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【求助】ELISA试剂盒制作的一些问题
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这个帖子发布于8年零236天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我要做一个临床诊断试剂盒，试剂盒的建立方面已基本没有问题，但是根据国家要求，该产品报批需要提供分析灵敏度、测定范围、测定准确性等数据，请问这三项指标应该如何测定，有没有标准化的方法，谢谢。
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一 分析灵敏度（检验限）：1 实验材料和基本要求空白样本的制备：空白样本应不含被测物，但其基质应与待测定常规样本相同。如空白样本难以得到，可采用5%牛血清或人血清白蛋白溶液。或根据测定项目选用相应基质的样本，但应注意将基质效应减至最小。2 实验方法在一次运行中将空白样本重复测定20次。3 数据处理3.1 数据记录：将测定结果记录于表格中。如果检测系统对于低于零的结果报告为零，应记录初始响应值，如吸光度值等。3.2 数据统计：计算20次结果的均值 与标准差SD。4 结果报告以空白均值加两倍标准差报告方法的检测限。二 测定范围（这里指可报告范围，而不是线性范围）1 实验样本的基本要求和制备方法1.1 样本要求最好选择与测定样本具有相同基质的样本。1.2 制备方法（1）低值样本：将待测样本（含被分析物）用混合人血清（含被分析物浓度水平较低）或5%牛血清白蛋白生理盐水溶液进行稀释，产生接近于方法线性范围低限浓度水平的样本，一般为5个浓度水平，浓度水平间隔应小于线性范围低限的10%。（2）高值样本：选取含被测物的高值样本，必要时可添加被分析物的纯品，并计算出理论值。使用混合血清或5%牛血清白蛋白生理盐水溶液或测定方法要求的稀释液对高值待测样本进行稀释，使其接近于线性范围的上1/3区域内，并记录稀释倍数。至少选用三个高浓度样本，稀释倍数应为方法性能标明的最大稀释倍数、并适当增加或减小稀释比例。2.实验过程在一次运行中将低值样本重复测定10次，高值稀释样本重复测定3次。3.数据处理3.1 数据记录：可根据附表进行数据记录。3.2 数据统计：分别计算AVE( )、SD、CV值。对于可报告范围高限还应计算乘以稀释倍数后的还原浓度和相对偏差。4.结果报告4.1 可报告范围低限：以方法性能标示的CV值为可接受界值，由数据中选取CV值等于或小于可接受界值的最低浓度水平做为可报告范围低限。4.2 可报告范围高限：选取还原浓度与理论浓度的偏差（%）等于或小于方法标示CV值时的最大稀释倍数为方法推荐的最大稀释倍数，方法线性范围的上限与最大稀释倍数的乘积为该方法可报告范围的高限。三 测定准确性（回收实验）1.实验样本的基本要求和制备方法1.1 选择合适浓度的常规检测样本，分为体积相同的3-4份。1.2 在其中2-3份样本中加入不同量的待测物标准，制成2-3个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。1.3 在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶剂，制成基础样本。2.实验过程用待评价方法对回收样本和基础样本进行测定，通常对样本进行2-3次重复分析，取其均值进行计算。3.数据处理及结果报告3.1
计算回收率：回收率1 =
计算平均回收率：平均回收率 = 3.3
计算比例系统误差：比例系统误差 = 100% - 平均回收率3.4
可接受判断：比例系统误差不大于CLIA 88允许总误差的1/2。4． 注意事项：4.1 加入体积：加入的标准液体积一般在样本体积的10%以内；并且保证在加样过程中的取样准确度。4.2 加入待测物的浓度：在保证总浓度在方法分析测量范围内，尽量使加入标准液后样本中的被测物浓度达到医学决定水平。4.3 标准物浓度：因为标准物溶液加入体积不到10%，为保证得到不同浓度的回收样本，标准物的浓度应该足够高。四 测定准确性（方法性比对）1.实验样本的基本要求1.1 按照实验对样品的要求收集处理病人样品，样本贮存时间及条件由被测组分的稳定性而定，尽可能避免使用贮存的样品。1.2 样品应来自于许多病人，并且此病人的疾病对于被测组成的影响应该是知道的，不要使用含有干扰此方法的组分或条件(如溶血)样品。