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重新安装浏览器，或使用别的浏览器请教冰冻组织免疫组化问题。_百度拇指医生
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?请教冰冻组织免疫组化问题。
最近做免疫组化，新鲜组织不够用，准备用-80栋存的组织。请教一下从-80取出后是不是需要立刻进行试验？立刻就做的话能否做成石蜡的？由于条件有限，恐怕不能取出标本后立刻实验，可不可以先放入常温中性福尔马林保存，之后再做石蜡免疫组化？
拇指医生提醒您：以下问题解答仅供参考。
标本长期保存后做免疫组化有两个选择
1）就是你说的石蜡切片，这个容易操作，但有些表面抗原，尤其是磷酸化蛋白可能做不出来；
2）比较好的方案是拿30%蔗糖固定后，在干冰或者液氮条件下用OCT进行包埋，可在-80冰箱保存较长时间，然后在冰冻切片机复温后，在-20条件下切片制片，然后吹干，当天或次日进行实验
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向医生提问免疫组化成功的经验和失败的教训汇总(免疫组化) - 动物实验 - 生物秀
标题: 免疫组化成功的经验和失败的教训汇总(免疫组化)
摘要: [免疫组化成功的经验和失败的教训汇总(免疫组化)]
关键词:[免疫组化]……
楼主好人支持mark一下慢慢看回复留个标记，以后用到再看回复HE染色时，切片经苏木素染色、分化后镜检看不见细胞形态，想问一下是什么原因？样本为大鼠的肺组织石蜡切片。图片如下回复各位，我做免疫组化时原本想4度过夜，加完一抗后，我就忙着别的事了，然后就忘了放，第二天才发现，请问有什么可以补救的吗？万分感谢回复出现非特异染色，还可以尝试通过延长封闭液时间来改进。比如由10min改到15min或30min.回复请教各位HIC高手：最近用人肺癌的术后石蜡标本做了一批EGFR的免疫组化，结果出现全阴性，换成裸鼠肺癌的石蜡标本染色，整张片子只出现了一小团表达阳性。一抗我用的是gene公司分装Santacruz的工作液，二抗是用的中杉金桥的三步法。抗原修复是用的水浴锅95度45分钟，枸橼酸盐和EDTA都试过。请教各位可能的原因？！EGFR的一抗究竟哪个公司的比较好？虽然不知道EGFR的一抗究竟哪个公司的比较好，但经过实践证明，Santacruz的抗体经常不给力，不稳定。回复我要测兔肺组织的VEGF，用abcame的，将近3000块大洋，但是说明书上写的免疫组化是1：50稀释，但是总共就只有50ul，也就是总共也就能染50张片子，那岂不是一下就用完了啊，我该怎么办啊Product Name VEGF antibody [JH121]See all VEGF antibodies (25)...Product type Primary antibodiesDescription Mouse monoclonal [JH121] to VEGFImmunogen Full length protein (Human)Reacts with (species key) Hu, Ms, Rat, RbSpecificity Of the four isoforms of VEGF, the smaller two, VEGF165 and VEGF121, are secreted proteins and act as diffusible agents, whereas the larger two (VEGF189 and VEGF206) remain cell associated. This antibody recognizes all the forms.Tested applications (see key) IHC-Fr, IHC-PAbreviews Customer reviews(see key)
Read about Abreviews(Read all Abreviews)Submit an Abreview and earn up to 220 Abpoints by reviewing this product ? IHC-P[url=http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=reviews&intAbID=28775&strFilterApplication=Immunohistochemistry (Formalin/PFA-fixed paraffin-embedded sections)]2 Abreviews[/url]- average rating: IHC-P(read Abreview)IHC-P(read Abreview)Application notes (see key) Recommended dilutionsIHC-P: 1/50.Perform heat mediated antigen retrieval via the pressure cooker method before commencing with IHC staining protocol. IHC-Fr: 1/50. Is unsuitable for WB.Not yet tested in other applications.Optimal dilutions/concentrations should be determined by the end user.Positive control (see definition) Pancreas, Kidney, AdenocarcinomaResearch areas Cancer >> Cancer Metabolism >> Response to hypoxiaDevelopmental Biology >> Organogenesis >> Angiogenesis and vasculogenesisCancer >> Invasion/microenvironment >> Angiogenesis >> Angiogenic growth factorsCancer >> Growth factors >> VEGFSignal