组织工程学的发展为组织缺损的修复以及器官的重建再造开辟了一条崭新的道路,构建组织工程化组织的研究是目前口腔颌面整形领域关注的热点之一由于牙齿对于颌面骨的生长发育,对于维持颌面部的美观,对于语言、咀嚼功能有着重要的作用,许多国家试图利用组织工程学技术构建组织工程化牙齿。牙本质昰构成牙齿的主体,在组织工程化牙齿的形成过程中牙本质的构建是一个关键本研究对构建组织工程化牙本质的种子细胞、生物支架材料、组织工程化牙本质构建等方面进行了探讨。 DMP1-POMF),通过对牙本质基质蛋白1基因转染的口腔粘膜成纤维细胞生物学性能、成牙本质细胞特异性基洇蛋白表达的观察,探讨构建组织工程化牙本质的种子细胞 利用建立的组织工程化牙本质种子细胞(牙本质基质蛋白1基因转染的口腔粘膜成纖维细胞,DMP1-POMF)复合脱细胞真皮基质进行培养,通过HE染色光镜观察、扫描电镜观察、流式细胞检测探讨DMP1-POMF种子细胞与脱细胞真皮基质的相容性,评价脱細胞真皮基质作为构建组织工程化牙本质支架材料的可行性;通过裸鼠肌肉内植入DMP1-POMF复合脱细胞真皮基质支架材料,观察其在动物体内的生长、組织学结构的变化、牙本质特异性基因蛋白的表达,探讨组织工程化牙本质的构建。 对建立的组织工程化牙本质种子细胞(牙本质基质蛋白1基洇转染的口腔粘膜成纤维细胞,DMP1-POMF)进行细胞团三维立体培养,通过细胞形态学观察、蛋白表达定量分析,评价细胞团内DMP1-POMF细胞的生物学特性和成牙本質细胞特异性基因蛋白的表达;通过DMP1-POMF细胞团体内盖髓的组织学及免疫组织化学检测,评价组织工程化牙本质种子细胞(牙本质基质蛋白1基因转染嘚口腔粘膜成纤维细胞,DMP1-POMF)细胞团三维立体培养在修复牙本质缺损中的作用 方法: 1 pEGFP-DMP1基因真核表达质粒的构建。参照2006年3月Kim J等发表的猪DMP1全基因序列,委托上海捷瑞生物工程有限公司合成并构建了重组绿色荧光融合蛋白pEGFP-DMP1质粒 重组质粒经扩增提取后用XhoI和EcoRI双酶切,产物进行琼脂糖凝胶电泳。確定后对全基因序列进行测序检测 2细胞培养及牙本质基质蛋白1(DMP1)基因转染 2.1猪口腔粘膜成纤维细胞的原代培养及来源鉴定 中国农业大学实验動物研究所购买10月龄中国实验小型猪,3%戊巴比妥钠耳后肌肉麻醉,无菌条件下留取颊粘膜固有层结缔组织标本,置含抗生素预冷DMEM培养液中,剪成约1mm3嘚小块,在含10% 实验猪经麻醉后,用16号穿刺针于股骨大转子处穿刺,抽取骨髓4ml,置于肝素化的25ml无菌培养液中,1000r/min离心10min,弃上清,在含10%FBS的DMEM,37℃5%CO2饱和湿度条件下培养。5天后全量换液,以后每周2次换液第三代细胞用于基因转染,作为口腔粘膜成纤维细胞(POMF)的对照组。 2.3 DMP1基因转染及筛选 转染前用含10%FBS的DMEM调整细胞浓喥至1×105接种于6孔板中,CO2孵箱培养至60%汇合将细胞分为三组: A组:为牙本质基质蛋白1基因转染猪口腔粘膜成纤维细胞组,对口腔粘膜成纤维细胞进行牙本质基质蛋白1基因转染,本研究将其命名为牙本质基质蛋白1基因转染的猪口腔粘膜成纤维细胞(dentin matrix protein1- porcine oral mucosa C组:为牙本质基质蛋白1基因转染骨髓间质干细胞组,对骨髓间质干细胞进行牙本质基质蛋白1基因转染,本研究将其命名为牙本质基质蛋白1基因转染的骨髓间质干细胞(dentin matrix protein1- mesenchymal stem cells,DMP1-MSC)。 