）对PCR产物进行纯化后，紫外分光光度计进行定量，测得以Tap酶为聚合酶的，DNA浓度为31.1ng/ul。重组质粒时，要求载体与目的基因质量比=1：1～1：5，或者物质的量比=1：1～1：5。根据计算，该 DNA浓度可进行重组质粒。 　　（3）由培养皿上菌落生长情况可知道，实验组出现了较多的白色菌落，且没有蓝色菌落；阳性对照组出现很多白色菌落，没有蓝色菌落；阴性对照组出现了少量的白色菌落，没有蓝色菌落。其中实验组和阳性对照组符合预先设想，出现白色菌落说明重组质粒转化进菌中，且转化效率较高；没有蓝色菌落出现说明重组质粒时反应时间够长，且载体与目的基因所用比例恰当，目的基因与载体连接很成功；长出来的菌落较密，说明感受态细胞制备结果较好，且制备完后马上进行转化，效果较好；阳性对照组中菌落更为密集，符合预期，效果更好。而阴性对照组本不应出现菌落，却出现了少量菌落，可能是由于在涂板时灭菌不够彻底，或无菌操作时操作失误。 　　（4）由菌落PCR、电泳之后的结果可看出，出现的条带显示为200bp左右，与原先提供的目的基因PCR电泳结果相同，说明这些菌落的菌中都转入了重组质粒，但部分条带很淡，有可能是因为挑菌出来进行PCR时，挑得太少，扩增之后DNA浓度较低；有些样品看不到条带，说明菌落为假阳性。因此，如果要保存转入了重组质粒的菌，以便以后可以使用，可选择有出现适当条带的菌落，进一步培养、保存。 　　（5）由菌液PCR、电泳之后的结果可看出，出现的条带显示为200bp左右，与原先提供的目的基因PCR电泳结果相同，说明这些菌液的菌中转入了重组质粒。而本小组分别使用锥形瓶和EP管作为培养菌液容器，空间大小不同，但最后菌液PCR后电泳出来的条带明暗相差不大，因此，在锥形瓶有限的情况下，可以用EP管作为容器进行培养。若培养时间有差，最后菌液PCR后电泳出来的条带有所差异，摇菌培养24小时后菌液PCR后电泳出来的条带较淡，可能是由于时间过长，氨苄青霉素作用变弱，逐渐有其他的菌出现，抢占大肠杆菌TOP10的资源，因此，摇菌培养时间最好不要超过24小时。菌落PCR后保存于4℃下24h的样品，电泳出来的条带与之前菌落PCR后马上电泳的相差不大，因此当有特殊情况无法及时电泳时，将样品存放于4℃下短暂保存，对实验结果影响不大。当然，在本次实验中，样本数少，可能还不具代表性，可以再进一步实验，进行研究探讨。 　　4 结论与讨论 　　由本次实验结果可得出，本次对小鼠组织、细胞中提取出的a基因进行克隆的实验实验结果较成功，使用Taq酶能对目的基因进行PCR；在涂布、摇菌等过程中要注意杂菌干扰，防止对实验结果造成影响；由蓝白斑筛选结果可知本次实验中目的基因与载体连接效率很高，但由电泳结果可知某些白色单菌落呈现假阳性；本次实验还证明菌落PCR、与菌液PCR都能成功扩增已转化成功目的基因，且菌液样品放于4℃下短暂保存，对实验结果影响不大。但本次实验中样本数少，仍不具代表性，可以再进一步实验，进行研究探讨 　　参考文献 　　[1] 黛艳梅，温博海，邱玲，等.立式立克次体外膜蛋白B基因片段的克隆与表达[J].《中国人兽共患病杂志》，）：839-842.
转载请注明来源。原文地址：
【xzbu】郑重声明：本网站资源、信息来源于网络，完全免费共享，仅供学习和研究使用，版权和著作权归原作者所有，如有不愿意被转载的情况，请通知我们删除已转载的信息。
xzbu发布此信息目的在于传播更多信息，与本网站立场无关。xzbu不保证该信息（包括但不限于文字、数据及图表）准确性、真实性、完整性等。　　对RNA结构进行分析时，一般先通过RT-PCR反应扩增目的区域，然后再对DNA 片段进行克隆、序列分析等。一般的RT-PCR反应很难得到全长的cDNA片段，然而在基因工程研究中分析遗传基因的全长cDNA序列又是十分重要的。
Clontech专利SMARTer技术为轻松简便地合成高质量全长cDNA提供了可能。
RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends）即cDNA末端的快速扩增，传统的RACE方法应用“去帽法”原理：对Total RNA裸露的5‘磷酸基团进行去磷酸化，使用Tobacco Acid Pyrophosphatase（TAP）去掉mRNA的5’帽子结构，使用T4 RNA Ligase将5’RACE Adaptor连接到mRNA的5’端，反转录反应扩增cDNA，使用5’RACE Adaptor上的引物与已知序列部分的引物进行PCR反应，扩增cDNA 5’末端的序列。
传统的“去帽法”RACE有这样几个局限性：要求RNA起始量比较大，多个对RNA的处理、纯化步骤易导致RNA降解，实验步骤较多导致实验成功率较低等等。
SMARTer RACE方法就能够解决传统方法的这些问题。SMARTer RACE方法巧妙地利用SMARTer技术，即Switching Mechanism At the end of RNA Template，模板末端的转换机制，在一个反应内就可以完成带有接头序列的第一链cDNA合成，后续只需进行PCR就可高成功率地获得目的RACE片段。
SMARTer技术原理如下：
SMARTer技术的核心组分包括SMARTScribe逆转录酶和SMARTer Oligo序列。SMARTScribe逆转录酶具有灵敏度高和延伸性能好的特点。根据我们的实验数据，SMARTScribe 逆转录酶可以以低至10个拷贝的RNA为模板合成第一链cDNA；可获得长达14.6 kb的cDNA片段。
SMARTer RACE方法，除了引入了高灵敏度SMARTer cDNA合成技术，还引入了长、短两个PCR引物的设计来提高PCR特异性，并利用了Clontech专利的Suppression PCR技术，以降低PCR结果的背景，使RACE实验的成功率更高。
Suppression PCR降低PCR背景的原理如下图。当SMARTer Oligo这段序列与模板的某个位置形成错配后，在后续PCR过程中，这个错配得到的非特异性产物会形成一个锅柄状结构，不能与引物混合物中的短引物结合，也就不能作为模板被扩增，从而降低了PCR背景。
在PCR扩增了cDNA末端序列后，除了对PCR产物进行测序外，还需要将PCR产物克隆至载体后进行进一步的分析。SMARTer RACE试剂盒还引入了高效的In-Fusion无缝克隆技术，让克隆更高效，更简单。
综上所述，SMARTer RACE方法的优势非常明显：
▪&高灵敏度，RNA起始量要求低，10 ngC1 μg total RNA或 poly A+ RNA均可；▪&反转录酶和PCR酶的性能卓越，尤其针对于长片段和高GC含量基因；▪&长短两个通用引物的设计，提高PCR扩增特异性；▪&专利Suppression PCR技术，实现PCR低背景；▪&专利In-Fusion无缝克隆技术，高效完成RACE片段的克隆。
SMARTer 5’/3’RACE Kit（Code No.）包含了RACE实验所需的全部核心试剂，一个试剂盒就是一个完整解决方案：
▪&反转录相关试剂：SMARTer first-strand cDNA synthesis reagents▪&高质量PCR酶：SeqAmp DNA Polymerase▪&PCR产物纯化柱：NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit▪&In-Fusion无缝克隆试剂：In-Fusion Cloning reagents▪&In-Fusion克隆用线性载体：linearized pRACE vector▪&高效感受态细胞：Stellar Competent cells
SMARTer技术除了在RACE方面的应用外，在文库构建、PCR和qPCR、下一代测序等方面也实现了广泛应用。
更多产品信息，请参考官方网站
(http://www.ebiotrade.com/)版权所有，未经书面许可，不得转载
我来说两句(0)
[Ctrl+Enter]
相关文章：
加载相关文章......
今日文章：
加载今日文章......
生物通快讯
加载中......
加载中......
加载中......
加载中......
技术大讲堂
加载中......
加载中......
加载中......
加载中......
加载中......
加载中......
版权所有 生物通
Copyright&
eBiotrade.com, All Rights Reserved
联系信箱：江南大学 硕士学位论文 亚油酸异构酶基因的克隆表达 姓名：朱敬华 申请学位级别：硕士 专业：食品科学 指导教师：陈卫
摘要亚油酸异构酶基因的克隆表达学科、专业：工科、食品科学硕士研究生姓名：朱敬华 入学时间：２００７年０９月０１日答辩时间：２００９年１２月０９日授予学位时间：指导教师：陈卫教授摘共轭亚油酸（ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＬｉｎｏｌｅｉｃ要Ａｃｉｄ，ＣＬＡ）是亚油酸（Ｌｉｎｏｌｅｉｃ Ａｃｉｄ，ＬＡ）衍生的共轭双烯酸的多种位置与几何异构体的总称。它具有多种营养和保健功能，如抗癌、抗动脉粥样化和延缓机体免疫力衰退、抑制脂肪积累等。由于利用微生物转化共轭亚油酸 反应条件温和，产物异构体较单一，易于操作和控制，研究者对此进行了广泛的研究， 发现亚油酸异构酶是生物转化共轭亚油酸的一个关键酶。随着研究成果的积累和分子生物学技术的应用，研究的热点由对共轭亚油酸异构酶的微生物来源、酶学性质的研究逐 渐转向利用基因工程和生物信息学方法研究酶基因的克隆、表达以及表达产物的结构和 性质。 植物乳杆菌ＺＳ２０５８（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＺＳ２０５８）是本实验室从泡菜中筛选到 的一株具有产亚油酸异构酶的乳酸菌。根据ＮＣＢＩ中已报道亚油酸异构酶基因序列 （ＤＱ２２７３２２．１）信息，设计特异性引物，通过ＰＣＲ扩增出亚油酸异构酶基因ＬＡＩ。 张白曦曾将ＬＡＩ克隆至大肠杆菌表达载体ｐＥＴ２８ａ，构建工程菌株ｐＥＴ２８ａ／Ｅ ＢＬ２１（ＤＥ３）和ｐＥＴ２８ａ－ＬＡＵＥ．ｃｏｌｉ ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。本文对重组菌表达目的蛋白的条件进行了优化，确定最佳诱导条件为：ＩＰＴＧ浓度为０．１ ｍｏｌ／Ｌ，２０℃下诱导２０ ｈ。利用ｌｌｉｓ．ｔａｇ标签，通过镍柱纯化可溶性的外源蛋白，当洗脱缓冲液中咪唑的浓度为２００ ｍｍｏｌ／Ｌ时 得到单一的目的蛋白。气相色谱（ＧＣ）检测显示，重组亚油酸异构酶没有活性。接着将ＬＡＩ基因克隆至酵母表达载体ｐＫＬＡＣｌ，构建重组表达载体ｐＫＬＡＣｌ．Ｌ触，采用限制性内切酶ＳａｃＩＩ进行单酶切，电转化乳酸克鲁维酵母（ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓＧＧ７９９），构建工程菌ｐＫＬＡＣｌ．Ｌ舢俄ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９。同时，用同样的方法构建阴性对照菌ｐＫＬＡＣｌ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９。ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析显示，ＬＡＩ基因在乳酸克鲁维酵母中得到了分泌表达，确定较佳的发酵时间为４ ｄ。气相色谱结果显示，重组菌培养液催化ＬＡ反应产物出现典型ＣＬＡ峰型。若忽略产物提取过程中损失的ＬＡ，约有２６％的ＬＡ被异构化为ＣＬＡ。 此外，还考察亚油酸异构酶基因在乳酸菌系统中的表达，选择的表达载体和宿主菌分别为ｐＭＧ３６ｅ和乳酸乳球菌ＭＧｌ３６３（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＧｌ３６３）。但在实验中发现重组质粒ｐＭＧ３６ｅ．ＬＡＩ不稳定，在大肠杆菌中经数次传代后质粒会消失，因此不适用于后续研究。通过对亚油酸异构酶基因在三种不同表达系统中研究，最终确定乳酸克鲁维酵母作 本实验的宿主菌。亚油酸异构酶基因在乳酸克鲁维酵母中分泌表达的实现，避免了表达摘要产物被细胞内蛋白酶降解，为进一步将亚油酸异构酶基因引入食品级微生物内生产ＣＬＡ，从而开发保健功能性食品奠定了良好的理论和实验基础。