Transduction >> Growth Factors/Hormones >> VEGFCardiovascular >> Angiogenesis >> Growth Factors >> VEGF >> VEGFTargetFunction Growth factor active in angiogenesis, vasculogenesis and endothelial cell growth. Induces endothelial cell proliferation, promotes cell migration, inhibits apoptosis and induces permeabilization of blood vessels. Binds to the FLT1/VEGFR1 and KDR/VEGFR2 receptors, heparan sulfate and heparin. NRP1/Neuropilin-1 binds isoforms VEGF-165 and VEGF-145. Isoform VEGF165B binds to KDR but does not activate downstream signaling pathways, does not activate angiogenesis and inhibits tumor growth.Tissue specificity Isoform VEGF189, isoform VEGF165 and isoform VEGF121 are widely expressed. Isoform VEGF206 and isoform VEGF145 are not widely expressed.Involvement in disease Defects in VEGFA are a cause of susceptibility to microvascular complications of diabetes type 1 (MVCD1) [MIM:603933]. These are pathological conditions that develop in numerous tissues and organs as a consequence of diabetes mellitus. They include diabetic retinopathy, diabetic nephropathy leading to end-stage renal disease, and diabetic neuropathy. Diabetic retinopathy remains the major cause of new-onset blindness among diabetic adults. It is characterized by vascular permeability and increased tissue ischemia and angiogenesis.Sequence similarities Belongs to the PDGF/VEGF growth factor family.Cellular localization Secreted. VEGF121 is acidic and freely secreted. VEGF165 is more basic, has heparin-binding properties and, although a signicant proportion remains cell-associated, most is freely secreted. VEGF189 is very basic, it is cell-associated after secretion and is bound avidly by heparin and the extracellular matrix, although it may be released as a soluble form by heparin, heparinase or plasmin.Target information above from: UniProt accession P15692 The UniProt ConsortiumThe Universal Protein Resource (UniProt) in 2010Nucleic Acids Res. 38:D142-D148 (2010). Information by UniProt回复我要测兔肺组织的VEGF，用abcame的试剂，将近3000块大洋，但是说明书上写的免疫组化是1：50稀释，但是试剂总共就只有50ul，也就是总共也就能染50张片子，那岂不是一下就用完了啊，我该怎么办啊我也用的是ABCAM的抗体，给的稀释度是1:100，不过我在说明书所给的应用文献中看到该文献使用的是1:500的浓度，所以我仍然做了摸浓度这个步骤，建议你也看看应用文献。或者可以用1:50做几张看看，如果非特异性染色比较强就可以稀释到1:100看看，稀释的越多，能做的片子也就越多了嘛。。。如果实在是只能用1:50，那也是没办法的事情，abcam本来就贵回复我想问下有没有人用过基因公司的EDTA ph=9.0的抗原修复缓冲液？ 我买的是20X的 应该直接稀释成1X用吗？回复大家一起交流，这样才能有提高回复大家都很专业，我是来学习的。回复