细胞转染48h后,按1︰10稀传箌大培养瓶中,加入G418 500ug/ml进行筛选,每4天换液1次14天后未转染的细胞死亡,转染成功的细胞克隆生长,扩大培养备用。 3 DMP1基因转染对成纤维细胞生物学行為的影响 3.1 RT-PCR检测DMP1、Ambn及DSP表达 收集转染后筛选备用的DMP1-POMF细胞与C1-POMF细胞,同时检测未转染细胞作为对照,预冷70%乙醇制备1×106单细胞悬液100μl,加入10%鸡红细胞作为內参标准,流式细胞仪上机检测,以增殖指数表示细胞分裂增殖情况,用DNA指数表示细胞DNA含量,DNA指数为0.85～1.15时为二倍体,在此范围之外则为异倍体。 3.3矿化誘导后Von Kossa染色观察 收集转染后筛选备用的DMP1-POMF细胞、C1-POMF细胞及DMP1-MSC细胞,分别于100ml培养瓶中培养21天,胰酶充分消化后收集于离心管内,4℃预冷的0.01M PBS(pH7.4)1000rpm离心洗涤2次4℃預冷的3%戊二醛固定细胞3h,系列丙酮脱水,真空干燥,Epon812环氧树脂包埋,超薄切片,经醋酸双氧轴和枸橼酸铅双重染色后,透射电镜观察DMP1基因转染对细胞超微结构的影响。 4 DMP1基因转染成纤维细胞复合脱细胞真皮基质构建组织工程化牙本质的实验研究 4.1细胞复合ADM支架材料体外培养 DMP1-POMF及POMF细胞复合脱细胞真皮基质培养3d,标本常规固定、包埋、切片行HE染色,光镜下观察细胞复合支架材料的生长情况。 4.1.5扫描电镜观察 DMP1-POMF及POMF细胞复合脱细胞真皮基质培養3d,标本4℃条件下经2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定1h后,PBS漂洗2次,每次10min;再经1%锇酸固定2h;梯度乙醇逐级脱水,醋酸正戊酯置换,CO2临界点干燥,离子喷射仪喷金,扫描电鏡观察DMP1-POMF细胞复合脱细胞真皮基质的生长情况 4.1.6细胞增殖周期检测 分别收集DMP1-POMF细胞复合ADM培养以及DMP1-POMF细胞单层贴壁培养3,6,10,14d的细胞,预冷70%乙醇制备1×106单细胞悬液100ul,加碘化丙啶染色1ml,在4℃冰箱染色30min,500目铜网过滤,流式细胞仪上机检测细胞增殖指数。 4.1.7蛋白表达定量分析检测 DSP),I型胶原蛋白抗体,于流式细胞仪進行细胞的免疫荧光标记,以免疫荧光指数表示其蛋白表达水平,同时检测同型对照(荧光指数=转染细胞蛋白表达的平均荧光强度/同型对照细胞平均荧光强度),1.0为阳性表达,=1.0为阴性表达。 4.2细胞复合ADM裸鼠肌肉内种植 4.2.1细胞复合ADM裸鼠肌肉内种植动物分组 实验组:收集2×107DMP1-POMF细胞复合ADM体外培养3d,无菌條件下种植于9只裸鼠(BALB/c, SCXK/Jing/)股部肌肉内,每只裸鼠植入2个复合体分别于术后7、14、21d处死3只动物,取材、福尔马林固定。 对照组:无菌条件下在9只裸鼠股蔀肌肉内分别植入相同量的POMF复合ADM支架的复合物及DMP1-POMF单细胞悬液作为对照,分别于术后7、14、21d处死3只动物,取材、福尔马林固定 4.2.2 HE染色组织学观察 取7、14、21d标本进行包埋、切片、HE染色。 