关键词：共轭亚油酸亚油酸异构酶表达系统分泌表达气相检测ＩＩＡｂｓｔｒａｃｔＣｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅＳｕｂｊｅｃｔ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｆｏｏｄ Ｍａｓｔｅｒ ｇｒａｄｕａｔｅ ｓｔｕｄｅｎｔ：Ｊｉｎｇｈｕａ ＺｈｕＦａｃｕｌｔｙ ａｄｖｉｓｅｒ：Ｗｅｉ Ｃｈｅｎ，ＰｒｏＳｃｉｅｎｃｅＴｉｍｅ ｏｆ ｅｎｒｏｌｌｍｅｎｔ：０ １．０９．２００７ Ｔｉｍｅ ｏｆｄｅｆｅｎｓｅ：０９—１２．２００９ Ｔｉｍｅ ｏｆ ｃｏｎｆｅｒｒｉｎｇ ｄｅｇｒｅｅ：ＡｂｓｔｒａｃｔＣｏｎｊｕｇａｔｅｄｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄ（ＣＬＡ）ｒｅｆｅｒｓｔｏｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ａｎｄ ｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ ｉｓｏｍｅｒｓ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅｉｅａｓ ａａｃｉｄ（ＬＡ）谢ｔｌｌｔｗｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｄｏｕｂｌｅ ｂｏｎｄｓ．Ｏｒｉｇｉｎａｌｌｙ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄｎａｔｕｒａｌｌｙ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇａｎｔｉｃａｒｃｉｎｏｇｅｎ，ＣＬＡ ｈａｓｂｅｅｎ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ ｓｈｏｗ ｔｏ ｌｏｗｅｒｃａｎｃｅｒ ｒｉｓｋ，ｅｎｈａｎｃｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｎｄ ａｎｄ ｏｆｔｅｎ ｄｏｎｏｔ ｐｒｏｄｕｃｅ ａｒｅｄｕｃｅ ｂｏｄｙ ｆａｔ．Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＬＡ ｉｓｏｍｅｒｓ ｆｒｏｍ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｍｉｘｔｕｒｅｓ，ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｓｉｎｇｌｅ ｉｓｏｍｅｒ ａｔａｒｅｅｘｐｅｎｓｉｖｅａｓｈｉ曲ｐｕｒｉｔｙ．Ｓｏｍｅｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，ｓｕｃｈｔｈｅ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ，ａｒｅｃａｐａｂｌｅ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ＣＬＡ ｆｒｏｍ ＬＡ．Ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｉｓ ｔｈａｔｔｈｅ ｅｘｉａｅｎｃｅ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅｃｏｎｖｅｒｔ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｔｏ ＣＬＡ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ ｔｈｅｓｔｕｄｙ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｅｎｚｙｍｅｈａｓ ｂｅｅｎ ｔｈｅ ｆｏｃｕｓ ｏｆ ｃｏｎｓｉｄｅｒａｂｌｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｅｆｆｏｒｔｓ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈｙｅａｒｓ．Ｗｉｔｈｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄｕｓｅａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｈｏｔｓｐｏｔ ｏｆｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏｂｉａｌｓｏｕｒｃｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｅｎｚｙｍｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｇｒａｄｕａｌ ｔｕｒｎ ｔｏ ｔｈｅｏｆｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｍｅｔｈｏｄｓ ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ ｎａｔｕｒｅｏｆ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｃｈｉｎｅｓｅ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＺＳ２０５ ８，ｗｈｉｃｈ Ｗａｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｖｅｇｅｔａｂｌｅ．ｈａｓ ｔｈｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｏ ｃｏｎｖｅｒｔｔｈｅ ＬＡ ｉｎｔｏ ＣＬＡ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｓｐｅｃｉｆｉｃｔｈｅ ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＤＱ２２７３２２ １）ｗｈｉｃｈ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ＮＣＢＩ．Ｔｈｅ ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｇｅｎｅ ＬＡｌ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｔｈｏｕｇｈ ＰＣＲ． Ｔｈｅ ＬＡＩ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＥＴ２８ａｔｏｂｕｉｌｄｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｓｔｒａｉｎｓｐＥＴ２８ｅｄＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２ １（ＤＥ３）ａｎｄｐＥＴ２８ａ．ＬＡＩ／Ｅ ｃｏｌｉ ＢＬ２ １（ＤＥ３）ｂｙ Ｂａｉｘｉ Ｚｈａｎｇ ｏｆ Ｏｕｒｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＬＡＩ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｒｅｓｕｌｔ Ｗａｓ ｌｉｓｔｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ ｏｆａｎｄｔｈｅＩＰＴＧ，２０℃ａｎｄ２０ ｈ．Ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｅｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎＷａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ Ｎｉ－ｃｏｌｕｍｎ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓａｓｉｎｇｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｅｌｕｅｎｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｎｏ２００ ｍｍｏｌ／Ｌ ｍｉｄａｚｏｌｅ．Ｂｕｔ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈａｄｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｔｈｅｎｔｈｅｆｒａｇｍｅｎｔｗａｓ ｃｏｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｙｅａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＫＬＡＣ １，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒ ｐＫＬＡＣ １．ＬＡＩ．Ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｓ Ｓａｃ ＩＩ，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｐＫＬＡＣ １－ＬＡＩ／Ｋ ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｂａｔｅｒｉａ ｐＫＬＡＣ １／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９ ｉｎ ｔｈｅＳａｌＴｌｅｗａｙ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓａｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔｔｈｅ ｉｎｔｅｒｅｓｔｇｅｎｅｈａｓ ｂｅｅｎ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｉｎ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｙｅａｓｔ，４ ｄ ｗａｓｂｅｔｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｉｍｅ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｚｙｍｅ ｃｏｕｌｄ ｉｓｏｍｅｒｉｚｅ ＬＡ ｉｎｔｏ ＣＬＡ．ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ Ｗａｓ ２６％ｏｒＴｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＬＡＩ ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｂｙ ｃｌｏｎｉｎｇ ＬＡＩ ｉｎｔｏｓｏ．ＭＧｌ ３６３ Ｗａｓ ｐＭＧ３６ｅ－ＬＡｌａｌｓｏ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｄ ｗａｓ ｉｎｓｔａｂｌｅ ｉｎｐＭＧ３６ｅ．Ｂｕｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｃｔｏｒｏｆＥ．ｃｏｌｉ，ＳＯ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ Ｗａｓ ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ． Ｉｔ Ｗａｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｙｅａｓｔ Ｗａｓａｂｅｔｔｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｔｈｅＩＩＩＡｂｓｔｒａｃｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ．Ｔｈｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｃ ａｖｏｉｄｓ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅａｓｅ，ｐｒｏｖｉｄｓｆａｖｏｒａｂｌｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｆｏｏｄ ｉｎｄｕｓｔｒｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＳｅｃｒｅｔｏｒｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄｓＬｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍＧａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍⅣ独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。签名：肄塾缉日期：趔！！兰：丝关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。签。名：粒辇导师签名：Ｉ绪论１绪论１．１共轭亚油酸１．１．１共轭亚油酸简介共轭亚油酸（Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｌｉｎｏｌｅｉｅａｃｉｄ，ＣＬＡ）是一类在９与１１、１０与１２或１１与１３位碳原子处含有顺式或反式共轭双键的十八碳二烯酸，是亚油酸（Ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ，ＬＡ）（９ｅ，１２ｃ；１８：２）的位置与几何异构体的通称【１１。ＯＡ。ＩｌＣＨ３（ＣＨ２）３ＣＨ２『／＝＝＼＼／力＝＝、＼√／＼＼／，、＼／／＼、／～ＯＨＨ Ｈ（ＣＨ２）６ＣＯＯ Ｈ Ｈ３Ｃ（Ｈ２Ｃ）４ｃ．Ｈ３Ｃ（Ｈ２Ｃ）３（ＣＨ２）ＴＣＯＯＨ图ｌ－ｌ亚油酸和两种主要共轭亚油酸Ｆｉｇ．１－１ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｌｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ｔｗｏ ｍａｉｎ ｉｓｏｍｅｒｓ ｏｆｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｌｉｎｏｌｅｉｅ ａｃｉｄ（Ａ．ＬＡ，Ｂ．ｃ９，ｔｌ １－ＣＬＡ，Ｃ．ｔ１０，ｃ１２－ＣＬＡ）研究表明【２‘３１，ＣＬＡ具有诸多的生理功能，如抗癌、抗动脉粥样硬化、抑制脂肪积 累、促进生长，改善骨组织代谢，促进生长因子作用，增强机体免疫力等。其中ｃ９，ｔ １１．ＣＬＡ及ｔ １０，ｃ１２．ＣＬＡ被认为是最主要的活性单体【４】。１９９６年，美国国家研究委员会（ＮＲＣ） 把ＣＬＡ列为唯一一种具有抗癌作用的动物源脂肪酸。在国外，ＣＬＡ已被开发成食品和饲料添加剂而大量应用于农业和食品工业，是一种新型的保健功能脂质。天然的ＣＬＡ 主要存在于瘤胃动物如牛、羊等的乳脂及肉制品中，但含量甚微，每克乳脂中ＣＬＡ含量从２－－－２５ ｍｇ不等【５Ｊ。对植物来源的ＣＬＡ研究表明，有生理活性的两种异构体尚未在天然植物油中发现，所以ＣＬＡ不可能从天然植物中大量获得。工农业应用的ＣＬＡ主要由亚油酸合成。１．１．２共轭亚油酸的检测 共轭亚油酸（ＣＬＡ）的分析方法主要有紫外分光光度法、ＧＣ法【６。７１和Ａｇ＋．ＨＰＬＣｔ８．９】 法。其中紫外分光光度法是较为简便的检测方法，它利用共轭亚油酸所含有的共轭双键 在紫外区２３４ｎｍ处有特征吸收峰，而亚油酸在该波长下没有吸收峰【５】，因此可用来快速江南大学硕士学位论文检测ＣＬＡ。但是该法不能鉴别各种共轭亚油酸的异构体，仅适合分析ＣＬＡ的总量。Ａ矿一ＨＰＬＣ分析法越来越广泛的用于分析不饱和脂肪酸，其原理主要是由于不饱和 脂肪酸中的两个双键作为电子供体，Ａ矿作为电子受体形成稳定的络合物Ａｇ＋（Ｃ２Ｈ４）２。络合物存在一对孤对电子，体现为一个双键，根据该双键位置和几何结构进行分离旧Ｊ。 但该法分析ＣＬＡ对液相色谱的设备要求很高，而且所用的Ａｇ＋－ＨＰＬＣ柱的价格也非常旦喜 Ｆｐ贝ｏＧＣ法是分析脂肪酸的常规方法，它主要根据脂肪酸碳链的长短和不饱和度进行分离。ＧＣ法也是是目前应用最广的分析共轭亚油酸异构体的方法，但该法分析ＣＬＡ异构体对色谱柱的要求很高，一般使用强极性的毛细管柱，如ＣＰ．Ｓｉｌ ８８Ⅲ（１００ｍｘＯ．２５ｍｍｘ０．２９ｍ；Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ Ｌｔｄ），ＢＰＸ－７０（１２０ｒｅｘ０．２５ｍｍｘ０．２５９ｍ；ＳＧＥ），ＳＰ－２５６０ （１００ｍｘ０．２５ｍｍｘ０．２９ｍ；Ｓｕｐｅｌｃｏ Ｉｎｃ，Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）ｔ６１，普通的色谱柱无法分离异构体。 在本实验中，将采用ＧＣ法来检测ＣＬＡ。１．１．２共轭亚油酸的合成 目前，由于化学法合成共轭亚油酸具有转化率高、产量高的特点，工业上应用较多， 特别是亚油酸的碱法异构化【ｌｏ】方法被广泛采用。其缺点是得到的产物为一系列具有位置 和几何异构体的共轭亚油酸混合物，主要成分ｃ９，ｔ１１．及ｔ１０，ｅ１２．异构体含量较低，有 环化等副产物存在，因此不利于产品的开发应用。 生物法合成的ＣＬＡ异构体单一，与天然食物中ＣＬＡ异构体组成相似，主要异构 体是ｃ９，ｔ１１－ＣＬＡ和ｔｌＯ，ｅ１２．ＣＬＡ，其它异构体含量少，而且生物法转化共轭亚油酸产品的安全性较高，因此使用生物学方法生产ＣＬＡ成为当前研究热点。２０世纪９０年代 后期，Ｌｉｎｔｌｌ】等报道了几种乳酸菌具有将亚油酸转化为ＣＬＡ的能力，其产物中ｃ９，ｔ１１－ＣＬＡ及ｔ１０，ｅ１２．ＣＬＡ的含量占总ＣＬＡ的９０％以上。目前，国内外己报道很多能够 合成ＣＬＡ的微生物，主要集中于瘤胃菌、乳酸菌和丙酸菌等，见表１．１。表１－１用于生物转化合成ＣＬＡ的微生物Ｔａｂｌｅ １—１ ＣＩａｓｓ ｉｆｉｃａｔ ｉＯｉｌ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ ｔｈａｔ ｐｒｏｄｕｃｅ ＣＬＡ菌种类型 瘤胃菌菌种名称 Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｆｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ相关文献 【１２，ｌ３】Ｍｅｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ乳酸菌Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｃｔｉｓ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｆ１ ４】【１２，１４，１５】『ｌ６１ ｆ １ ５，１ ７１ 『１ ５１ ｆ ｌ ８，ｌ ９，２０】 ｆ２ Ｉ，２２１ ｆ２ １ １ ｆ２３１ ｆ２４１ｆｅｍｅｎｔｕｍＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｒｕｅｃｋｉｉ ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓＢｉｔＭｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ丙酸菌ＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｈｅｓ【２５】ｆ２６１２１绪论１．２亚油酸异构酶基因的研究进展亚油酸异构酶（Ｌｉｎｏｌｅａｔｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，简称ＬＡＩ）是一种将亚油酸催化异构化形成共轭亚油酸的酶，可来源于多种细菌和真菌。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ＦｕｓｏｃｉｌｌＵＳ，Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ，Ａｅｒｏｃｏｃｃｕｓ等微生物都具有ＬＡＩ活性‘２７‘３１】ｆ５６】，其中Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、 Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ和Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ等属的微生物具有ｃ９，ｔ１１、ｔｌＯ，ｃ１２亚油酸异构酶活性，Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ微生物具有ｔｌＯ，ｅ１２亚油酸异构酶活性。亚油酸异构酶具有较强的生物转化ＣＬＡ的能力，因此研究利用亚 油酸异构酶生物催化合成ＣＬＡ具有很大的优势和发展前景。近年来，随着研究成果的积 累和分子生物学技术的应用，研究的热点已逐渐转向利用基因工程和生物信息学方法对 亚油酸异构酶基因克隆、表达以及对表达产物结构和性质进行研究。表１．２中为ＮＣＢＩ中报道的部分微生物亚油酸异构酶相关基因。表１－２Ｔａｂｌｅ １—２ｓｏｍｅＮＣＢＩ中报道的部分微生物亚油酸异构酶基因ｉｓｏｍｅｒａｓｅＬｉｎｏｌｅａｔｅｇｅｎｅｓｏｆ Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉａ ｒｅｐｏｒｔｅｄｂｙ ＮＣＢＩ目前，原核和真核表达系统已成为表达有生物活性的重组蛋白质的两大主要系统。 近年来，酵母表达系统引起了广泛的重视，并逐渐被用于蛋白质的生产。它既有像原核 细胞系统生长快、便于基因操作和可大规模培养等优点，同时又有真核细胞具备的翻译 后加工、糖基化修饰能力，能生产有生物活性的重组蛋白等诸多特点【６９】。与大肠杆菌、 酵母菌相比，乳酸菌分子遗传学的研究起步较晚，对其基因转录和翻译的调控及蛋白质 分泌的机制还不甚了解。最近十多年来，随着乳酸菌各类表达调控元件的分离，相继发 展了一批适用于乳酸菌的克隆载体、表达载体、整合载体【７Ⅲ，而乳酸菌食品级高效表达 系统的构建及应用则是该领域研究的前沿和热点。 国内外学者曾对亚油酸异构酶基因的克隆表达进行了大量研究。Ｅｌｌｅｎ［４ｌ】等从疮疱丙 酸杆菌克隆得到亚油酸异构酶基因，进而构建花椰菜花叶病毒质粒感染烟草植物，并在 该烟草的种子中检测到ＣＬＡ的生成。Ｒｏｓｂｅｒｇ．Ｃｏｄｙ等【４２Ｊ从疮疱丙酸杆菌克隆得到共轭 亚油酸异构酶基因，并分别在乳酸乳球菌和大肠杆菌中进行了活性表达。其中，ＬＡ的转化率分别为５０％和４０％，这表明同一种亚油酸异构酶基因在两种表达系统中获得的重江南大学硕＋学位论文组蛋白活力有差异。Ｒｏｓｓｏｎ［３５Ｊ等将罗伊氏乳酸杆菌亚油酸异构酶基因在采用了多个载体与宿主后，仍未 能表达出有活性的重组蛋白，仅在利用枯草芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）的一个分泌型载体 进行表达时，在反应产物中发现一种羟基化的亚油酸衍生物，并推测此衍生物可能是重 组亚油酸异构酶催化反应尚未完成时生成的一个中间体。而疮疱丙酸杆菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）亚油酸异构酶基因采用ｐＥＴ－２４ａ表达时，可在ＥｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中表达出有活性的ｔ－ｌＯ，ｃ．１２亚油酸异构酶。由此看出不同微生物来源的亚油酸异构酶基因在宿主中具有表达差异性。目前，国内对亚油酸异构酶的研究也很多，但主要集中于利用大肠杆菌表达系统来表达亚油酸异构酶。张镇【４３】将一个推定的植物乳杆菌亚油酸异构酶基因ｐｌｉｌ８克隆到 ｐＥＴ－３０ａ载体中，构建ｐＥＴ３０ａ－ｐｌｉ原核表达载体，并在ＥｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｑｂ成功表达了可溶且具有亚油酸异构酶活性的ＰＬｌｌ８重组蛋白。张艳禾Ⅲｊ以罗伊氏乳酸杆菌ＰＹＲ８菌株基因组为模板，通过ＰＣＲ扩增出亚油酸异构酶基因，然后再克隆到ｐＥＴ－３０ａ中构 建原核表达载体ｐＥＴ３０ａ－ＬＩ，并转化至Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）。该重组菌株在３７℃下，经１．