请问：本应是肿瘤显色，当现在全是正常强表达？问题可能出在哪呢？回复学习了回复请问楼主在IHC中是否用过protein block serum-free试剂来消除交叉反应？使背景更清晰？回复请大家帮帮我吧，我的片子的问题，帮我解决一下，我发了求助帖子了，，，，具体我再贴上来。。。大家帮我分析一下吧谢谢了回复我看起来感觉总还是不很明白 不知道要不要现就这样做起来再说回复嗯，学习免疫组化中。。。。。回复大家好，我做的是人肾脏B淋巴细胞刺激因子受体的免疫组化，一抗是兔来源的多抗，购自ALEXIS公司，二抗是中山金桥的PV-9000试剂盒，就是两步法。一抗说明书给的浓度是1：50~500，我现用的是1：100（国外文献试用的也是这个浓度），理论上及文献报道来说，BAFF应该表达于肾小管间质浸润的B细胞表面，类似簇状滤泡样，但我每次做出来的不仅仅是间质能看到滤泡样表达，肾小管的胞浆及管腔内几乎也呈均质型着色，但肾小球是阴性的，降低抗体浓度的话那阳性结果的着色也很浅，所以我还是在用1：100，后试着一抗加过以后不经过37°孵育，直接4°过夜，但染出的结果还是那样，之后我将3%H2O2的孵育时间由原来的10分钟延长至20分钟，将山羊血清的封闭时间由15分钟延长至30分钟，然后一抗4°直接过夜，第二天复温30分钟，染出的结果还是相同，但感觉非特异性染色比之前要稍淡一些（补充一下我用的是DAB显色，如果是1：100的一抗的话加上去数十秒就会出现特异性结果，1：150则1~2分钟左右，但不管哪种一抗浓度，非特异性染色出现时间在特异性染色数秒后就会出现，且逐渐加深。。。。）我今天把山羊的封闭时间延长到了45分钟，不知道明天结果会如何。。。 想请教一下下一步该怎么办，求救啊。。。。。。回复同样是人BAFF的免疫组化：3% H2O2 20分钟，山羊血清封闭时间延长到45分钟，一抗（1：100）孵育30分钟，四度过夜，复温30分钟，PBS洗5分钟×5次，聚合物增强剂孵育20分钟，PBS 3分钟×三次，二抗 30分钟，PBS 3分钟×3次，DAB显色，结果是：DAB一加上去特异和非特异性颜色都出来了，请高手指教下一步怎么办啦。。。。。。回复从五月份开始就一直准备做免疫组化，有很多的疑难点，结果因为实验室里做这个的少，所以一直干着急，今天突然发现了这个帖子，惊奇之中带着强烈的求知欲，看了很久，楼主很强大，很多疑难点都解决了。希望这个平台能够一直接续下去。回复最近刚做免疫组化，做的是胃组织，染出来的片子在40×倍显微镜下显示细胞很小，希望哪位能不能发张胃的胞浆阳性的漂亮图片学习一下啊？谢谢！回复
wh2008: 你好，现在我也正在做免疫组化，遇到了问题，想请教下您，或者别的大狭亦欢迎！石蜡切片，鳞癌组织，在显微镜控制下DAB有显色（但是背景淡黄），水终止，苏木素复染3分钟，水洗10分钟，盐酸酒精分化一次，水洗10分钟，后接梯度酒精、二甲苯，封片后再看，镜下没有看到有表达。前阵子用该抗体做正常组织，有表达。步骤基本类似。请问可能有哪些原因我没有做好？或者接下来我该如何继续？望不吝赐教！先谢过各位大侠！回复楼主，你好，我最近在做免疫组化，是大鼠肠粘膜组织的。 在用EDTA修复后发现严重脱片，特请教下！
我的步骤是：
脱蜡后，纯水冲洗2次。
EDTA修复：大火微波叮2分钟；中低火两次，每次5分钟，两次间加入纯水，防止干片。
中低火第一次时，将切片拿出，可清晰看到组织，
第二次时，微波叮完后也可看到组织，
可放在室温待切片冷却时，发现严重脱片现象，
请问是何种原因？！谢谢回复受益匪浅，多谢回复受益匪浅回复受益匪浅回复学习了 谢谢回复mark回复各位老师请指教：
我用武汉博士德的抗体做免疫组化实验，测石蜡切片大鼠肾脏中HGF的表达。
PV6001检测，DAB显色3至5分钟，加一抗后于4℃过夜。抗体浓度从1:50，100，200倍稀释都试过了，但片子出来满视野都是棕黄色，稍微有一点颜色深浅的差别。这是非特异性染色吗？
用PBS取代一抗做了阴性对照，片子上没出现棕黄色。
我考虑是不是存在以下的问题呢：
1.抗体稀释倍数再增大？
2.我没有用封闭。一抗是羊抗大鼠的多克隆，是否需要封闭呢？
3.有没有必要用细胞膜通透剂triton-100或Tween-20？
4.是不是高压或微波修复有可能增加非特异性染色？可以不用修复的吗？
5.的问题？关键是现在不想换一抗了，没钱啊。回复受益匪浅，共同学习进步~~回复mark回复我现在关注两个蛋白，一个是表达在核上，一个是表达在胞浆和细胞骨架。反复做，反复摸条件，但就是阴性。表达在核上的那个我希望它出现在腺体中，可是它偏偏把纤体周围的肌细胞胞核染得很好。这是说明腺体中它就是阴性吗？另外，免疫组化能显示出细胞骨架的蛋白表达吗？如果不能，那怎么办啊？我现在跳楼的心都有了，完全没有想到会是这样！还请各位帮我分析分析。谢谢！回复我做的是核表达蛋白的大鼠脑片免疫组化，冰冻切片，20微米，但是无论是用不用triton，染色都是均一的，看不出明显的胞核染色，抗原修复是中高火煮沸6分钟*4次，请问还能怎么样调整实验步骤呢？回复先mark一下，马上要开始做实验了回复请问抗小鼠CD4单克隆抗体，抗小鼠IgG都在哪里买的？
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【求助】冰冻切片做免疫组化的问题！
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这个帖子发布于2年零214天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大神们，我刚接触免疫组化，想用冰冻切片做，我查了一些资料，发现有两种做法，第一种是取出组织后要固定沉糖再切的，还有一种是不需要固定，直接新鲜组织切后做免疫组化。我想问一问1.第一种切完片后，放在负四度冰箱里，要做免疫组化之前放置室温30min，然后直接就做免疫组化的步骤吗？还需要脱蜡水化吗和抗原修复吗？封片之前需要烤片吗？2.第二种切完片后只用之前也是放在室温30min，然后放入4°丙醇固定10min，PBS洗5min3次，3%H2O2孵育5至10min，PBS洗5min3次，滴加一抗放4°过夜，然后拿出PBS洗2min3次，然后滴加2抗，接下来就根据免疫组化的步骤做下去吗？需要抗原修复吗？封片之前需要烤片吗？3.如果没有丙酮，还能用啥代替啊？
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丁香园关于这种问题有成千上万的精华帖，为什么不动动手去搜？
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做组化都是要固定的。一般都是用的第一种方法，灌注固定后取组织，20%，30%蔗糖沉底，包埋切片，-20度保存。实验前取出PBS浸泡复温，因为用的OCT包埋剂，不存在脱蜡一说，修复这步可做可不做，视实验结果而定。固定液还可以用4%多聚甲醛代替，个人认为甲醛对组织结构的保全要好些
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