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毕业论文-近海细菌hzo基因及古菌amoA基因多样性研究.doc
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简介：本文档为《毕业论文-近海细菌hzo基因及古菌amoA基因多样性研究doc》，可适用于综合领域，主题内容包含毕业论文近海细菌hzo基因及古菌amoA基因多样性研究中国石油大学(华东)毕业设计(论文)近海细菌hzo基因及古菌amoA基因多样性研究学生姓名:杜符等。
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资料评价：[转载]高通量数据处理的一些经验和建议
最近一年时间里收到很多同学和朋友关于454数据处理的询问，通过QQ，微信，人人网和邮件等各种途径，当然不少也是面对面的讨论。这些同学和朋友包括同组的，跨组的，同所的，跨所的，其他大学的，来自北京的、南京的、广州的、西安的，甚至也有国外的中国朋友。有些朋友我素未谋面，也不知长相如何，不知男女。有时候同一天能收到五六份邮件，问题之五花八门，有时已经超越了我所能够解答的范围。
这些现象也反映了当前生物信息学的急剧变革，第二代测序技术就像Iphone问世一些，彻底席卷和重新定义了当前生态学研究的方法和手段。而几年前费用昂贵的第二代测序如今已“旧时王谢堂前燕，飞入寻常百姓家”，于是乎大潮裹挟之下的硕士生博士生们都想出来耍耍，扔个十几万块钱，希望能够轻松的收获几篇文章。
科研论文的发表讲究“猎奇性”，大家都喜欢看到新奇的方法和漂亮的图表。但我认为这其实也是当今科研界的弊端之一，讲究创新和手段的先进，而忽视了研究的重要性。以微生物生态学的旗舰杂志ISMEJ为例，最近一年多发表的学术论文里，第二代测序技术已经是寻常方法，所谓第三代的单细胞测序技术也开始出现。研究生物信息学的来自美国科罗拉多的Rob
Knight能够作为ISMEJ的高级主编，方法对于微生物生态学研究的重要性可见一斑。
前几天读到阿伯丁大学的James Prosser教授在Nature上发表的一篇观点文章“Think before you
sequence“，在这里面他讲到，第二代测序只不过是一个工具而已，我们的研究依旧要从扎扎实实的假设出发，设计实验来解决问题和验证假设。高通量测序并不能弥补实验设计的缺陷。我在阅读文章的过程中也发现，设计合理和完整的实验，即使使用传统的Sanger测序技术，依旧能够说明和解决问题，并能够发表到高档次期刊上。而如果使用第二代测序技术，但是数据处理有问题，数据质量控制不好，文章也很难得到发表，相当于花钱买罪受。
我从2011年秋天开始学习454数据的处理，在学习的起始阶段，能够和师弟袁超磊一起探讨和交流，并且几乎阅读了ISMEJ上所有与第二代测序技术有关的文章，所以能够很快的上手。在此我也对师弟袁超磊表示正式的感谢，祝愿他在阿德雷德大学能吃上可口的饭菜。
很多朋友的问题我未能一一解答，在此也表示歉意。我经历过学习454数据处理的漫长和痛苦的过程，我很清楚有时候一句话或者一段话很难解决所问的问题。去年我自己投出的文章经历了很多次的拒稿，十几位审稿人和生物信息学家对数据处理提出了建议，现在经过在悉尼和生物信息学专家的讨论，我也能够更加合理地看待数据处理的问题。摸着石头过河的一些经验和建议，在这里进行分享，希望正在摸索和思考中的你，觉得并不孤单。
1. Mothur和QIIME那个软件更好？
Mothur是美国密歇根大学的Patrick
Schloss在2009年开发的数据处理平台，它的前身是Dothur软件，相信大家都听说过。这两个软件的发音分别为Mother和Daughter，是Dr
Parick献给他的妻子和女儿的。另一个被广泛使用的数据处理平台是QIIME,也是美国科罗拉多Rob
Knight等人于2009年开发出来的。截至今天，Mothur的方法文献已经被引用1229次，而QIIME被引用574次。这说明Mothur比QIIME有更广泛的群众基础。
我刚开始学习使用的就是Mothur,我个人非常喜欢这个开源的数据处理平台，基本能够实现我的所有数据处理目的。Mothur软件无需安装，在Windos,
Linix,和MacOS系统上都可以运行。我研究了Mothur每一个中间导出文件的格式和原理，所以我能够将这些中间产生的文件导入其他软件进行处理和做图，比如R语言。很多人不喜欢Mothur，都是因为Mothur不能够直接出图，必须依赖于其他软件。而这正式我所喜欢的原因，我现在也正在进一步学习R语言，R的做图功能是非常强大的，其实大家平时看到文章上那些非常漂亮的图，大都是R语言做出来的。所以，如果将Mothur和R结合，我认为是一个能正确处理数据并完美展现数据的途径。除了罗氏454数据处理之外，Mothur现在也有了针对Illumina数据的处理方式，大家从Mothur的网页上就可以读到Dr.