０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ诱导表达出重组蛋白ＬＩ，但该蛋白以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的３９．２％。采用Ｎｉ２＋．ＮＴＡ柱复性法获得有活性的纯化重组共轭亚油酸异构酶，其比活力为５．２ Ｕ／ｍｇ，是天然共轭亚油酸异构酶比活力的２．５倍。相丽新【４５４６Ｊ利用植物乳杆菌ＡＳｌｌ５５５，采用ＰＣＲ技术扩增其共轭亚油酸异构酶基因，克隆到ｐＱＥ３０质粒载体上，并进行测序。测序结果表明，扩增的ＤＮＡ片段全长１７１０ ｂｐ，编码５６９个氨基酸， 分子量为６４．７ ｋＤａ。经同源性比较，发现此序列与罗伊氏乳酸杆菌、短双歧杆菌、疮疱 丙酸杆菌亚油酸异构酶基因核苷酸序列差别较大，且表达出的目的蛋白大部分以包涵体 形式存在。 董理ｔｓ４ｊ以ｐＥＴ－３０ａ为载体，将疮疱丙酸杆菌亚油酸异构酶ＰＡＩ（ＴＴＡ ８２７９１）基因转入Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中，在１６＂Ｃ条件下加入ＩＰＴＧ进行诱导表达，获得可溶性重组蛋白，然后利用Ｎｉ２＋－ＮＴＡ柱对表达产物进行纯化，气相色谱法并未检测到具有亚油酸异构酶活性的重组蛋白。张艳禾【５５】从罗伊氏乳酸杆菌ＰＹＲ８菌株克隆得到亚油酸异构酶基 因，将其克隆到酵母表达载体ｐＰＩＣ９ Ｋ中并电转化至毕赤酵母ＧＳｌｌ５。获得的重组菌株ＧＳｌｌ５／ｐＰＩＣ９ Ｋ．ＬＩ经１％甲醇诱导后，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ表明该基因已在酵母中得到表达，而且重组蛋白ＬＩ存在于发酵液上清中，相对分子量约为６７ ｋＤａ。气相色谱分析表明，经 离子交换层析、疏水层析两步纯化得到的重组蛋白ＬＩ具有亚油酸异构酶的活性。这是国内首次报道从Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ ＰＹＲ８中克隆亚油酸异构酶基因并在巴斯德毕赤酵母中得到了分泌表达，这避免了大肠杆菌表达系统中产物易被细胞内蛋白酶降解的缺点，为大规模 生产及应用到食品工业中提供了便利条件。由此可见，真核表达系统在表达亚油酸异构 酶基因有潜在的优势，值得进一步探究。 本实验室筛选出一株具有转化ＣＬＡ能力的植物乳杆菌ＺＳ２０５８，并对其在ＳＫＭ体系中的转化条件进行了初步探索Ｈ７】；随后，钮晓燕‘４８１、顾思天【４９Ｊ、许庆列５０１等对其进行了转化ＣＬＡ机理的初步研究、采用多种分离纯化手段得到纯化亚油酸异构酶，并对４１绪论其酶学性质进行研究、对各种检测方法进行了考察，建立植物乳杆菌ＺＳ２０５８完整细胞 生物转化ＣＬＡ的动力学模型【５１１。利用ＰＣＲ扩增出植物乳杆菌ＺＳ２０５８中亚油酸异构酶 基因，张白曦将该段基因克隆到载体ｐＥＴ－２８ａ，构建ｐＥＴ２８ａ－ＬＡＩ，在Ｅ进行表达。ｃｏｌｉＢＬ（ＤＥ３）中１．３立题意义基于对ＣＬＡ生理活性的认识，ＣＬＡ己经或将被应用于药品、保健品、功能食品和 食品防腐剂等领域。首先是可能被用作药品。尽管其作用机理尚不清楚，也还未进行临 床实验，但其神奇的抗癌作用和减肥作用正促使更多的研究者加入探索的行列，有理由 相信高纯度的活性异构体将来可能会应用于临床治疗与康复。其次是作为保健品，ＣＬＡ作为动物的次生代谢物，是天然的，不存在所谓的同源性问题，原则上讲不存在使用上限，经常食用，对身体有益无害。再者是作为制造功能性食品的配料，可以人为地在某 些人们经常使用的食品比如牛奶中添加一定剂量的ＣＬＡ（建议按人体正常摄入食物总重的１％～５％），这样可以弥补人体摄入ＣＬＡ的不足，增强人类抵抗许多疾病的能力。 亚油酸异构酶作为生物转化合成ＣＬＡ的关键酶，近年来已成为研究的热点。国内 外的学者对亚油酸异构酶进行了大量的研究工作，成功获得了分离纯化后的亚油酸异构酶。随着分子生物学和生物信息学的迅速发展，亚油酸异构酶的重组表达成为研究的重点和难点。本实验室周凌华已经筛选到一株具有转化ＣＬＡ能力的植物乳杆菌ＺＳ２０５８，对其在 ＳＫＭ体系中的转化条件进行了初步探讨【４７１，钮晓燕对其完整细胞在磷酸盐缓冲液体系 中转化ＣＬＡ进行了研究【４引，顾思天采用多种分离纯化手段得到纯化亚油酸异构酶，并 研究其酶学性质１４９］，许庆炎对影响植物乳杆菌ＺＳ２０５８完整细胞催化转化的关键进行优 化等研究，建立植物乳杆菌ＺＳ２０５８完整细胞生物转化ＣＬＡ的动力学模型【５¨，并对各 种检测方法进行了考察【５０】。在此基础上，本文利用分子生物学技术将该植物乳杆菌中的亚油酸异构酶扩增出来，分别考察其在大肠杆菌、酵母菌和乳酸菌系统中的表达，通过 ＳＤＳ．ＰＡＧＥ检测外源蛋白的表达情况，利用气相色谱法检测重组酶的活性。１．４主要研究内容本文的主要研究内容是从Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＺＳ２０５８中获得亚油酸异构酶基因ＬＡＩ，对其 序列进行分析，并考察该基因在大肠杆菌、酵母菌和乳酸菌三个不同表达系统中的表达 情况，确定最为适合的表达系统，得到重组表达的亚油酸异构酶。具体研究内容如下：１．分析ＮＣＢＩ中已报道植物乳杆菌来源的亚油酸异构酶基因序列，根据碳端和氮端序列的保守性设计特异性引物，以本实验筛得的Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＺＳ２０５８基因组为模板，ＰＣＲ扩增出亚油酸异构酶基因ＬＡＩ。２．对ＬＡＩ基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中的表达情况进行探究，优化最佳诱导条 件，采用镍柱对重组酶进行初步纯化，气相色谱法检测重组酶活性。３．将ＬＡＩ基因克隆至酵母表达载体ｐＫＬＡＣｌ，电转化入Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓＧＧ７９９中进行表达，ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析目的蛋白的表达，气相色谱法检测重组酶活性。江南大学硕＋学位论文４．考察亚油酸异构酶基因在乳酸菌系统中的表达，选择表达载体为ｐＭＧ３６ｅ，宿主菌为Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＧｌ３６３。６２材料与方法２材料与方法２．１材料与设备２．１．１菌株与质粒菌株Ｅ ｃｏｌｉＤＨ５ａ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＺＳ２０５８ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ＭＧｌ ３６３ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９ Ｐｅｔ２８ａ／Ｅ ｃｏｌｉ ＢＬ２ １（ＤＥ３） ｐＥＴ２８ａ－ＬＡＩ／Ｅ。ｃｏｌｉ ＢＬ２ １（ＤＥ３）描述 克隆宿主菌来源 实验室保存 实验室保存 中科院微生物所惠赠 实验室保存 实验室构建 实验室构建目的基因来源菌乳酸菌宿主菌 酵母菌宿主菌大肠杆菌工程菌大肠杆菌工程菌质粒ｐＧＭ－Ｔ克隆载体天根生化有限科技公司本实验构建 中科院微生物所惠赠ｐＧＭＴ－ＬＡＩｐＭＧ３６ｅ亚克隆，氨苄抗性乳酸菌表达载体红霉素 抗性ｐＫＬＡＣｌ ｐＫＬＡＣｌ－ＬＡＩ酵母菌表达载体氨苄抗性 重组载体实验室保存 本实验构建２．１．２实验主要试剂限制性内切酶和Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司；Ｇｅｌ—ｇｒｅｅｎ核 酸染料购自南京博飞生物有限公司；ｐｆｕ ＤＮＡ聚合酶购自ＰＲＯＭＥＧＡＲ公司；ＹＣＢ培 养基和乙酰胺购自ＮＥＢ公司；蛋白胨和酵母抽提物为ＯＸＯＩＤ ＥＮＧＬＡＮＤ公司产品：亚油酸和共轭亚油酸标样购自美国Ｓｉｇｍａ公司，纯度大于等于９９％。 其它常用试剂均购自中国医药（集团）上海化学试剂公司。 ２．１．３实验主要设备设备名称 电热恒温培养箱 型号ＰＹＸ．ＤＨＳ生产厂家上海一恒科技有限公司苏州安泰空气技术公司 上海医用核子厂ＲＥＶＣＯ超净工作台高压蒸汽杀菌锅 超低温冰箱 制冰机ＳＷ二ＣＪ．１ＦＤＬＳ．Ｂ５０Ｌ Ｔｈｅｒｍ０７０７ ＦＡ７０Ａ Ｃｏｏｌ Ｔｅｃｈ ３２０ ＧＳ００００１ Ｇｅｌｄｏｃ ２０００中国格兰特制冷公司Ｔｈｅｒｍｏ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂｉｏ．Ｒａｄ Ｉ，ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ超级恒温水浴锅ＰＣＲ仪凝胶成像系统７江南大学硕士学位论文核酸电泳仪Ｐｏｗｅｒ ｐａｅ Ｒ ３４ Ａ ２５１０ Ｐｏｗｅｒｐａｅ ＧＣ２０１０ ＢＰＸ．７０ ＡｏＣ．２０ｉＢｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ小型冷冻离心机 电转化仪蛋白电泳仪 气相色谱仪 色谱柱 自动进样器 氮吹仪 超声波破碎仪ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＥｐｐｅｎｄｏｒｆ ＢＩＯ．ＲＡＤ日本岛津公司ＳＧＥ公司日本岛津公司泉岛公司ＳｏＮＩＣＳ＆ＭＡＴＥＲＩＡＩ，ＳＱＧＣ一１２ＴＶＣＸ５００２．２培养基及引物２．２．１培养基１．ＬＢ（Ｌｕｒｉａ．Ｂｅｒｔａｎｉ），用于培养大肠杆菌及大肠杆菌工程菌，必要时加入１ ００ 的氨苄青霉素和１５０ ｇｇ／ｍＬ的红霉素。２．ＹＰＤ（Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｄｅｘｔｒｏｓｅｌａｇ／ｍＬＭｅｄｉｕｍ），用于培养乳酸克鲁维酵母菌。电转化用含５ ｍｍｏｌ／Ｌ乙酰胺的ＹＣＢ选择性培养基筛选阳性克隆。３．ＭＲＳ（ＭａｎＲｏｇｏｓａ Ｓｈａｒｐｂｒｏｔｈ）［５２１，用于培养目的基因来源菌．植物乳杆菌ＺＳ２０５８。４．ＧＭｌ７ｔ７０１，含有５％葡萄糖的Ｍ１７培养基，用于培养乳酸乳球菌ＭＧｌ３６３。２．２．２ＰＣＲ引物本实验所用引物见表２．１。表２－１引物序列Ｔａｂｌｅ ２－１ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐ一．ＬＡＩ．Ｕ Ｐｒｉ．ＬＡＩ．Ｄ Ｐｒｉ．ＬＡＩＬ．Ｕ Ｐｒｉ．Ｉ，ＡＩＩ，－Ｄ ＩＩｌｔＰｒｉ．１ ｈｌｔＰｒｉ．２ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓａｒｅＰｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄｉｎｔｈｉｓＳｔｕｄｙ５’－ＣｏＧＣｏＧＣＣＧＣ工州Ａ—ＡｒＣＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣ仉～Ｇ兀’ＧＣ?３’５’．１１＇ＡＧＡＧＣＴＣＧＡ ＡＴＧＧＧＧＧＣＧＴＬ蛔［１１ＡＩ’ＧＧ．３’ ５’．ＧＣＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＴＣＡＡＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＣＣ一３’５’一ＧＴＴｇ煎Ｑ△丝墅巡坠一ＡＴＧＧ７ＧＧＧＣＧＴＴＡｍ觚Ｇ－３’Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５’＿÷３’５’．１’ＡＣＣＧＡＣＧＴ发ｎ婀ＡＡＧＣＣＣＡ．３’５’．ＡＴＣＡＴＣＣｌＴＧＴＣＡＧＣＧＡＡＡＧＣ．３’ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ．２材料与方法２．３实验方法２．３．１．亚油酸异构酶基因的ＰＣＲ扩增从ＮＣＢＩ查找已报道的植物乳杆菌来源的亚油酸异构酶基因序列，序列号分别为：ＤＱ２２７３２２．１、ＤＱ０１０３３１。经序列比对发现其碳端和氮端高度保守，据此设计特异性引物Ｐｒｉ．ＬＡＩ．Ｕ／Ｐｒｉ．ＬＡＩ．Ｄ（表２．１），分别引入Ｘｈｏｌ Ｉ、Ｎｏｔ Ｉ酶切位点（单下划线）和 Ｋｅｘ切割位点和终止子（双下划线）。以植物乳杆菌ＺＳ２０５８基因组为模板，用高保真Ｐｍ酶ＰＣＲ扩增亚油酸异构酶基因ＬＡＩ。ＰＣＲ反应条件：９５℃５ ｍｉｎ；９５℃３０ Ｓ，５５℃４５ Ｓ，７２℃２ ｍｉｎ，３０个循环；７２℃１０ ｍｉｒａ４。Ｃ终止。ＰＣＲ产物送上海博尚生物技术有限公司测序。 ２．３．２亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达 ２．３．２．１构建工程茵ｐＥＴ２８ａ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥａ）和ｐＥＴ２８ａ—Ｌ削［／ＥｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｃｏｌｉ本实验室张白曦将Ｌｍ片段克隆至大肠杆菌表达载体ｐＥＴ－２８ａ，化学转化ＥＢＬ２１（ＤＥ３），构建工程菌株ｐＥＴ２８ａ／ＥｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）和ｐＥＴ２８ａ－ＬＡＩ／ＥｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）。２．３．２．２优化重组酶表达的诱导条件 从诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间三个方面考察目的蛋白的表达情况。 ２．３．２．３镍柱初步纯化重组酶离心收集诱导结束的菌体，重悬于２０ ｍＬ磷酸盐缓冲液中，加入２０ ｍｇ溶菌酶，４℃ 孵育１０ ｍｉｎ，超声波破碎。细胞破碎液离心，上清用镍柱纯化，用咪唑浓度为５０ ｍｍｏｌ／Ｌ 和１００ ｍｍｏｌ／Ｌ的缓冲液冲洗样品柱，洗去杂蛋白。然后用咪唑浓度为２００ｍｍｏｌ／Ｌ、３００ ｍｍｏｌ／Ｌ的缓冲液洗脱目的蛋白，收集样品进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析。２．３．２．４气相色谱法检测重组酶活性菌体重悬液超声破碎，离心取１ ｍＬ沉淀和１ ｍＬ上清分别加入适量底物ＬＡ进行酶活反应，阴性对照菌做同样处理。２４ ｈ后进行脂肪酸提取和甲酯化，气相色谱法检测ＣＬＡ。２．３．３亚油酸异构酶基因在酵母茵中的表达 ２．３．３．１构建克隆载体ｐＧＭＴ－ＬＡＩ 核酸电泳胶回收纯化ＰＣＲ产物，获得基因的克隆片段，两端加Ａ，１６ ｏＣ下与ｐＧＭ．Ｔ 过夜连接（具体参见试剂盒说明书）。根据《分子克隆实验指南（第二版）》中的ＣａＣｌ２ 法【５３１制备感受态细胞，将连接产物转化感受态细胞【５３１，涂布含氨苄青霉素１００ 的ＬＢ平板，过夜培养。 从转化平板上挑取白色单菌落做菌落ＰＣＲ检验，并将其在含有５ ｍＬ加有氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中接种，３７ｏＣ、２００ｕｇ／ｍＬｒ／ｍｉｎ扩大培养。提取质粒，进行酶切验证，溶９江南大学硕士学位论文液配制参考《分子克隆实验指南（第二版）》。鉴定后的阳性克隆ｐＧＭＴ－ＬＡＩ／Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ａ送往上海博尚测序，采用冷冻甘油法保存相应的菌株。 ２．３．３．２构建表达载体ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＪ提取质粒ｐＫＬＡＣｌ和ｐＧＭＴ－ＬＡＩ，用限制性内切酶Ｘｈｏｌ Ｉ和Ｎｏｔ Ｉ在３７℃下保温３ ｈ。双酶切产物全部进行核酸电泳并切胶回收（采用购自ＢＩＯ ＢＡＳＩＣ公司的胶回收试剂盒，方法见产品使用说明），得到的Ｌ越片段与ｐＫＬＡＣｌ连接（方法同连接至Ｔ载体），转化ＥｃｏｌｉＤＨ５ａ，重组质粒命名为ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＩ。ＧＧ７９９２．３．３．３构建工程菌ｐＫＬＡＣＩ．ＬＡＩ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９和ｐＫＬＡＣｌｌＫ．１ａｃｔｉｓ提取质粒ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＩ和ｐＫＬＡＣｌ，用限制性内切酶ＳａｃＩＩ在３７℃保温３ ｈ。依照 ＮＥＢ乳酸克鲁维酵母蛋白表达操作手册制备电转化感受态细胞。将线性化的ｐＫＬＡＣｌ和ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＩ浓缩，各取５此至电转化感受态细胞中，轻轻混匀，转入预冷电转化杯中，仪器设置：Ｍｏｄｅ ＰｒｏｋａｒｙｏｔｅｓＯ，２５００ ｖ，５ｍｓ。电击后立即加入含ｌ ｍＬ含有１ ｍｏｌ／Ｌ山梨醇的ＹＰＤ复苏培养基，３０＂Ｃ孵育１ ｈ。离心收集细胞，用０．４ ｍＬ无菌水重悬，涂布含有５ ｍｍｏｌ／Ｌ乙酰胺的ＹＣＢ选择性平板【５９１。 ＹＣＢ选择性平板上生长的单菌落扩大培养，ＯＤ６００约为１．３．１．５时取适量进行基因 组提取（试剂盒提供方法，ＴＩＡＮａｍｐＹｅａｓｔ ＤＮＡＫｉｔ）。以提取的基因组为模板，用ＩｎｔＰｒｉ．１／ＩｎｔＰｒｉ．２（表２．１）进行ＰＣＲ扩增，鉴定整合子。ＰＣＲ反应条件：９５ ｏＣ变性５ ｍｉｎ，３０次扩增循环（９５０Ｃ ３０２．３．３．４ Ｓ，５００Ｃ ３０ Ｓ，７２０（２ ２ｍｉｎ），７２０Ｃ延伸１０ ｍｉｎ。ＳＤＳ．ＰＡＧＥ蛋白电泳检测重组亚油酸异构酶的表达１．重组菌的发酵培养ｐＫＬＡＣｌ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９、ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＵＫ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９划线于ＹＰＤ平板上，３０ ｏＣ培养箱中培养２ ｄ。挑取单菌落转接于５ ｍＬ ＹＰＤ液体培养基中，３０ ｏＣ、１５０ ｒ／ｍｉｎ扩大 培养２ ｄ。转接到１００ ｍＬ ＹＰＤ液体培养基中（按１％接种比例），发酵２ ｄ和４ ｄ时取样。 ２．ＳＤＳ．ＰＡＧＥ蛋白电泳胶的配制参考《分子克隆实验指南（第三版）》，聚丙烯酰胺凝胶的配制（表２．２）和Ｂｕｆｆｅｒ的配方如下：ｌＯ２材料与方法表２－２Ｔａｂｌｅ ２－２ Ｆｏｒｍｕｌａ ｏｆＴｒ ｉｃｉｎｅ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥ聚丙烯酰胺凝胶配方（１２％）ｇｅｌ ａｎｄ ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ｇｅｌ ａｂｏｕｔｓｅｐｅｒａｔｉｎｇＳＤＳ—ＰＡＧＥ（１２％）３．样品的处理固体样品：加入４０此１×上样缓冲液溶解样品； 菌液处理：取２０此菌液，加入等体积的２×上样缓冲液混匀。９５ｏＣ处理５ ｍｉｎ。４．凝胶的染色和脱色考马斯亮蓝Ｒ．２５０（ＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅＲ．２５０）蛋白染色方法相对于其他蛋白染色方法，操作简单易行，效果明显，且较安全。微克级的蛋白都能检测到，灵敏度较高，本实验主要采用此法进行蛋白染色。凝胶脱色后用凝胶成像仪成像。２．３．３．５气相色谱检测重组亚油酸异构酶的活性１．亚油酸乳浊液的制备 ＬＡ与Ｔｗｅｅｎ．８０溶于去离子水中，使ＬＡ终浓度为５０ ｍｇ／ｍＬ，超声乳化ｌ ｍｉｎ，形 成稳定的乳浊液，经Ｏ．２２ ｌｘｍ微孔滤膜过滤除菌，４℃保存，备用。 ２．重组菌发酵液生物转化ＬＡ 发酵培养菌株ｐＫＬＡＣｌ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ４ＧＧ７９９、ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＩ版ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９，分别取１５０ｍＬｄ发酵液于１０ ｍＬ具塞三角瓶中，低温状态下加入８“Ｌｍｇ／ｍＬ的ＬＡ乳浊液，混匀，３７℃、２００ ｒ／ｍｉｎ反应２４ｈ。用１ ｍＬ去离子水做相同处理来判断底物ＬＡ的保留时间。３．脂肪酸提取 根据Ｂｌｉ曲和Ｄｙｅ法【６１】，用氯仿．甲醇（１：２，ｖ／ｖ）溶液提取脂肪酸。具体如下：将２４ ２ｈ反应产物转移到离心管中，加入２ ｍＬ甲醇和ｌ ｍＬ三氯甲烷，振荡混匀３０ Ｓ。再加ｒ／ｍｉｎｍＬ三氯甲烷，振荡３０ Ｓ，加入１ ｍＬ去离子水，振荡混匀３ ｍｉｎ，于４℃下６０００离心１０ ｍｉｎ。去除上清（水和甲醇），加入１ ｍＬ去离子水，振荡混匀１ ｍｉｎ，４＂Ｃ下６０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ。取下层于容量瓶中，氮气吹干（去除三氯甲烷），获得游离脂肪酸。４．脂肪酸甲酯化提取到的脂肪酸加入ｌ ｍＬ０．５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ．ＣＨ３０Ｈ，６５℃皂化Ｏ．５ ｈ，冷却后再加入１ ｍＬ ２５％的ＢＦ３．ＣＨ３０Ｈ溶液，将混合物在７０℃水浴中加热２ ｒａｉｎ。冷却，加入ｌｍＬ正己烷，振荡使脂肪酸甲酯转入正己烷层，加入饱和ＮａＣＩ溶液，使正己烷上浮至容量瓶细颈处，供ＧＣ分析用。５．标准品处理江南大学硕士学位论文取适量ＣＬＡ标准品到玻璃管中，用氮气吹干，甲酯化后进行ＧＣ分析，确定ＣＬＡ 的保留时间。 ６．ＧＣ分析条件 气相色谱仪（美国Ａｇｉｌｅｎｔ ６８９０）；色谱柱ＳＰ－２３８０（６０ｍｘ０．２５ｒｌｌｎｌｉ．ｄ．ｘ０．２０岬，ＳｕｐｅＬｅｏ公司）。采取程序升温，８０＂Ｃ保持５ ｍｉｎ，然后以１３℃／ｍｉｎ的升温速率升至１７０＂Ｃ， 保持此温度４０ ｍｉｎ，最后以２０＂Ｃ／ｍｉｎ的升温速率升至２３０＂Ｃ，保持５ ｒａｉｎ。柱前压：１００ ｋＰａ；进样口温度：２３０。Ｃ；检测器温度：２５０＂Ｃ；空气压力：５０ ｋＰａ：氢气压力：６０ 用峰面积归一化法【５０１。 ２．３．４亚油酸异构酶基因在乳酸茵中的表达ｋＰａ；氮气压力：１００ ｋＰａ；载气流速：１．６ ｍＬｌｍｉｍ分流比：２：１；进样量：１此。数据处理采２…３４１构建裁体ｐＧＭＴ－ＬＡＩＬ以２．３．３．１中构建的质粒ｐＧＭＴ－ＬＡＩ为模板，以ｐｒｉＬＡＩＬ－Ｕ／ｐｒｉＬＡＩＬ—Ｄ为引物，进行 ＰＣＲ扩增，产物两端加Ａ后克隆至ｐＧＭＴ载体，转化Ｅ ｃｏｉｌ ＤＨ５ Ｑ，经蓝白斑筛选， ＰＣＲ验证和双酶切鉴定，构建亚克隆ｐＧＭＴ－ＬＡＩＬ／Ｅ，ｃｏｌｉ ＤＨ５ ２．３．４．２构建表达裁体ｐＭＧ３６ｅ－ＬＡＩ 提取质粒ｐＭＧ３６ｅ和ｐＧＭＴ－ＬＡＩＬ，用限制性内切酶Ｓａｃ Ｉ和Ｈｉｎｄｆｆｌ分别进行双酶 切，３７℃下保温３ｈ。Ｑ。将酶切产物全部进行核酸电泳并切胶回收，回收得到的ＬＡＩ和ｐＭＧ３６ｅ连接后，转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５ Ｑ，利用红霉素筛选转化子，重组载体命名为ｐＭＧ３６ｅ－ＬＡＩ。２．３．４．３构建工程茵ｐＭＧ３６ｅ－ＬＡＩ／Ｌ．１ａｃｔｉｓ ＭＧｌ３６３和ｐＭＧ３６ｅ／Ｌ．１ａｃｔｉｓ ＭＧｌ３６３ 制备乳酸乳球菌ＭＧｌ３６３电转化感受态细胞，方法参见文献［７０】。将质粒ｐＭＧ３６ｅ和ｐＭＧ３６ｅ．“ｕ浓缩，分别取５止至电转化感受态细胞中，轻轻混匀，转入预冷电转化杯中。擦去电转化杯表面湿气，放到电转化仪中，仪器设置：Ｍｏｄｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｃｓ０，２０００ ｖ，５ｍｓ。电击后立即加入含１ ｍＬ含有１ ｍｏｌ／Ｌ蔗糖的ＧＭｌ７ｒａｇ／ｍＥ复苏培养基，３０＂１２孵育１ ｈ。离心收集细胞，用０．４ ｍＬ无菌水重悬，涂布含５０ 红霉素的ＧＭｌ７选择性平板。１２３结果与讨论３结果与讨论３．１亚油酸异构酶基因的ＰＣＲ扩增３．１．Ｉ植物乳杆菌ＺＳ２０５８基因组提取 将本实验室从泡菜中筛选得到的植物乳杆菌ＺＳ２０５８菌种，划线于ＭＲＳ固体培养基 平扳，３０℃培养１２ ｈ。挑取单菌落接种于含有２０ｍＬＭＲＳ液体培养基的螺帽试管中， ３０℃培养１２ ｈ。按１％接种量转接入ＭＲＳ液体培养基的三角瓶中，３０＂Ｃ Ｆ继续培养１２ 然后收集菌体，进行基因组抽提（方法参见试剂盒）。Ｍｌ ２ｈ，图３－ＩＦｉｇ №Ｌ０ ｋｂ ３－ｌｚ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＺＳ２ ｅｘｔｆ８ｃｔｉｏｎ０５８基因组提取Ｌ ｐｌ口ｎｔａｒｕｍ ＺＳ２ ０５８ＧｅｎｏｍｅｏｆＤＮ＾ｍａｒｋｅｒ；１．２：Ｇｅｎｏｍｅ ｏｆＺ．ｐｌａｎｔａｒｔ皿ＺＳ２０５８结果如图３．１，两个样品均在太于１０ ｋｂ处出现条带，该条带即为ＬｐｌａｎｔａｒｕｍＺＳ２０５８的基因组。３．１．