1.3 在具有临床意义范围内即医学决定水平范围内，评价实验样品方法，通常基本从低于参考范围的低限到高于参考范围的高限。分析浓度尽可能在报告的浓度范围内均匀分布。商品质控物或者校准物可能存在基质效应，应避免使用。2.实验过程2.1 每天选择8个临床病人样本，按1到8的顺序编号。用两种方法同时进行实验，按照1，2，3，4，5，6，7，8，8，7，6，5，4，3，2，1的样本顺序进行测定。2.2 以上实验至少重复5天，即至少分析40个不同的临床病人样本。每天实验必须进行校准和室内质控。只有在室内质控合格的情况下，当天的实验室数据才有效。3.数据处理及结果报告3.1 记录测定结果（Xii和Yjj）。3.2 计算每个样本测定的均值（ 和 ），样本重复测定间差值的绝对值（DXi 和DYi）及两种方法测定结果间的差值（ - ）。3.3 以 对 作散点图。3.4 以（ - ）对 做偏倚图。3.5 以（Yjj-Xij）对 做偏倚图。3.7 检查批内离群点：计算样本重复测定间差值（DXi 和DYi）的平均数，实验结果差值超出平均数4倍时，则判断为离群点。3.8 检查批间离群点：计算两种方法测定结果间均值差值( - )的平均数，超出该平均数4倍时，则判断该样本为离群点。3.9 相关系数计算：利用所有样本双份测定值进行相关系数计算，如果r2≥0.975(或r≥0.95)，则认为X范围适合，数据满足要求。X的误差可以由数据范围给以适当补偿，并且简单的线性回归可以用来评价斜率和截距。如果r2&0.95，那么必须通过分析另外一些样品以扩大数据范围，然后再检查全部数据系列。如果没有超出范围，采用分步偏差程序代替线性回归，评价平均偏差。3.10回归计算：利所有样本双份测定的有效数据，计算两个方法间的线性回归方程：Y=a+bX.3.11 偏差估计：在医学决定水平，利用回归方程计算预期偏差,预期偏差Bx=a+(b-1)X,相对偏差=Bx/X3.12 根据相关规定，判定预期偏差、相对偏差是否在规定范围内。有些符号打不上来，有什么问题我们再联系。
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学习了；最近也在研制ELISA检测试剂盒，不知一个试剂盒的研制后需要进行哪些指标的分析，同时怎样进行质量控制，谢谢？
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给你一个医疗器械评审中心写的《体外诊断试剂分析性能评估系列指导原则（征求意见稿）》，你可以参考一下，不过这个指导原则写的太繁琐的，实际上，我们在做实验的时候，可能做不到这么细致，或者这么多样本量。
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关于丁香园ELISA试剂盒在实验方面有什么要求，作用有什么_百度知道
ELISA试剂盒在实验方面有什么要求，作用有什么
我有更好的答案
9．本试剂不同批号组分不得混用，以英文说明书为准。这是在远慕生物技术软文里面看到的。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8．所有样品。4．请每次测定的同时做标准曲线。10. 如与英文说明书有异。一次加样时间最好控制在5分钟内，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5），以避免试验误差：1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，并经常校对其准确性，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理，如标本数量多，推荐使用排枪加样。5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物请避光保存。7．严格按照说明书的操作进行，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。2．浓洗涤液可能会有结晶析出，最好做复孔。3．各步加样均应使用加样器，具体您还的查查ELISA试剂盒在实验方面有什么要求，作用有什么ELISA试剂盒操作注意事项
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ELISA试剂盒检测过程中的注意事项