Patick写的标准数据处理流程。
现在QIIME携苹果电脑的时髦，也得到了很多人的青睐。这个软件我本人没有真正使用过，但是知道QIIME只能在MacOS和Linix系统上运行，当然也可以通过在Windos系统上安装Virtual
Box来运行。这个软件出图的效果比较好，很多人把直接出的图用来发表文章。我所在的悉尼这边的研究所的生物信息学专家也是用QIIME来处理数据。我就这个软件问题和他讨论了好多次。基本来说，两个软件都可以帮助我们实现正确的数据处理，并不存在哪个更好的问题，只有个人在使用上的喜好。
我希望你无论使用那个软件，都仔仔细细阅读软件网页上的教程，并熟悉所有的命令。自己一一试试各个命令，合理组合命令，这样才会通过修改命令来正确处理自己的数据。这个过程没人可以帮你，只有你自己能够救赎自己。
2. 数据处理难学吗?
这是一个我一直以来很想告诉所有人的问题。说实话，那两个软件都很好使用，有标准的处理流程在那里等着你，把所有数据处理下来绝对不超过十天时间。但是，为什么我们几个月甚至一年都拿不下来数据处理？
因为数据处理的难点不在于软件的使用，而在于你对微生物生态学基本概念的了解。我认为我们需要在数据处理之前就应该特别清楚的是1）α多样性的各种指标。数据条数的多少会直接影响α多样性的计算结果，它们之间是正相关关系。所以计算α多样性必须统一序列条数。而我们知道统一序列条数就会舍弃很多条数不足的样品，这个取舍就涉及到很多的经验问题，需要你阅读很多的文献来了解；2）β多样性的表征方式。我研究β多样性的时候，阅读了很多相关的文献，对Bray-Curtis指数，UniFrac等都非常了解。选择能够最好表现你多样性差异的指数，需要花很多很多的汗水。3）多元统计方法。这个又是更大的难点了，Mothur不会告诉你，QIIME也不会告诉你。你只有去阅读教材，阅读文章，才能弥补这些缺陷。不然你连那些命令都读不懂，还谈什么数据处理，修改命令。4）文章的构思。这又是更高一级的知识预储备了。在你的数据处理之前，请阅读所有高质量期刊上的相关文章，至少需要预估计，你可以出哪些图，做哪些分析。其实在数据处理的过程中已经是你不断验证假设和推翻假设的过程。
希望你在数据处理之前踏踏实实地做好这些功课，不然你很难完美运行各个命令。另外，要仔细研究各个软件的原理，做到人机合一的效果。因为有时候软件并不能解决所有问题，比如在alignment的时候，有时候在部分区域比对效果不好，你需要使用合适的软件打开这些中间文件，手动进行删除，不然会影响后续的多样性计算。所以，你需要把自己练成一台机器。2010年我做过同位素超高速离心，尽管已经有很多文献可供参考，我当时还是研究了离心机的原理和等密度梯度离心的原理，所以自己就很清楚应当如何优化实验条件，获得最好的数据。
3 细菌和古菌16S数据和功能基因数据处理的不同？
如果你处理的是细菌16S数据，那么恭喜你，你应该很容易完成数据处理，因为Mothur和QIIME都包含了细菌16S比对和分类的数据库。因为细菌的研究已经非常多，所以分类的效果也很好，未知的类别一般也很少。
如果是古菌16S的话，RDP，Greengenes，SILVA等数据库我都用过，分类效果都很差，但是不影响你的多样性分析。因为古菌的纯培养仍然很少，分类问题仍然是处于发展阶段。你基本也可以顺利按照标准流程完成数据处理。
但是功能基因的话，就面临很大很大的难题。如果想测序功能基因的同学，一定要三思而后行，我自己在这方面进行了很多的尝试，虽然知道处理的方式，但是解释起来真的很难。就像我在上面所说的，如果你不了解Mothur和QIIME的文件格式，基本架构，我很难告诉你怎么去实现自己的目的。所以大家也可以看到，现在发表的关于功能基因测序的文章很少很少。大家基本都是DIY，都是一些很熟悉生物信息学的国外实验室发表的。希望你能认识到功能基因处理的难点1)第一步是比对alignment，一开始就做不了。因为没有可供使用的alignment