２从ＬｐｌａｎｔａｒｕｍＺＳ２０５８扩增目的基因 根据ＮＣＢＩ中已报道的亚油酸异构酶基因序列ＤＱ２２７３２２ ｌ、ＤＱ０１０３３１两端序列的 保守性，设计特异性引物，以Ｌ ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＺＳ２０５８的基因组为模板，采用高保真ｐｆｉｔ ＤＮＡ 聚合酶通过ＰＣＲ扩增亚油酸异构酶基因ＬＡＩ，ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定，大 小为１７００ｂｐ的片段（如图３－２），与预期大小相同。江南大学硕士学位论文图３—２Ｆｉｇ ３－２ ＰＣＲ ｋｂＰＣＲ扩增ＬＡＩ基因ｏｆ ＬＡＩ ＰＣＲ ｇｅｎｅａｍｐＩｉｆｉｅａｔｉｏｎＭ：１ ００卧ｍａｒｋｅｒ；１ｐｒｏｄｕｃｔ３．１３Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍＺ８２０５８亚油酸异构酶基因序列 ＰＣＲ产物核酸电泳切胶回收后测序，得到的序列见附录ｌ。测序结果用ＢＬＡＳＴ在 线工具进行分析，该ＬＡＩ片段与Ｇｅｎｅｂａｎｋ上序列号为ＤＱ２２７３２２ ｌ、ＤＱ０１０３３１的亚油 酸异构酶基因序列相似性均达到９９％，以序列号为ＤＱ２２７３２２ ｌ的为例，ＢＬＡＳＴ比对结果如下图。３结果与讨论爿翌ｌｇ蔓Ｉ至盟至至２墼茎：羔ｉｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｄｓ Ｌｅｎｇｔｈ＝ｌＴｌ０Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ５ｐｌａｎｔａｉ弋趣５ｔｒ＆ｉｎＡＳｌ．５５５１ｉｎ。ｌｅａｔｅｉ３。ｍｅｒ＆３ｅＳｃｏｒｅ。３０８５ ｂｉｔｓ（１６７０》， ｓｔｒａｎｄ＝Ｐｌｕ５／Ｐｌｕ５ Ｑｕｅｒｙ ２Ｅｘｐｅｃｔ＝０．０Ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ＝１６９４／１７０６《９９％），Ｇａｐｓ＝０／１７０６‘Ｏ％＇ＴＧＧＧＧＧＣＧＴＴ矗Ｔ：￡薯萏ＴＧＧＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＧＣＡＡＴＴＡＴＧＡＴＴＧＧＴＧＣＣＧＧＧＣ！ＡＴＣＡＡＡＴＡ６１ ６１ １２１ １２１ １８１ １８１ ２４１ ２乓ｌ３０１Ｓｂｊ北２ Ｑｕｅｒｙｓｂ３ｃｔ ６２６２ＴＧＧＣＧＧＣＧＴＴＡＴＴ！ＡＴＧＧＴＴＡＡＡＡＧＴＡＡＡＧＣＡＡＴＴＡＴＧＡ艘ＧＧＴＧＣＣＧＧＧｅ！ＡＴＣＡ．ＡＡ里ＡＴＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＧＴＣＺ矗ＣＴＴＧＡｌ陌ＣＡＡＧ舀￡ＧＧＴＣ圣：双ＧＧ＿ＧＡＴＧＧＴＡ舀ＧＧＡＣＡＴＣＡＣＡＴＴＣＴｌ ｌ ｌ ｌ ｌＩ ｌｌ Ｉ Ｉｌ ｌＩ Ｉｌ¨ｌ ｌ ｌ ｌｌ ｌｌ Ｉ｜Ｉ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌＩ ｌＩ ｌ ｌ｜ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ｜Ｉ ｌｌ Ｉ ｌＩＴＧＧＣＴＧＣＧＣ；Ｉ：ＧＧＴＣＴＡＣＴＴＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＧＧＴＣＡＺ！ＧＧＧＡＴＧＧＴ矗舀ＧＧＡＣ矗ＴＣＡＣＡＴＴＣＴＩ ｌ ｌｌｌ ｌ ｌ Ｉ Ｉ ＩＩ ＩＩ ｌｌ ｌ ｌ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ＩＩ Ｉｌ ｌ ｌ｜Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ｜ｌ ｌ ｌ｜Ｉｌ ｌ ｌ ｌ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉｌ ｌ ｌｌ ｌＱｕｅｒｙｓｂｊｃｔＱｕｅｒｙｓｂ３ｃｔ１２２ １２２ １８２ １８２ ２４２ ２４２ ３０２ ３０２ ３６２ ３６２４２２ＡＴＧＧＴＧＴ蜀翟谨ＡＴＧＣＡｃＧＧ嫩Ｃ凇＆ＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＡｅＴＧ裔ＴＴＴＴ萏ＣＣＡＡＴＧＡＧＴｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉｌ ｌＩ ｌ ｌｌ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ｌｌ ｌ Ｉｌ ＩｌＡＴＧＧＴＧＴＴＧＡ卫ＡＴＧＣ６ＣＧＧＴＧＣＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＣＧＡＣＴＧＡＴＴ！ＴＡＣＣＡＡＴＧＡＧＴ 曼卫ＴＧＧＡＡ芝Ａ赢ＧＡ舀芏ＣＡＴＣＣＧＡＴＧＧＣＴＡＡＣ萏ＣＧＡＣＴＧＧＧＺＡＴＧＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＣＧ＆Ａｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉ ｌ Ｉ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ｌ ＩＩ Ｉｌｌｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ｌｌ ＩＩ ｌ Ｉｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉｌ Ｉｌ Ｉｌ ｌＡＴＴＧＧ矗ＡＴＡＡＧＡＡＴＣＡＴＣＣＧＡＴＧＧＣＺＡＡＺＡＣＧＡＣＴＧＧＧＺＡ２ＧＴＴＧＣＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＣＧＧＡＱｕｅｒｙＴＧＣＴＧＡＡ卫Ｔ矗ＣＣＧＧＡＣＧＺＡＣＧＴＴＧＡＣＴＴＡＡＴＧＧ赢ＴＴＴＡ’赡ＧＧＡＣＣＧＧＡＴＴＣＣＡＴＣＧＧＺＡＡ ＴＧＣＴＧ舀鱼！双ＡＣＣＧＧＡＣＧＴＡＣＧ贸ＧＡｅＴＴＡＡＴ｛吕ＧＡＴ骶矗堂ＴＧＧ巍ＣＣＧＧＡ譬ＴＣＣＡＴＣＧＧＴＡＡｌ ｌ ｌ ｌ ｌ｜ｌｌ ｌＩ ｌ ｌ ＩＩ ｌ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ｝ｌ ｌ ｌＩ ｌ ｌｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉ Ｉｌ ｌ ｉｌ Ｉｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ＩｌｓｂｊｃｔＱｕｅｒｙ３０１ ３６１ ３６１ ４２１ ４２１ ４８１ ４８１ＣＴＧＡＡＣＣＧ∞ＧＡＴＧ舀ＣＧＧＣＧＧＣＴＧＡＡＧ蔬霉ＡＣＧＣＧＴＧＡＴＴ茁茁ＧＡＴＧＣＧ舀Ａ毳ＣＡＴＣＧＧＡＣＧＴＣＺＧＡ配ＣＧＧＧＧＡＺＧ量ｅＧＧＣＧＧＣＣＧＡｅ鑫Ａ￡酞ＧＣＧＺＧＡＴ霉ＴＴＧＡ２ＧＣＧ舀ＡＡＣＡＴＣＧＧＡＣＧＴＡＴＧＡＴＡ雾２ＧＣＣＣＧＣ譬ＴＧＡ翟ＧＣＡＧＧＧＴＧＧＴＡＡＡＧＧＣＡＴＴＡＺＴＡＡ．ＴＧＣＴＧＧ２ＡＡｇＴＴＡＧＧＡＴｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉ ＩＩ Ｉ ｌ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌＩｌ ｌｌ ｌ Ｉ ｌｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉ ｌ ｌ ｌＩ Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ Ｉｌ ＩＩＳｂ３ｃｔＱｕｅｒｙｓｂ３ｃ＇ｃＡＴＧＡ窆Ａ！鼍，吕ＣＣＣＧＣ嚣ＧＡＴＧＣＡＧ芷昭ＴＧＧＴＡ舀施Ｇ（；ＣＡＴＴＡ３ｅＴＡ舀ＴＧＣＴＧＧＴ置ＡＧＴＴ五怎笼兰ＡＴ 既ＡＡＴＡＡＴＡＡ￡；ＧＡＴＣｇＧＡＣＴ嚣ＧＣ：ＴＧ舀Ｉ箔ＡＡＧ嚣ＧｉＡＴＣ：ＡＴＧＡＴＧＣＣ盈Ｇ盈Ｚ舀船Ｇ矗矗ＧＡＡＡｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ Ｉｌ ｌ ｌ ｌ ｌ｝ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ｉ ｌ ｌＩ ｌ Ｉ ｌ；ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌＩ ｌＱｕｅｒｙＳｂｊｃｔ４２２，巳巴ＡＡ！ＡＡ２Ａ参ＧＧＡＴＣ８ＧＡＣ２欺ＧｅＴＧ圣ＪＯＴＣ昼￡忍２Ｇ西叠哩龇Ｇ般ＧＣＣ国￡撂ａ瞄淤ＧＡＡＧ磊盈Ａ图３－３Ｉ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ Ｉ ｌ Ｉ Ｉ ｌ Ｉ¨ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌ ｌ ｌｌ Ｉ ｌｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌＩ ｌ ｌ ｌ ｌｌ¨ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌ ｌｌＬＡＩ与ＤＱ２２７３２２．１基因序列进行Ｂｌａｓｔ比对（部分结果）ｂｅｔｗｅｅｎ ＬＡＩ ａｎｄＦｉｇ．３－３Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｏｎＤＱ２２７３２２．１ｇｅｎｅｕｓｉｎｇＢｌａｓｔ ｔｏｏｌ两种基因序列氨基酸比对结果如图３．４，其中阴影部分代表氨基酸完全一致。结果 显示，测序结果与序列号为ＤＱ２２７３２２．１的序列相比，５６５个氨基酸中仅有五个氨基酸不同，氨基酸相似性也为９９％，推断获得的目的序列是Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ ＺＳ２０５８的亚油酸异 构酶基因，命名为ＬＡＩ。１５江南大学硕士学位论文Ｆｉｇ３—４Ａｍｉ…ｃｉｄ圈３ｓ４ＬＡＩ与Ｄ０２２７ ３２２ｃｏｍｐａｒｅ１基固氯基酸比对ｂｅｔｗｅｅｎ ＬＡＩ ａｎｄｓｅ口…ｃｅＤＱ２２７ ３２２１ｇｅｎｅ３．２亚油酸异构酶基因在大腑杆茵中的表达３．２．１优化重组酶表达的谤导条件 发酵培养工程菌株ｐＥＴ２８ａ／Ｅ．ｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）和ｐＥＴ２８ａ－ＬＡＩ／Ｅ．ｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）， ＯＤ６００达到０．５—０ ６时加入ＩＰＴＧ进行诱导。从诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间三个方 面考察重组苗胞内表达目的蛋白的情况，由于低温诱导利于胞内可溶性蛋白的表达，所 以诱导温度设定为２０。Ｃ，在此温度Ｆ改变诱导时『日｜和诱导剂ＩｌＹｒＧ浓度。结果如图３－５所示。Ｍ１２３４５６７８９Ｍｌ２３４５６７ｇ９６６ ２ｋＤ—一（ａ）不同浓度诱导荆对蛋白表达的影响（ｂ）不同诱导时间对蛋白表达的影响图３—５重组酶表达手件的优化Ｆｉｇ ３—５ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｄｌｌｉｏｏｓ ｏｆ ＩＰＴＧ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｏＮｅｎｚｙｍｅ（ａ）ＴｈｅＭ Ｌｏｗｍｏｌｅ㈨１…ｊ ｅｃ㈨１ｉｎｆｌ ｕｅｎｃｅ ｏｆｄｉｆ／ｅｒｅｎｔｃｏｉｌｃｅｆｌｔｌ－ａｔｉｏｔｉｓ ｏｆｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｇｈｔ ｓｔａｎｄａ ｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；１，２，３：１ｔｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ；４，５，６：０ ７ ８ ｏｆ ９５∞０１，ＬＩＰＴＧ；０１舢ｏｌ／ＬＩＰＴＧｔｉｍｅ ｏ“ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｉｌ（ｂ）ＴｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｉｎｄｕｃｅＭ：Ｌｏｗ ｍｏｌｗｅｉ ｇｈｔ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：１．