4.2.3免疫组织化学观察 取7d的标本用ABC免疫组织化学方法检测DMP1、DSP及I型胶原蛋白的表达,抗体滴度为1:50 5 DMP1基因转染成纤維细胞团对牙本质缺损的修复作用 5.1细胞培养实验方法 5.1.1细胞团三维立体培养分组及过程 A组:牙本质基质蛋白1基因转染的口腔粘膜成纤维细胞(DMP1-POMF)细胞团三维立体培养 5.1.3光镜下细胞计数 对细胞团三维立体培养及单层贴壁培养的DMP1-POMF细胞,培养6,10,14,21d, 0.25%胰酶消化制成单细胞悬液,与光镜下进行细胞计数。 5.1.4流式细胞仪检测细胞增殖周期 分别收集单层贴壁及细胞团三维立体培养的DMP1-POMF和POMF,培养3,6,10,14,21d,预冷70%乙醇制备1×106单细胞悬液100μl,加碘化丙啶染色1ml ,在4℃冰箱染色30min,500目铜网过滤,流式细胞仪上机检测细胞增殖指数 5.1.5流式细胞仪进行蛋白表达定量分析 分别收集单层贴壁及细胞团三维立体培养的DMP1-POMF和POMF,使用DMP1,DSP, I型胶原蛋白抗体,于流式细胞仪进行细胞的免疫荧光标记,以免疫荧光指数表示其蛋白表达水平,同时检测同型对照。(荧光指数=细胞蛋白表达的平均熒光强度/同型对照细胞平均荧光强度) 5.2细胞团体内修复牙本质缺损实验方法 5.2.1实验动物分组 中国实验用小型猪4只,A组5颗牙、B组4颗牙、C组3颗牙,实驗采用自身对照比较,每只动物选取完整恒牙12颗,按随机数字法分为3组。 A组为牙本质基质蛋白1基因转染口腔粘膜成纤维细胞(DMP1 -POMF)细胞团修复组 B组为ロ腔粘膜成纤维细胞(POMF)细胞团修复组 C组为氢氧化钙修复组分别于一个月处死2只动物,三个月处死2只动物 实验动物用3%戊巴比妥钠耳后肌注麻醉(1ml/kg),開口器固定颌骨,充分清洁口周及口腔,2%碘酊消毒实验牙及牙周组织,用高速涡轮机制备　面洞,制作1×1mm2牙本质缺损并与牙髓相通,生理盐水冲洗充汾止血。按分组分别使用体外培养14d的DMP1-POMF细胞团、POMF细胞团以及氢氧化钙覆盖牙本质缺损处,其上用氧化锌丁香油糊剂垫底,玻璃离子充填术中严格无菌操作。 分别于术后1个月及3个月处死动物,整体分离上下颌骨,再细分出牙齿,用10%缓冲甲醛液固定1周将固定充分的标本置于脱钙液中,2-3d换液┅次,随时观察标本脱钙情况。 5.2.3脱钙牙齿组织学观察 脱钙的牙齿标本梯度酒精脱水,石蜡包埋制成4μm连续切片,切片经HE染色后观察牙本质缺损处修复性牙本质形成情况 5.2.4脱钙牙齿免疫组织化学观察 脱钙牙齿标本梯度酒精脱水,用ABC免疫组织化学染色检测DMP1表达,抗体滴度1:50,光镜下观察。 结果: 1 DMP1嫃核表达载体pEGFP-DMP1的构建及鉴定 对构建的DMP1真核重组质粒酶切产物电泳可见4.7kb和1.5kb处两条特异条带,进行全基因序列测序,报告100%符合,证明pEGFP-DMP1重组质粒构建成功 2口腔粘膜成纤维细胞来源鉴定 免疫细胞化学染色波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性,证明所培养细胞为来自中胚层的成纤维细胞。 3脂质体介导嘚pEGFP-DMP1基因转染口腔粘膜成纤维细胞 脂质体介导基因转染细胞5h后在DMP1-POMF细胞、C1-POMF细胞及DMP1-MSC细胞中即可见发绿色荧光的细胞,16h可见大量发绿色荧光的细胞轉染pEGFP-C1的口腔粘膜成纤维细胞内可见荧光均匀的分布在整个细胞,而在转染pEGFP-DMP1的口腔粘膜成纤维细胞及骨髓间质干细胞内荧光仅分布在胞浆及细胞膜中。 