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细胞消化知识你知道多少？
无论是原代细胞还是细胞系或癌细胞，细胞长满瓶后，需要对细胞进行传代或将细胞收集起来用作其他实验。贴壁生长的细胞必须要做的一步便是消化过程，下面便对细胞消化、中和、洗涤等过程做个简单介绍。
1、绝大部分细胞消化的时候是只需用润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留胰酶附着在细胞表面在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，这样连续传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。
2、什么算是消化好了呢？不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙状移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，就应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性。细胞只要能从基质上脱离下来，这个时候即使是成片的，吹打不超过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间。
3、EDTA的作用。许多人不用胰酶，只用EDTA，或者用trypsin/EDTA联合作用。这里要明白，trypsin切割细胞外基质的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合Ca2+，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加温和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，就是这个道理。一般不要试图延长消化时间（如果10min还消化不彻底的话），而应该想其它办法。针对如上情况，美国ScienCell公司专门配制了胰酶浓度为和胰酶浓度为。
4、PBS洗涤。消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为Serum含有抑制trypsin的蛋白。对于一些难消化的细胞，可以配制不含Ca2+、Mg2+的PBS，因为这些离子也会抑制trypsin的活性。美国ScienCell公司也有配好的不含Ca2+、Mg2+的PBS，即）。
5、胰酶的中和。细胞消化完之后，因为残留的胰酶对细胞有伤害作用，需要将胰酶中和掉，就需要用到胰酶中和液。美国ScienCell的,含有10%的胎牛血清作为胰酶抑制剂和细胞保护剂。
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适用于，无师兄、师姐、非细心、单独开展的实验者对一般细胞 0.25% 胰酶(胰蛋白酶，Trypsin)配方：100ml PBS,0.25g胰酶步骤：1先配100mlPBS(1000mlPBS:8.0gNaCl,3.4785gPO4HNa2?12H2O/2.9gPO4HNa2 ,0.2gKCl,0.2gPO4H2K溶于1000ml蒸馏水)2 称胰酶0.25g3 加入PBS中，低速搅拌 〈4h冰浴中,或者4℃过夜低速搅拌0.5h冰浴中4 调PH7.45 仍在冰浴中6 过滤，分装，-20℃保存，4℃短期内用完tip:低速很重要，机械搅拌对酶是一种冲击，如果起沫，酶就变性了。低温，防止酶失活对难消化的细胞：在上述配方中，加入0.02g的EDTA(0.02%)tip:因为EDTA可以络合Ca2+，增加消化效力
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从引物设计到实验全程服务24孔板的贴壁细胞每孔用多少量的胰酶消化啊我是在做流式测凋亡(胰酶,贴壁细胞,细胞凋亡) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 24孔板的贴壁细胞每孔用多少量的胰酶消化啊我是在做流式测凋亡(胰酶,贴壁细胞,细胞凋亡)
摘要: [24孔板的贴壁细胞每孔用多少量的胰酶消化啊我是在做流式测凋亡(胰酶,贴壁细胞,细胞凋亡)] 我用Annexin V测细胞凋亡(Apoptosis)，但是单纯细胞的凋亡率偏高了，达到了13%，我在想可能是消化不够充分吹打造成的，因此请教一下大家，24孔板养的贴壁细胞，每孔加多少胰酶消化合适啊？我加的是100ul。谢谢了！ 关键词:[胰酶 贴壁细胞 细胞凋亡]……
我用Annexin V测细胞凋亡(Apoptosis)，但是单纯细胞的凋亡率偏高了，达到了13%，我在想可能是消化不够充分吹打造成的，因此请教一下大家，24孔板养的贴壁细胞，每孔加多少胰酶消化合适啊？我加的是100ul。谢谢了！
回复你加多少培养基回复做流式检测时用24孔板的细胞数量太少了吧。应该用35mm或6孔板的数量才可以达到的。如果想节省，可以用12孔板试下细胞数量是否达到检测要求。至于24孔板，一般常规是加200ul培养基，加胰酶消化时只要消化液的液面没过细胞表面几次就可以了，50ul或100ul是可以。对照的凋亡率高与你的培养条件及消化时是否过度有关。估计你的数量达不到106/ml的要求。回复我通常用150uL胰酶（0.5%），但还得看细胞系好不好消化。24孔板的细胞通常活力都不高，原因可能有很多。回复谢谢各位了哦回复关注此帖，因为也正在做这个东东，俺用的是原代神经元。回复关闭此帖，因为也正在做这个东东，俺用的是原代神经元。如果你是原代神经元，如皮质神经元或小脑颗粒神经元等，如果用流式来检测凋亡，个人认为有些不妥。理由：1 原代培养的神经元的存活需要完整的触突联系，以实现细胞间的神经递质(neurotransmitters)与电活动的联系与传递。