２，３：２ Ｏ ｈ ｉｎｄｕｃｉｎｇ；４，５，６：１ ０ ｈ ｉｎｄａｃｉｎｇ，７， ８．９ Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ３结果与讨论…萋ｉ女；ｉ嚣ｉ ！ ；翟ｌ ！图３－６Ｆｉｇ ３－６ ｔｈｅ０ｉｍｏｌ，ＬＩＰＴＯ，２０１３．２０ ｅｎｚｙｍｅｅｘｐｒｅｓ㈣ｉｈ诱导重组酶的表达０ １ｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｉｎｄｕｉｎｇ ｂｙｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧｉｎ ２０＂Ｃｆｏｒ２０ｈ３０．２镍柱初步她化重组酶 用各种浓度咪唑的缓冲液冲洗镍柱，收集样品进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析，结果如图３所示。７ｍ遂蕤霪囊粪粪潦鋈麓睁．二Ⅻ。一ｏｆ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ一。图３—７镍柱纯化重组酶Ｆｉｇ．３－７ Ｐｕｒｉｆｉｅａｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ｂｙ Ｈ卜ＮＴ＾ａｒｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏ吡ｔｏｇｆ８ｐｈｙ卜９：Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｍｉｄａｚｏｌｅ：５０，１００，１ ００，２００，２００，２ ００，２００，２００，３００，３００（ｍｍｏＩ／Ｌ）江南大学硕士学位论文由上图可以看出，利用Ｈｉｓ—ｔａｇ标签，使用镍柱对可溶性的外源蛋白进行了纯化， 在咪唑浓度为２００ ｍｒａｏｌ／Ｌ时得到了比较单一的重组酶，收集纯化的酶，利用气相色谱 法检测酶活。 ３．２．３气相色谱检洲重组酶活性 细胞破碎液离心，取１ ｍＬ沉淀和１ ｍＬ上清分别加入适量底物ＬＡ进行酶活反应， 阴性对照菌做同样处理。反应２４ ｈ后进行脂肪酸提取和甲酯化，气相色谱法（Ｇｃ）检测。ＧＣ检测结果显示，无ＣＬＡ特征峰出现，说明诱导后重组菌不具有亚油酸异构酶活 性，不能将底物Ｌ～异构化为ＣＬＡ。原因可能是由于在大肠杆菌中外源基因受ＩＰＴＧ的 诱导，短时间内表达大量外源蛋白，使得外源蛋白容易错误折叠，导致活性丧失。３．３亚油酿异构酶基因在乳酸克鲁雏酵母中的表达３．３．１构建亚克隆戢体ｐＧＭ＇ｒ－ＬＡＩ ＰＣＲ产物两端加Ａ，克隆入ｐＧＭ—Ｔ载体中，转化Ｅｃｏｌｉ ＤＨ５ｄ，涂靠含１６此Ｘ－ｇａｌ（５０ｍｇ／ｍＬ）和２０止ＩＰＴＧ（２０ｍ酣１ｌＬ）的氨苄（ｉ００｝ｔｅｄｍＬ）ＬＢ平板，并设计阳性和阴性对照。结果显示，插入对照片段的平板上长出的菌落全部为白色，用ｐＵＣＸ０８质粒 做的转化对照平板则长出的菌落全部为蓝色，而连接产物的平板上则长出了许多白色和 蓝色的小菌落（４℃冷藏后蓝白斑区分更加明显）。分别挑取１６个白色单菌落于含５ｍＩ．ＬＢ培养基的试管中过夜培养，提取质粒Ｄ１诅．１％琼脂糖凝胶电泳检验，如图３－５所示。Ｍｌ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ ＩＯ １ｌ １２ １３ １４ｌ，协圉３－ｇ转化子质粒核醢电泳图Ｆｉｇ．３—８ Ｅｌｅｔ ｒｏｐｈｃｒｉｓｉｓ ａｒｉａｌｙｓｉｓｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｐｌａｓｍｉｄ由图３—８可以看出，白色茁落也有未连接成功的克隆，根据质粒大小初步判定６号和 １０号管中为阳性克隆，将这两株菌继续进行菌落ＰＣＲ鉴定（圈３—９）。菌落ＰＣＲ的产物大 小和亚油酸异构酶基因（ＬＡＤ的大小基本一致，初步确定重组质粒构建成功，命名为１９３ＭＴ－ＬＡＩ。３结果与讨论圈３－９克隆载体ｐＧＭＴ－ＬＡＩ苗落ＰｅＲ检验结果Ｆｉｇ Ｍ：１０ ３－９ Ｃｏｌｏｎｙ ＰｅＲ ａｍｐｌｉｆｉｃｎｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ＾Ｉ ｇｅｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌｎ ＤＭｍａｒｋｅｒ；１，２：ＰｅＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ：一：Ｎｅｇａｔｉｖｅ重组予的鉴定有多种方法，利用ＰＣＲ技术鉴定重组子不仅快捷方便．而且准确性也 很高，是一种非常值得推广的方法。一般为了更加准确的鉴定重组子，我们会将重组菌 活化．提取质粒，选取两个酶切位点进行双酶切，根据酶切后片段太小，进一步确定目 的基因与克隆载体正确的连接。（＆）（ｂ）圈３－１０克隆裁体ｐＧＭＴ－ＬＡ］甄酶切验证Ｆｉｇ ３－１ ０ ｌｄｅｎｔｉｒｉｇａｔｉｏｎ ｏｒ ｖｅｃｆｏｒ ｐＧＭＴ－ＬＡｌ ｗｉｔｂ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ Ｍ：１０ ｏｆ（ａ）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ （ｂ）ｋｂ删＾ｍａｒｋｅｒ；ｌ，２：ｐｌａｓｍｉｄ叩耵一ＬＡＩｐＧＭＴ—ＬＡｌ ｗｌｔｈ ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎＩｄｅｎｔｉｆｉｇａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒ圉３—１０表明，双酶切得到的两个片段分别和亚油酸异构酶基因（ＬＡＤ、ｐＯＭ－Ｔ载 体大小基本一致（１．７ｋｂ和３．０ｋｂ）。将获得的阳性重组质粒送上海博尚生物公司进行测Ｊ于。江南ｔ＾＝学硕士学位论文甜６ｃＪ６ Ｇ６‘ｍＴ？川烈 、删。删枷删㈣ 枷 燃 删懈揪‰酬 础 翩㈧‰ ‰ 》 Ｍ４腓ｌ舭㈧№№＾＾§Ｔ＾ＴＧｃ搬ＴＴ６¨５图３一ｉｉ质粒ｐＧＭＴ—ＬＡＩ剥序结果Ｆｉｇ．３－１１ Ｔｈｅ ｒｅｓｏＩｔ ｏｆｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ㈣Ｉａｓｍｉｄ ｐＧＭＴ—ＬＡＩ圉３—１２ ｐＧＭＴ—ＬＡＩ测序结果与ＬＡＩ比对Ｆｉｇ ３－１２ Ｔｈｅｃｏｎｔ ｒｆｉ￥ｔｏｆ ｐｌａｓｍｌｄ ｐＧＭＴ－ＬＡＩ ａｎｄ ＬｈＩｓｃｑｕｅｎｃｅ测序结果（图３。１１）与ＬＡＩ序列经ＶｅｃｔｏｒＮＴＩ软件比对，结果如图３－１２所示，阴影 区域为碱基完全相同，可以看出重组质粒上插入的目的基因序列与ＬＡＩ序列完全一致， 没有发生碱基突变，克隆载体ｐＧＭＴ－ＬＡＩ构建成功。 在构建融合表达载体ｐＫＬＡＣｌ一ＬＡＩ时，采取了亚克隆的簧略，即先连接Ｔ载体ｔ 然后再将测序正确的目的片断从Ｔ载体上切下插入表达载体。这种方法虽然步骤较多， 但是比用ＰＣＲ产物直接连入表达载体效率要高的多。因为对ＰＣＲ产物直接进行酶切时， 酶切位点裸露或所加的保护碱基过少，使得内切酶识别困难，得不到较好的酶切效果， 而且酶切彻底与否很难通过电泳进行鉴定，故导致连接效率降低，增加测序成本。通过 在ＰＣＲ扩增产物的３’末端增加一个突出的碱基Ａ后．可以十分容易地与Ｔ载体５’端游 离的碱基Ｔ相连，从而大大简化了克隆过程。插入Ｔ载体上的目的片段很容易进行双酶 切，经电泳后便可快速鉴定。 ３．３．２构建表达栽体ｐＫＬＡＣｌ－ＬＡＩ ＰＣＲ结果（圈３－１３ａ）显示，ｌ ７ｋｂ大小处出现条带，推测为目的片段，结合图３－１３ （ｂ）的酶切验证结果，证实重组表达载体构建成功，命名为ｐＫＬＡＣＩ?ＬＡＩ。３结果与讨论鲴３—１３鉴定重组质粒ｐＫＬＡＣｌ一ＬＡＩＦｉｇ ３－１ ３ Ｉｄｃｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｐＫＬＡＣｌ一ＬＡ［（ａ）Ｉｄｅ．ｔ【ｆｉ ｃ８ｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭ：１ ０ ｋｂ ＤＮＡｐｌ ａｓｍｉｄ ｗｉｔｈ ＰｃＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓｍｒｋｅｒ；１，２ＰＣＲ（ｂ）Ｉｄｅｎｔｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＭ：１０ｐｌａｓｍｉｄｗｉｔｈ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｐｌａｓⅢｉｄ ｗｉｔｈ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｋｂ洲＾ｍａｒｋｅｒ；１．２：ｐｔｏｄｕｃｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ将连接好的重组质粒ｐＫＬＡＣｌ一ＬＡＪ转化保存在Ｅ ｃｏｌｉＤＨＳａ中，易于培养得到大量 的重组质粒，为下一步电转化重组质粒进入乳酸克鲁维酵母做准备。 ３３．３构建工程茵ｐＫＬＡＣＩ．ＬＡｌ］Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９和ｐｌＧＬＡＣｌ／Ｋｄａｃｔ／ｓ ３３．３．１质粒ｐＫＬＡＣＩ－ＬＡｌ和ｐＫＬＡＣＩ的线性化 在转化乳酸克鲁维酵母前，含目的基因的ｐＫＬＡＣｌ一ＬＡＩ必须线性化，以利于其在 Ｋ／ａｃｆｉｓ基囡组ＬＡＣ４位点处整合。这一过程包括，用Ｓａｃｌｌ或ＢｓｔＸ １酶切载体．产生 一个大于６．２ ｋｂ的表达框和一个２．８ ｋｂ的剩余ＤＮＡ片段，前者包含有ＰＬＡｃＰＢＩ、克隆ＧＧ７９９基因、锄ｄｓ筛选基因，而后者包含了ｐＫＬＡＣｌ质粒ＤＮＡ片段。为了制各完整表达片段，克隆基因中不能古有跏１Ｉ识别位点（如果用ＢｓｔＸｌ线性化。不能含有ＢｓｔＸＩ识别位点）。因为转化时只有表达片段能整合进罡ｌａｃｔｉｓ基因组，因此，内切酶酶切后，不 需从剩余的质粒ＤＮＡ中纯化表达片段。江南大学硕十学位论文ｉ 旨在表达载体ｐＫＬＡＣＩ（质粒图见附表）上，ＬＡＣ４启动子（ＰＬＡＣＡ－ｐＢＩ）的５’和３’端 被编码Ｂ一半乳糖苷酶的基因＜ＡｐＲ）和ｐＭＢＩ的复制原点所隔肝，从而使质枇能在大肠 杆菌中增殖。［【ｌａｃｔｉｓ小结合因子分泌引导序列（Ⅱ－ＭＦ）、多克隆位点（ＭＣＳ）和ＬＡＣ４ 转录终止子（ＴＴ）位于３’ＰＥＡｃ‘删的下游，还有酵母的ＰＡＤＨ２，调控着乙酰胺酶标记基 因（ａｍｄＳ）的表达。线性化的表达载体插入整合到Ｋ．１ａｃｔｉｓ自身的ＬＡＣ４启动子位点，选取载体和酵母基因组结合点处序列为整合鉴定ＰＣＲ引物ｎＰｒｉ一１／ＬｑｔＰｒｉ－２，鉴定是舌重组整合成功。ＹＣＢ含有除氮源外置ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９细胞生长所需的其他营养物质，只有重组整合 子才可以利用载体ｐＫＬＡＣｌ中的ａｍｄＳ基因表达产物一乙酰胺酶，将乙酰胺降解为氨后， 利用乙酰胺作为氨源口”，正常生长。 线性化载体电转化宿主菌乳酸克鲁维酵母ＧＧ７９９后，涂布含５ ｍｍｏｌｌＬ乙酰胺的 ＹＣＢ选择性培养基。对能在ＹＣＢ选择平板上生长的单苗落扩大培养至ＯＤ咖约为１３?１ ５时取适量进行基因组提取（试剂盒提供方法，ＴｌＡＮａｍｐＹｇａｓｔＤＮＡＫｉｔ），以提取的基因 组为模板，用引物ＩｎｔＰｒｉ—ＩＢｎｔＰｒｉ一２进行ＰＣＲ扩增，得到大小为１．９ｋｂ的条带，如图３－１２ 所示。３结果与讨论固３－１ ５ ＤＫＬＡＣＩ—ＬＡＩ／￡ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９和ｐＫＬＡＣＩ／ｚＦｉｇ ３－１ ５ Ｉ ｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｌｅａｔｉｏｎ ｏｆｌｎｃｔｉｓＧＧ７９９的整合鉴定ＧＧ７９９ ａｎｄｎＫＬＡＣＩ—Ｌ＾Ｉ他ｌ口ｃｔｉｓｏｆＭ：１０ｋｂＤＮＡ№ｒｋｅｒ，ＩⅧＩＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ能ＬＡＣｌ／ＩＬ ｌｅｃｔ，茹Ｇ７９９ｔ ｇｒａＩｅｔｄｉｄｅｎｔｉｆｉ ｃａｔｉｏＨ ｏｆｐＫＬＡＣＩ／ｆ，目ｃｔｉｓＧＧ７９９；２：ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｐＫＬＡＣＩ—ＬＡＩ，￡ｌｓｃｔＪｓ ＧＧ７９９结果表明，质粒ｐＫＬＡＣｌ和ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＩ线性化产物成功整合到酵母基因组上， 工程菌株ｐＫＬＡＣｌ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９和ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＵｌＬｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９构建成功。