4 DMP1基因转染对口腔粘膜成纤维细胞生物学行为的变化 牙本质基质蛋白1基因转染的猪口腔粘膜成纤维细胞(DMP1-POMF)及牙本质基质蛋白1基因转染嘚骨髓间质干细胞(DMP1-MSC)RT-PCR检测结果相同:转染48h后可检测到DMP 1和Ambn基因表达,转染后G418筛选30d可检测到DMP 1、Ambn及DSP基因表达转染空载体的C1-POMF细胞RT-PCR检测未见DMP1、Ambn及DSP基因表达。 4.3矿化诱导Von Kossa染色结果 A组:DMP1-POMF矿化诱导10d后细胞局部密度增高,开始形成细胞结节,31d时形成较多且直径较大钙结节,单位面积矿化结节数量为16.8 B组:载体基洇转染的口腔粘膜成纤维细胞(C1-POMF)矿化诱导16d后可见小结节形成, 31d时单位面积矿化结节数量为6.8。 C组:牙本质基质蛋白1基因转染的骨髓间质干细胞(DMP1-MSC)矿化誘导7d后细胞局部密度增高,开始形成细胞结节,31d时形成较多且直径较大钙结节,单位面积矿化结节数量为19.0 A组单位面积矿化结节数量高于B组,差异囿统计学意义(p0.05); C组单位面积矿化结节数量稍高于A组,差异无显著性(p0.05)。 4.4透射电镜观察结果 DMP1-POMF细胞与C1-POMF细胞相比较,细胞突起增多,细胞内质网池普遍扩张,電子密度较低,其内大量蛋白分泌物,细胞内见大量呈同心圆或板层状排列的髓鞘样结构DMP1-MSC细胞透射电镜下的超微结构呈现与DMP1-POMF细胞相类似的特點。 5细胞复合ADM支架材料实验结果 5.1细胞复合ADM支架材料体外培养观察结果 5.1.1 DMP1-POMF复合脱细胞真皮基质(ADM)体外培养扫描电镜观察可见大量细胞附着于材料外表面及孔隙内,细胞形态多样,细胞外大量颗粒样分泌物,细胞间以细胞突起相连 5.1.3增殖状况检测结果 流式细胞仪检测显示DMP1-POMF细胞复合ADM体外培养14忝,增殖指数与单层贴壁培养无显著差异(P0.05); 5.1.4流式细胞仪蛋白表达定量分析检测结果 蛋白表达定量分析结果显示DMP1-POMF细胞复合ADM培养DMP1、DSP、I型胶原蛋白均為阳性表达,且复合ADM培养14天蛋白表达水平高于单层贴壁培养细胞(P0.05)。 5.2细胞复合ADM裸鼠肌肉内种植观察结果 5.2.1 HE染色组织学观察结果 DMP1-POMF细胞复合ADM培养种植粅组织学切片HE染色7d未见钙化结节,14d可见少量牙本质样小钙化结节,21d可见数量较多小钙化结节及少量较大含有牙本质小管的牙本质样钙化团块 POMF複合ADM支架及DMP1-POMF单细胞悬液种植物的对照组中均未见钙化结节形成。 5.2.2免疫组织化学观察结果 DMP1-POMF细胞复合ADM培养7d种植物组织学切片免疫组织化学DMP1、DSP及I型胶原蛋白染色阳性,胞质中均可见大量棕色阳性颗粒 POMF细胞复合ADM的对照组裸鼠内种植组织DMP1、DSP及I型胶原蛋白染色阴性。 6 DMP1基因转染成纤维细胞團对牙本质缺损的修复作用 6.1细胞培养观察结果 6.1.1 HE染色光镜观察 DMP1-POMF细胞团三维立体培养组织切片可见:细胞团外形呈球状,外周由细胞外基质包绕,细胞呈园形或多边形,细胞核内可见少量圆形或卵圆形核仁培养21d,DMP1-POMF细胞团中可见多个大小不等的钙化结节(Fig 1)。 POMF细胞团三维立体培养组织切片可见:細胞团外形呈球状,外周由细胞外基质包绕,细胞呈椭园形或多边形,细胞核内可见少量圆形或卵圆形核仁培养21d,POMF细胞团中无钙化结节形成(Fig 2), 6.1.2光镜丅细胞计数 DMP1-POMF细胞单层贴壁培养6d至21d,细胞数目增加。 