如果用胰酶消化的方法然后进行流式检测，这样必然会破坏细胞间的突触联系而使细胞受到损伤从而造成假阳性凋亡。 2 因为原代神经元的培养不同于细胞株，它需要紧密的贴壁生长，需要种细胞前在培养板中加入多聚赖氨酸包被才能使细胞生长良好。而神经元的凋亡检测，你可以用Hoechst33258进行核染色，然后计算固缩的细胞或有凋亡小体的细胞的比例，从而计算凋亡率。或者提取总DNA然后进行DNA琼脂糖电泳，观察有没有DNA ladder的出现。 虽然也有文献报道有流式的方法来检测原代神经元的凋亡，但个人的经验不支持，因为有其它更方便与有效的方法同时可以减少细胞损伤的检测方法。希望对你有所帮助。回复感谢楼上的指导，这个问题确实我们曾经考虑过，但是实验室里面有一位同事已经利用运动神经元进行流式分析成功了；他们觉得应用于皮质神经元应该靠谱；此外，在盒说明书中，Annexin V用于贴壁细胞确实不大合适，但从提供的参考文献来看，曾有人完成过这类试验，我想还是试试看吧，呵呵你前面提到的Hoechst33258染色，其实我们已经完成了，不过用的是台盼蓝，同时也利用了MTT检测细胞活性；我面临的问题是：距离回国的日子只剩下不到3个月了，因此在方法的选择上回旋的余地已经不大，硬上了，呼呼回复感谢楼上的指导，这个问题确实我们曾经考虑过，但是实验室里面有一位同事已经利用运动神经元进行流式分析成功了；他们觉得应用于皮质神经元应该靠谱；此外，在盒说明书中，Annexin V用于贴壁细胞确实不大合适，但从提供的参考文献来看，曾有人完成过这类试验，我想还是试试看吧，呵呵你前面提到的Hoechst33258染色，其实我们已经完成了，不过用的是台盼蓝，同时也利用了MTT检测细胞活性；我面临的问题是：距离回国的日子只剩下不到3个月了，因此在方法的选择上回旋的余地已经不大，硬上了，呼呼1、硬上Annexin V的话最好也是用荧光染色的方法进行拍照，如果用流式测得话，恐怕即使做出来了，发文章的时候人家也未必会承认你的结果。2、建议再使用 ladder的方法做个support evidence。此外，也可以考虑用Hochest33258或者AO/EB染色法进行补充。3、如果有条件的话，原代神经元的凋亡检测最好用TUNEL，很经典的方法，而且适合贴壁细胞的检测。回复多谢楼上指导，有问题再来请教。
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电话：021-胰酶的浓度 - 实验交流 - 生物秀
标题: 胰酶的浓度
摘要: 胰酶的浓度我在养成纤维细胞，请问胰酶的浓度控制在多少合适？是否要加EDTA？EDTA的浓度呢？大约要几分钟？为什么我的细胞一传代就不行了 关键词:[细胞 纤维 传代]……
我在养成纤维细胞，请问胰酶的浓度控制在多少合适？是否要加EDTA？EDTA的浓度呢？大约要几分钟？为什么我的细胞一传代就不行了回复:
胰酶浓度0.25％，不必要加EDTA，如果要加，浓度控制在0.02％。消化时间一般4分钟左右（室温条件下）。
细胞传代不行与很多因素有关；消化时间、吹打的力度、血清浓度、培养基pH值、细胞培养瓶是否清洗干净、离心速度－－－－，你可以把你具体的操作步骤描述一下，我们好跟你找原因。回复:
胰酶浓度和EDTA的浓度正如你所说的，消化时间也差不多是4～5min，离心速度是1000转×8min，这些应该没有什么问题，我自己想问题可能出现在下面这些方面：我用5ml的胰酶是不是太多了？（50ml的培养瓶），再用5ml的含有15％血清的DMEM培养液吹打，总的液体好像太多，分了两个离心管；吹打得时候产生很多气泡，还有一些细胞二次消化也下不来，离心以后，我害怕把细胞也吸掉，离心管子里是好像总有一些液体残留，最后使用的是玻璃瓶子。回复:
50ml的瓶子，胰酶用2ml就可以了，如果你怕消化不下来，可以先在瓶中消化两分钟，然后吸出胰酶，将细胞培养瓶放入37℃的培养箱中5分钟，让残留的胰酶继续消化，你也可以在显微镜下观察消化效果，这样既不会消化不下来，也不会消化过头。吹打产生气泡与培养基的多少没有关系，你应该加强练手，我相信气泡会越来越少的。离心管里残留一些细胞是很正常的，对于已转移到培养瓶里的细胞悬液来说，那是九牛一毛了，不必太过计较。玻璃瓶子的清洗一定要干净，如果用酸泡过的，多冲洗一下。关于你的血清浓度，建议你降为10％。回复:
同意woaini的观点，我们消化都是加两毫升胰酶，晃3－4下后吸出大部分胰酶，然后靠剩余的少量胰酶在37℃的培养箱中消化，注意在镜下观察消化效果，消化好后直接加含血清的培养液终止消化，没必要离心。加EDTA，更易形成单细胞悬液。回复:
为什么血清浓度要降为10％？用含有血清的消化液吹打是不是容易出气泡呢?能不能用D－hanks液吹打然后再离心呢？回复:
不易剧烈吹打，对细胞损伤太大，同时产生泡沫，是由于蛋白缘故，其实胰酶5ml没问题，关键镜下看到细胞变圆后，加入4倍体积10%FBS中和胰酶，轻轻吹打，不要出泡沫，离心。内皮，ES,SMCs好多细胞我试过都可以回复:
吹打出气泡是与血清有关，但是只要你操作得好，产生气泡会很少的，这也可以检查地出你吹打细胞是否用力得当。如果你非要用hanks吹打后然后用培养基重悬也未尝不可，但是一样要注意不要吹打得太过剧烈。7楼所说的用4倍的10％FBS中和，然后离心这种做法是不提倡的，很浪费FBS（很贵的哟），只要你将胰酶吸尽，直接加入含FBS的培养基吹打使细胞均匀悬浮，细胞就可以很好地生长了，残留的一点胰酶自然会被中和的。回复:
4倍体积是折算绝对含量吗？否则5ml的胰酶不是要变成25ml悬液，要好几个离心管，会损失很多细胞的回复:
你可以适当控制总体积，主要是保持细胞活性，胰酶多点时间就短点，其实养细胞主要是经验。曾经说养细胞一半是技术，另一半是艺术。
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