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这个帖子发布于14年零14天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
转自http://www.congenes.com/htm/support_1.htmELISA的实验操作所要求的条件是比较严格的，无论是对实验的硬件条件还是对实验的操作人员的技术要求，都是如此。下面所提到的就是一些在进行ELISA实验时所要注意的一些问题。一、ELISA实验通用规则1、要保证移液枪的准确性，误差不能超过2%。可用水和电子天平进行确定。但最好有专业人员进行矫正。2、要配备20ul、50ul、100ul、1000ul和排枪各一支。吸取不同的液体后，要更换枪头。即使是吸取标准品时。3、要在实验前1小时将试剂盒从冰箱中取出，使各种试剂都恢复到室温，以使结果更稳定。4、实验时，要使底物避光保存。5、用枪吸取液体时速度不能太快，以免产生气泡而使吸取量不准确。6、吸取液体时，要用量程和需要量接近的枪去吸，减少误差。7、将液体加到酶标孔中时，避免枪头和孔内液体接触，可使枪头上的液滴和孔壁接触，液滴会自然流下去。8、液体全部加完后，可将酶标板在桌子上平行轻轻晃动30秒，混匀液体。也可以用酶标仪的晃动功能。9、温浴时，要用不干胶或胶带纸封好酶标板，防止水分的蒸发。10、洗板时，每次洗液加入后，应静置1分钟，使清洗更加彻底。没有洗板机时，倒去液体后，要将酶标板在报纸或毛纸上用力拍干。11、洗液不够时，可用蒸馏水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸缓冲液，加入0.1%的吐温20作为洗液。加入1/1000的叠氮钠后可长期保存。12、底物是光敏感的，要在临用前现配。13、检测前，要打开酶标仪，使之稳定10分钟以上。14、底物有一定的毒性，终止液对皮肤有腐蚀性，应尽量避免接触。15、待检样品要澄清，否则会影响结果。16、温浴时间应遵守试剂盒规定。17、应尽量做双孔实验，这样才能保证数据的准确性。18、对结果有疑问的样品要用其它方法进行确证。二、下面所提到的是针对我公司的ELISA产品会出现的问题及解决办法1. 加入反应终止液后，没有吸光值或吸光值偏低。a.原因：未加入酶标记物。解决办法：请按照操作步骤进行。b.原因：试剂盒内容物未能充分回。解决办法：确定试剂盒内容物回温后再进行操作。c.原因：室温太低。解决办法：若室温太低(&19℃)，请于操作步骤4，适当延长温育时间。d.原因：未使用试剂盒的清洗液清洗。解决办法： 请用试剂盒内所提供的清洗液清洗。e.原因：试剂盒已过有效期限。解决办法：请更换成仍在有效期限内的试剂盒。2. 标准曲线线性不佳，或是平行性不好。a.原因：温育位置避光不好或受到气流干扰。解决办法： 请确认温育位置既不透光也不透风(如抽屉内)。b.原因：操作时间拖太久。解决办法：请在方法熟练后再进行操作。c.原因：微孔间相互污染。解决办法： 加样品时，请小心勿溅出微孔外，以免造成其它微孔的污染。d.原因：标准品或酶标记物所加入的量不一致。解决办法：请使用已校正过的移液枪，并确保其与吸头之间有高度密合性。e.原因：添加样品或试剂的操作方法不正确。解决办法：加样品或试剂时，吸头请勿接触微孔。f.原因：洗板过程发生问题(如管路堵塞、洗完板后未立刻进行下一步骤)。解决办法：请随时监控洗板机洗板过程，洗完后立即进行下一步骤。3. 吸光值均偏高(或线性不够陡)。a.原因：室温太高(&25℃)。解决办法： 若无法降低室内温度，请适当缩短步骤4的温育时间。b.原因：底物溶液受到污染。解决办法： 若发现底物溶液已呈现淡蓝色，请不要再使用。c.原因：反应时间超过太久。解决办法：请控制反应时间。d.原因：酶标记物污染了盒内其它试剂。解决办法：使用过的吸头应立即丢弃，可避免试剂间相互污染，凡是试剂(特别是酶标记物与底物溶液)接触过的容器应立即清洗干净。(先以漂白水浸泡，再以清水冲洗干净，可确保无残留)4. 阴性标准品的吸光值低于阳性标准品的吸光值。a.原因：微孔中的试剂未能充分混合。解决办法： 试剂加完后，需轻敲盘四周使其充分混合均匀。b.原因：洗板过程发生问题(同2-f.)。解决办法：请参考2-f.c.原因：添加样品或酶标记物的量不一致。解决办法： 请参考2-d.
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