reference数据库。我的经验是自己做一些，从NCBI上下载功能基因序列，然后自己通过MUSCLE或者ARB比对的很齐，然后作为参比序列；2）分类。这个更难，需要经过alignment之后，分成不同的OTU，然后从每个OTU中选择一个代表序列，通过BLAST进行分类。3）分OTU。对于细菌和古菌16S而言，97%代表species水平，但是功能基因就完全不一样。以氨氧化微生物研究为例，AOA的species-level
OTU应当是87%，而AOB应当是80%，所以和16S数据完全不同。
对于必须要做功能基因的同学，我建议可以考虑基因芯片（microarray）的方法。现在针对pmoA和amoA基因的基因芯片都已经开发的非常完善，国际合作也不是难题。Microarray通过设计的探针合理解决了分类的问题，价格比454测序也便宜，数据处理简单。所以我认为是一种更好的方式。
以上所写，难免有错误之处。我以分享知识为乐趣，也祝各位同学和朋友数据处理顺利。
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。和“amoa基因”相关的论文
比较分析中国东部不同季风气候区中海伦黑土（HL）、封丘潮土（FQ）和鹰潭红壤（YT）3种土壤氨氧化细菌amoA基因多样性。采用非培养方法直接从土壤中提取微生物总DNA，用氨氧化细菌amoA基因特异引物扩增总DNA，构建了3种土壤amoA基因文库，并对文库进行限制性长度多态性（RFLP）分析。HL、FQ和YT的amoA基因文库克隆数量分别为49、50和48个，相应的RFLP类型数为10、10和14个OTUs，其中有4个OTUs为三种土壤共有；YT中氨氧化细菌amoA基因多样性指数最高，FQ最低；HL和FQ群落的相似为70％，HL与YT的相似度为50％，而FQ和YT之间仅为42％，说明氨氧化细菌具有地理分布的规律：17个amoA基因序列可以被聚成6个cluster，分属Nitrosospira和Nitrosomonas两个属。三种农田土壤中均存在丰富的氨氧化细菌，表明氨氧化细菌在农田土壤氮素循环中具有重要作用。
土壤N素循环主要是微生物驱动的转化过程，然而对其的驱动与调控机理了解还很不够。选取长沙黄兴镇蔬菜基地两种蔬菜土研究硝化抑制剂（DCD）对N素转化过程及功能微生物的影响。试验通过室内土壤培养，处理为单施尿素（CK）和尿素与硝化抑制剂双氰胺配合施用（DCD），重复3次。在培养过程中系统监测了土壤中NH4＋ -N、NO3- -N含量变化，同时采用荧光定量PCR（real—timePCR）方法研究硝化抑制剂对土壤中氮素转化功能基因丰度的影响。结果表明：在培养过程中DCD处理使两个供试土壤的NH4浓度稳定在较高水平，而NO；浓度则明显低于对照；施用DCD导致土壤中硝化基因amoA丰度显著减少，而对16SrRNA和反硝化基因nirK丰度没有产生明显影响。因此，DCD在菜地土壤中主要通过抑制氨氧化细菌的繁衍来抑制硝化作用。
为揭示农业生产中长期大量施用化学肥料对土壤硝化过程微生物种群的影响及其与土壤硝化能力的偶联关系,本研究通过在长沙黄兴蔬菜基地采集长期连作蔬菜（20 a以上,VL）和短期蔬菜种植地（2 a左右,VS）表层土壤（0～20 cm）,利用末端限制性片段多态性（T-RFLP）和实时定量PCR（Q-PCR）等手段系统研究了蔬菜连作对氨氧化细菌（ammonia-oxidizingbacteria,AOB）和氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea,AOA）的组成和丰度的影响及其与土壤硝化势的偶联关系.结果表明,长期蔬菜连作显著使得土壤中AOB amoA的组成趋于单一,同时也影响了土壤中AOA amoA的群落组成;RDA分析结果表明,影响AOB amoA群落结构的主要土壤因素为土壤pH以及Olsen-P的含量.土壤中AOA amoA基因拷贝数明显高于AOB,平均为细菌丰度的6倍,但土壤硝化势（PNF）与土壤中AOB amoA基因丰度成显著的正相关,而与土壤中AOA amoA基因丰度没有显著的相关性.尽管多年蔬菜连作对AOB和AOA丰度的影响还不清楚,却使得AOB优势种群富集,土壤硝化能力增强.