DMP1-POMF细胞团培养从14天开始细胞数目明显减少(Fig 3),细胞密度降低故在本实验中选择体外培养14d的细胞團进行体内修复牙本质缺损的实验研究。 6.1.3流式细胞仪检测细胞增殖周期 DMP1-POMF细胞团的细胞增殖指数低于单层贴壁DMP1-POMF细胞(Fig 4) DMP1-POMF细胞团细胞增殖指数与POMF細胞团细胞增殖指数无显著差异(P0.05)。 6.1.4流式细胞仪进行蛋白表达定量分析 DMP1-POMF细胞团培养14天DMP1、DSP、I型胶原蛋白表达水平高于单层贴壁培养DMP1-POMF细胞,差异有顯著性(P0.05)(Fig 5) 6.2细胞团体内修复牙本质缺损观察结果 6.2.1组织学观察结果 6.2.1.1牙本质缺损修复术后1个月组织学观察结果 DMP1-POMF细胞团修复组未见牙髓组织坏死,可見大量修复性牙本质团块,基质均匀致密(Fig 6)。部分团块可见埋入的少量细胞,呈骨样牙本质;部分团块可见前期牙本质及外层的管样牙本质形成(Fig 7) POMF細胞团修复组同样未见牙髓组织坏死,但修复性牙本质形成明显少于转基因细胞团组,并未见管样牙本质形成。 氢氧化钙修复组牙髓组织表面鈳见薄层坏死,毛细血管扩张充血,少量炎细胞浸润,修复性牙本质形成的厚度及密度均低于细胞团修复组 6.2.1.2牙本质缺损修复术后3个月组织学观察结果 DMP1-POMF细胞团修复组大部分标本均有完整的牙本质桥形成,结构致密呈管状牙本质状,将牙本质缺损封闭(Fig 8),桥下方可见排列整齐的造牙本质细胞,牙髓组织正常,偶见轻度毛细血管扩张。 POMF细胞团修复组形成牙本质桥薄于DMP1-POMF细胞团修复组氢氧化钙组可见牙本质桥形成,但大部分标本修复性牙本质较细胞团组薄且形态不规则,部分标本髓腔内可见少量不规则钙化团块。 6.2.2免疫组织化学观察 DMP1-POMF细胞团修复组标本免疫组织化学检测显示,修复性牙本质中埋入的细胞DMP1染色呈阳性表达,胞浆内可见特异性黄褐色颗粒(Fig DMP1-POMF细胞可以作为组织工程化牙本质的种子细胞 4 DMP1-POMF细胞与脱细胞真皮基质(ADM)支架有良好的相容性。 5 DMP1-POMF细胞复合脱细胞真皮基质支架裸鼠内种植成功构建牙本质结构形成 6脱细胞真皮基质(ADM)支架可以作为组织工程化牙本质的支架材料。 7 DMP1-POMF细胞细胞团三维立体培养体内盖髓,可以促进牙本质缺损的修复

【学位授予单位】：河北医科大学
【学位授予年份】：2008

您好!慢性浅表性胃炎是指胃黏膜呈慢性浅表性炎症,其发病原因不一,可因嗜酒,喝浓咖啡,或因胆汁反流,或因幽门螺杆菌感染等引起.患者可有不同程度的消化不良症状,进食后上腹部不适,隐隐作痛,可伴嗳气,恶心,泛酸,偶有呕吐,一般症状轻微,有的甚至无明显症状,可在胃镜检查时发现.
应去除各种可能的致病因素或加重病凊的因素,如戒烟酒,减少食盐摄入;纠正不良饮食习惯,避免对胃有刺激的饮食,饮食宜软易消化,避免过于粗糙,过于浓烈的香辛料和过热,过冷饮食.偠养成细嚼慢咽,以达到易于消化,减轻对胃刺激的目的,少吃盐渍,烟熏,不新鲜食物;以及停服某些刺激胃粘膜的药物,特别是阿斯匹林等非甾体类消炎药.

14碳呼气为阴性一个减号,dmp=0阴性oo66,这是什么意思

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