ＰＣＲ扩增ＬＡＩ检验ｐＫＬＡＣｌ－ＬＡｌ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９重组菌，结果见图３．１６。Ｍ＋ｌ ２ ３４．２＿０胁 １ｊ曲图３＝１Ｆｉ ｇ Ｍ：１ ０ ｋｂ６３－１６ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐＫＬＡＣＩ—ＬＡＩ／Ｌ ｌａｃｔｉｓ ６６７９９ ｂｙ ＰＣＲｃｏＨｔｉｒｏｌ １—４：ＰＣＲ２３７曲ＰＣＲ检验ｐＫＬＡＣＩ—ＬＡＩ／￡ｌａｃｔｉｓＧＧ７９９ＤＮ＾Ｍａｒｋｅｒ：＋：Ｐｏｓｉｔｉｖｅｐｚｏｄｕｃｉｓ；一：ＮｅｇａｔｉｖｅｃＯｎｔｒｏＩ由图３一１６可知，ｐＫＬＡＣｌ一ＬＡｌ／Ｋ．１ａｃｔｉｓＧＧ７９９重组菌中存在目的片段ＬＡＩ，表明亚 油酸异构酶基因被克隆入乳酸克鲁维酵母。３．３．４ＳＤＳ－ＰＡＧＥ检测重组亚油酸异构醇的表达３．３．４．Ｉ发酵时间的初步确定 在乳酸克鲁维酵母中，外源基因被整合到宿主菌基因组ｔ进行组成型表达，根据资 料报道，亚油酸异构酶蛋白大小约为６７ ｋＤａ。ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析结果显示，与对照菌ｐＫＬＡＣｌ／Ｋ．１ａｃｔｉｓＧＧ７９９相比，重组菌ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＵ置ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９的菌液在６６ ｋＤａ附江南大学硕十学位论文近有特异性条带出现，与预期的亚油酸异构酶蛋白分子量大小相符。另外，由图中可以 看出，随着培养时间的增长，发酵液蛋白的表达量逐渐增大，经多次反复验证，发现４ｄ发酵液蛋白量较为理想。故研究重组菌株发酵液上清中是否有重组蛋白时选择的发酵时间为４ｄ。图３－１ ７Ｆｉｇ ３－１ ７ ＳＯＳ－ＰＡＧＥａｆ门ｓＳＯＳ—ＰＡＧＥ分析不同发酵时间的蛋白表达量ｏｆ Ｐｒｏｔｃｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｃｎｔ ｆｃＴｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔｉⅢｅａｒｉａｌｙｓｉＭ：Ｌｏｗｍｏｌｅｃｕｌ ａｎｄｗｅｉｇｈｔ ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：ＳＩ．ＢＩ：２ ｄ ｂｒｏｔｈ ｏｆ ｐＫＬＡＣｌ—ＬＡＩ，￡ｌａｃｔｌｓ ＧＧ７９９ｐＫＬＡＣｌ／６ ｌａｃｔｉｓ＃６７９９；Ｓ２．Ｂ２：４ ｄ ｂｒｏｔｈ ｏｆ ｐＫＬＡＣＩ—Ｌ＾Ｉ／６ ｌａｃｔ血ａＧ７９９ ａｎｄｐＫＬＡＣＩ／Ｋ．ＪａｃｔｉｓＧＧ７９９３．３．４．２重组蛋白的分泌表达 在乳酸克鲁维酵母重组菌株内，编码有叶ＭＦ结构域和目的重组蛋白质的ＤＮＡ与酵 母基因组整台，ＰＬＡＣ４．ＰＢＩ启动子＿｜Ｊ爿控表达。一旦融合蛋白质开始表达，位于小ＭＦ上 的信号肽就会指导融合蛋白质转运到内质网（ＥＲ）膜上，其上的信号肽酶（ＳＰ）便将 信号肽切除。然后分泌小泡（环形）将融合蛋白质转运至高尔基体，Ｋｃｘ蛋白酶在此将 ａ－ＭＦ结构域切除，并释放成熟的目的蛋白。随后，日的蛋白通过分泌小泡运输到质膜 （ＰＭ），ｔ－，从而实现外源蛋白的胞外分泌岬Ｊ。 由于芷ｌａｃｔｉｓ表达的重组蛋白的分泌水平随蛋白不同而异，因此，有必要分析培养 液中是否含有所分泌的目的蛋白。对于高水平分泌的蛋白（如＞１０ｍｇ／Ｉ）．用末浓缩的培 养液上清经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ检测，可观察分泌情况。由图３－１７可以看出，目的蛋白条带较 淡．表明发酵液中重组蛋白量较少，所以接下来研究发酵液上清中蛋白时采用预冷丙酮 将发酵液上清进行浓缩两倍，之后进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析。冷丙酮浓缩蛋白方法：取发酵 液上清６０ ｕＬ，加入１０倍．２０＇Ｃ预冷的丙酮（６００ｔｔＬ），充分振荡，冰上沉淀１０℃．１３０００ ２离心５ｍｉｎ。４ｍｉｎ，弃上清．将沉淀进行自然干燥，加入１ｘＳａｒｎｐｌｃｂｕｆｆｅｒ，进行ＳＤＳ．ＲＡＧＥ，结果如图３．１８。ｒ—ｌ一ｊ二＿＿叠ｓｕｐｅｒｎａ ｒａｎｔ ｏｆ４３ ０３ｌ ０囤３一１８ ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析４ ｄ发酵液上清中的重组蛋白Ｆｉ ｇ ３一ＩＥ ＳＤＳ—ＰＡＧＥａｒｉａＩ ｙｓｉｓｏｆ ｔｈｅ ｈｅ ｒｅｔｏＩｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｉｎ ４ ｄ ｆｃｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｕＤｅｒｎａｒａｎｔＭ：Ｌｏｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉ ｇｈｔｓｔａｎｄａｒｄｐｒｏｔｅｉｎ；Ｓ１．Ｓ２：４ ｄ ｆｅｒａｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｄ ｆｅｒｓｅｎｔａｔｌｏｎｏｆｐＫＬＡＣｌ—ＬＡＩ／Ｌ ｌａｃｔｉｓ００７９９：虬．Ｅ２：４ｐＫＬＡＣＩ｝Ｅｌａｃｔ／ｓ ａａ７９９由４ ｄ发酵上清液浓缩２倍后ＳＤＳ．ＰＡＧＥ分析圈可以看出，发酵上清液中分泌表达 的蛋白种类非常少，与对照菌ｐＫＬＡＣｌ／ｌｔｌａｃｔｉｓＧＧ７９９相比，重组菌ｐＫＬＡＣＩ．ＬＡｌ／ｌ【ｌａｃｔｉｓＧＧ７９９发酵上清液在６６ ｋＤａ上面有明显的特异性条带出现，即为重组表达的亚油酸异 构酶。由此可见，目的基因ＬＡＩ在乳酸克鲁维酵母中表达成功，并被分泌到胞外。 ３．３．５气相色谱检测重组亚油酸异构醇活性 ３．３．５．１标准品ＣＬＡ和ＬＡ保留时闻的确定 为了排除气相色谱仪和实验操作可能造成的干扰，共做六个平行实验来确定ＣＬＡ 标样和底物ＬＡ的保留时间。为减小操作中的操作误差，选择自动进样处理。囤３一１９共轭亚油酸标样Ｇｃ图Ｆｉｇ ３ １９ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｎｏｌｃｉ ｃ ８８９ａｃｉｄ ｓｔａｎｄａｒｄｓａｍｐｌｅ图３－１９中结果显示，ＣＬＡ标准品的出峰时间在２９ｍｌｎ，图中有两个明显的峰江南大学硕士学位论文型，分别为ｅ９，ｔｌ １ＣＬＡ和ｔ１０，ｃ１２ＣＬＡ，对应峰面积为１５６１９４．０和１５４５０７．７，分别占 ５０．２７％和４９．７３％。图３—２０底物亚油酸标样Ｇｃ图Ｆｉｇ．３—２０ ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆ １ ｉｎｏｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｓａｍｐｌｅ图３．２０中底物ＬＡ标准品的气相分析结果显示，ＬＡ标样出峰时的保留时间为２１．５４４ｍｉｎ。３．３．５．２气相色谱检测重组亚油酸异构酶活性对照菌ｐＫＬＡＣｌ／／【ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９和重组菌ｐＫＬＡＣｌ－ＬＡＩ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９发酵液催化 底物反应后气相色谱检测结果如图３－２１。（ａ）对照茵ｐＫＬＡＣｌ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９发酵液催化ＬＡ反应ＧＣ图３结果与讨论（ｂ）重组菌ｐＫＬＡＣｌ—ＬＡＩ／丘ｌａｃｔｉｓ ＧＧ７９９催化ＬＡ反应ＧＣ图图３－２１气相色谱（ＧＣ）检测重组酶活性Ｆｉｇ．３—２１ ＧＣ ｄｅｔｅｃｔ ｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅａｃｔ ｉｖｉｔｙ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ（ａ）ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｂａｃｔｅｒｉａ（ｂ）ｇａｓ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ ｏｆｂａｃｔｅｒ ｉａ结果表明，对照菌ｐＫＬＡＣｌ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９培养液催化底物ＬＡ反应后，产物中没 有明显的ＣＬＡ生成，表明该菌株没有产生亚油酸异构酶。而由图３．２ｌ中（ｂ）图可以 看出，重组菌ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＩ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９培养液催化ＬＡ反应后，产物在保留时间为３０．３０４ｍｉｎ时出现一明显的峰型，对照标准品证实为ＣＬＡ。证明ｐＫＬＡＣｌ。ＬＡＩ／Ｋ．１ａｃｔｉｓＧＧ７９９培养液可以将底物ＬＡ异构化为ＣＬＡ。该ＣＬＡ峰峰面积为５６１１．３，在保留时间 为２１．３２０ ｍｉｎ处剩余ＬＡ的峰面积为１５９７６．４。若不考虑产物提取过程中损失的ＬＡ，约 有２６％的ＬＡ被异构化为ＣＬＡ。 上述气相色谱结果表明，重组菌ｐＫＬＡＣｌ．ＬＡＩ／Ｋ．１ａｃｔｉｓ ＧＧ７９９培养液中存在可以将 底物ＬＡ异构化为ＣＬＡ的物质，即亚油酸异构酶，从而进一步证实了亚油酸异构酶在乳 酸克鲁维酵母中克隆表达成功。亚油酸异构酶基因在乳酸克鲁维酵母中分泌表达的实现，避免了表达产物被细胞内蛋白酶降解，为进一步将亚油酸异构酶基因引入食品级微 生物内生产ＣＬＡ，从而开发保健功能性食品奠定了良好的理论和实验基础。３．４亚油酸异构酶基因在乳酸乳球茵中的表达３．４．１构建亚克隆载体ｐＧＭＴ－ＬＡＩＬ 以质粒ｐＧＭＴ－ＬＡＩ为模板，ｐｒｉＬＡＩＬ．Ｕ／ｐｒｉＬＡＩＬ．Ｄ为引物，进行ＰＣＲ扩增，产物经 加Ａ反应后连接Ｔ载体，转化大肠杆菌，经蓝白斑筛选，ＰＣＲ验证和酶切鉴定，构建亚克隆ｐＧＭＴ－ＬＡＩＬ／Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５Ｑ。江南大学硕士学位论文圈３－２２ ＰＣＲ辁验口ＧＭＴ＇ＬＡＩＬＦｉｇ ３－２２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＧＭＴ。ＬＡＩＬ ｂｙ ＰＣＲｒｔ＇］ｉｏｆ测序比对（部分）结果：图３—２３Ｆｉｇ．３—２ ３ ＴｈｅｐＧＭＴ—ＬＡＩＬ测序结果与ＬＡＩ出对ｐｌａ ｓｍｌｄ ｐＧＭＴ—ＬＡＩＬ＆ｎｄ ＬＡＩ ｓｅｑｕｅｎｃｅｇｏｎｔｆａ ｓｔ测序结果与ＬＡｌ序列经ＶｅｃｔｏｒＮＴｌ软件比对，结果如图３—２３所示，阴影区域为碱基 完全相同，可以看出重组质粒上插入的目的基因序列与ＬＡＩ序列完全一致，没有发生碱 基突变，成功构建ｐＧＭＴ－ＬＡＩＬ。 ３．４．２构建表达栽体ｐＭＧ３６ｅ－ＬＡＩ 提取质粒ｐＭＧ３６ｃ和ｐＧＭＴ－ＬＡＩＬ，用限制性内切酶ＳａｃＩ和Ｈｉｎｄ １１１分别双酶切质 粒口ＭＧ３６ｅ和ｐＧＭＴ－ＬＡＩＬ，３Ｔ＇Ｃ下反应３ ｈ。核酸电泳胶回收酶切产物，将ＬＡＩ克隆至 ｐＭＧ３６ｅ，转化大肠杆菌ＤＨ５ｃｔ，利用红霉素进行筛选，构建表达载体ｐＭ０３６ｃ－ＬＡＩ。 实验中发现乳酸菌重组质粒ｐＭＧ３６ｅ—ＬＡＩ不稳定，在大肠杆菌中数次传代后质粒消 失，不适用于继续研究。 有相关资料报道质粒的不稳定分为ＤＮＡ片段发生重组、缺失或插入的结构性不稳 定和细胞分裂时质粒未进入子细胞的分离性不稳定ｐ２’７”。 质粒的稳定性受到宿主和质