为了解析DO浓度对附积床反应器脱氮系统中COD、NH^4＋-N、TN去除效率的影响,以及对氨氧化菌群（AOB）结构及多样性的影响,分析了DO分别为1.0～2.0,2.0～3.0,3.0～4.0mg/L时COD、NH^4＋-N、TN去除效率,并采用针对AOB功能基因氨单加氧酶（amoA）的限制性内切酶片段长度多态性技术（RFLP）分析了三组DO浓度下反应器中AOB的群落结构及多样性.结果表明,不同DO条件下,系统均取得较高的COD和NH^4＋-N的去除效果, NH^4＋-N的去除效率随着DO的增加而提高.不同DO浓度下反应器生物膜上AOB菌群多样性丰富,且与DO对AOB菌群的多样性影响较小相比,DO对AOB的菌群结构及种类的影响较大.
以编码氨单加氧酶基因amoA作为氨氧化细菌的功能基因标志物,采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）和扩增产物序列分析方法,研究南疆枣树与棉花间作和单作不同栽培模式下土壤氨氧化细菌群落结构和多样性差异以及与土壤理化因子的相关性。结果表明,枣树与棉花间作改变了土壤氨氧化细菌群落结构组成,与纯枣林、单作棉田差异显著,相似性低于60%。间作复合系统内冠下区、近冠区及不同层次的土壤中氨氧化细菌群落结构具有水平和垂直方向的空间变异性。系统发育分析表明,枣树与棉花间作、纯枣林和单作棉田土壤中氨氧化细菌均隶属于β-变形菌纲（β-Proteobacteria）的亚硝化螺菌属（Nitrosospira）和不可培养的氨氧化细菌,以Nitrosospiracluster 3a为优势菌。间作土壤中还有cluster 3b、cluster 1和cluster 4,群落组成较单作丰富。典范对应分析结果显示,有机碳（TOC）、全磷（TP）、速效磷（RP）和硝态氮（NO3-N）含量对不同种植模式下氨氧化细菌的种群结构影响显著（P〈0.05）。枣树与棉花间作显著提高了土壤氨氧化细菌的多样性,Shannon指数、均匀度指数和丰富度均高于纯枣林和单作棉田。土壤全磷、铵态氮、硝态氮、pH值和土壤含水量是显著影响多样性指数的关键理化因子（P〈0.05）。
【目的】研究自然界中氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea,AOA）对于理解全球氮循环起着至关重要的作用,但人们对高原湿地AOA种群生态还知之甚少。本研究旨在了解若尔盖高原湿地土壤AOA群落组成及多样性。【方法】从若尔盖高原阿西（A＇xi）、麦西（Maixi）和分区（Fenqu）3个典型牧区采集土壤样品,提取土壤总DNA,利用AOA氨单加氧酶（ammonia monooxygenase,amoA）基因通用引物扩增amoA基因,构建amoA基因克隆文库。从每个克隆文库中随机挑选80个阳性克隆子用于后续限制性酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）分析,挑选不同酶切类型的克隆子进行测序、比对,利用MEGA 5.0软件构建amoA基因系统发育树。【结果】从3个克隆文库共240个AOA amoA基因阳性克隆中得到15条代表序列,通过Mothur软件进行OTUs（operational taxonomic units）分类得到7个不同的分类单元。其中OTU 6为优势类群,在3个克隆文库均有发现,约占所有特异性克隆子的27%。15条amoA基因序列分属于Zoige Wetland Clade 1（4 OTUs）、Zoige Wetland Clade 2（2 OTUs）和Zoige Wetland Clade 3（1OTU）3个系统发育分支。BLAST分析显示所有OTUs均归于泉古菌门（Crenarchaeota）。相关性分析表明,若尔盖高原湿地AOA多样性指数与土壤铵态氮和硝态氮含量存在显著的相关性（P〈0.05）。【结论】若尔盖高原湿地中AOA多样性较低,均属于泉古菌,且与土壤中氨态氮和硝态氮密切相关。
【目的】氨氧化古菌（ammonia-oxidizing archaea,AOA）可能通过近期刚发现的3-羟基丙酸盐/4-羟基丁酸盐途径（3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate cycle,HP/HB）来固定CO2,在海洋和土壤环境下进行化能自养型生长。云南热泉系统已被证明具有丰富的AOA多样性。本论文旨在调查云南不同热泉中,这种CO2固定途径的关健酶——乙酰辅酶A羧化酶基因acc A和古菌氨单加氧酶基因amo A,及原核微生物16S rRNA基因的丰度变化,以及它们与环境因子的相关性。【方法】选择20处代表性热泉沉积物样品,通过荧光定量PCR技术,获得各目的基因丰度;利用R软件包对各样点地化参数进行主成分分析（Principal Component Analysis,PCA）,并通过Mantel test检验各目的基因和地化参数间的相关性。【结果】细菌和古菌16S rRNA基因的丰度范围分别在6.6×107至4.19××106至1.51×1011拷贝/g沉积物;古菌acc A和amo A基因的丰度范围为8.89×103至6.49×105和7.64×103至4.36×105拷贝/g沉积物,Mantel test结果显示acc A和amo A基因丰度间具有极显著的相关性（R=0.98,P〈0.001）,两者又分别都与热泉内的NO2-和NO3-浓度存在显著相关,与p H值等其它环境因子没有明显统计学意义上的相关性。【结论】云南地区热泉间的细菌和古菌丰度,以及两者比例关系都存在较大差异;相关性的统计结果进一步证明了热泉环境下的氨氧化古菌是通过HP/HB途径进行CO2固定;本次研究并未发现氨氧化古菌的丰度与环境p H存在明显统计学意义上的相关性,这与常温土壤环境的相关研究结果存在不同。
【目的】以艾比湖湿地盐节木（Halocnemum strobilaceum）、芦苇（Reed）及盐角草（Salicornia）三种植物为对象,研究其根际土壤氨氧化细菌（AOB）的群落多样性。【方法】利用PCR-RFLP的方法,构建氨氧化细菌amo A基因克隆文库,进行系统发育分析。结合三种植物根际理化因子特点,探讨三种植物根际AOB群落结构组成的特点。【结果】通过序列多态性分析表明,三种植物根际土壤AOB amo A基因克隆文库中的所有序列均属于β亚纲（β-Proteobacteria）中的亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）及Nitrosomonas-like,未发现亚硝化螺菌属（Nitrosospira）。三个AOB amo A基因克隆文库分别包括9个OTUs、12个OTUs和7个OTUs,其文库覆盖度均达99%以上,代表性强。三个文库的丰富度、Chao1指数、ACE指数、Shannon指数均为R〉H〉S。【结论】三种植物的AOB多样性为芦苇〉盐节木〉盐角草,并且其最优氨氧化菌群各不相同。本研究为系统认识艾比湖湿地植物根际氨氧化细菌群落多样性和结构组成提供了基础。
基于南海北部陆坡不同深度梯度3个站位表层沉积物古菌氨单加氧酶基因（amo A）文库,对3个站位氨氧化古菌进行多样性和系统发育学分析。多种方法构建的系统发育树表明：3个站位所有的amo A基因序列都隶属于奇古菌门中Group I分枝内的Group I.1a系群,且各站位之间氨氧化古菌多样性没有明显的差异。501站位黑色砂质沉积物中古菌amo A基因与该站位的16S r RNA基因的系统发育比对显示：这2种基因标记的系统发育树整体上具有潜在的对应关系,说明对样品的氨氧化古菌多样性分析比较全面且可靠;并进一步暗示该样品中氨的硝化作用主要由奇古菌门下的Group I.1a系群来执行。由此可以推测：Group I.1a系群可能在南海北部表层沉积物中氮素的生物地球化学循环过程中扮演重要的角色。
堆肥化过程中，氨氧化微生物对堆肥原料的氮素转化和氮损失影响重大。为了分析牛粪堆肥高温期微生物的多样性，研究以氨单加氧酶基因（帆胡）为标记，分析了牛粪堆肥高温阶段氨氧化古菌（Ammonia-OxidizingArchaea，AOA）和氨氧化细菌（Ammonia-OxidizingBacteria，AOB）菌群多样性。结果表明，在AOB类群中，亚硝化单胞菌属（Nitrosomonas）和亚硝化螺菌属（Nitrosospira）克隆子数量分别占整个克隆文库的59．3％和40．7％，它们是堆肥高温期的优势氨氧化细菌，但是Nitrosomonas的数量比Nitrosospira更占优势。在AOA群落中，soil／sediment菌群占据绝对数量优势，其克隆子数量占AOA文库的94．2％，sea／sediment菌群仅占5．8％。
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