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【求助】PCR扩增得到类似目的条带，测序结果BLAST只有引物和部分序列正确，其他什么都不是，紧急求助
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这个帖子发布于7年零69天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大侠好，我扩增病原基因组DNA的某已知序列，根据已发表文章可扩增出目的条带的引物序列，在生工合成引物，温度梯度，镁离子梯度均做过，在退火49度，Mg2.0时得到与目的条带大小相似的条带，连接转化，菌液PCR出现阳性带，测序结果非常诡异：片段大小1340bp正常，但只有引物序列与目的基因相同，其他1300多bpNCBI-BLAST没有匹配结果，有零星几十碱基是该病原基因组DNA，不知道什么原因。请各位指教。
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应该是把载体扩出来了。你的载体+目的基因有多大？
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克隆引物49°退火？低了点吧，比对过文章的引物可靠吗？
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现在认为是引物不够特异，但是不管什么温度都出不来我的目的条带，有可能是体系没调好，或者是酶不够好吗？
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嗜铬细胞瘤SDH基因及缺氧相关因子的研究.pdf 111页
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中国协和医科大学
博士学位论文
嗜铬细胞瘤SDH基因及缺氧相关因子的研究
姓名：周亚茹
申请学位级别：博士
专业：内分泌与代谢学
指导教师：曾正陪;陈原稼
中国悱和医科大学博士学位论史
嗜铬细胞瘤琥珀酸脱氢酶SDH基因突变的研究
嗜铬细胞瘤是引起继发性高血压的重要原因，其发病机制目前还不完全清
楚，临床上早期鉴别良、恶性肿瘤尚有困难。随着分子生物学技术的发展，发现
线粒体琥珀酸脱氢酶(succinate
在嗜铬细胞瘤中存在一定的突变率。我们对北京协和医院63例嗜铬细胞瘤患者进
探讨SDHB、SDHD基因的遗传学改变在早期发现及诊断嗜铬细胞瘤中的意义。
瘤患者63例，其中肾上腺嗜铬细胞瘤4l例，肾上腺外副神经节瘤22例；63例
患者中有家族史的15例。选择20例健康人作为正常对照。对上述63例患者、
因突变检测。
直接测序法，筛查嗜铬细胞瘤患者的SDHB、SDHD基因突变。
l、63例嗜铬细胞瘤患者中仅有2例发生SDHB基因突变，突变发生率为3．2％
(2／63)。发生突变的均为散发性肾上腺外副神经节瘤患者，突变均出现在第7
号外显子上。其中1例为错义突变：g．692
Medline检索均未见到相关文献报道。
2、63例嗜铬细胞瘤患者中未检测到SDHD基因突变。
1、本研究在肾上腺外副神经节瘤患者中检测到2种新的SDHB基因突变类型，
中国融和医科人学博上学位论义
SDHB基因的突变率为3．2％，未检测到SDHD基因突变。
2、检测SDHB基因突变对于早期筛查肾上腺外副神经节瘤患者可能具有一定意
嗜铬细胞瘤，肾上腺外副神经节瘤，琥珀酸脱氢酶(SDH)，琥珀酸脱氢酶B基
冈(SDHB基冈)，琥珀酸脱氢酶D基因(SDHD基因)，突变
中冈卧和医科人学博1．学位论文
mutationsofsuccinate
Study genetic
dehydrogenase
pheochromocytoma
Pheochromocytoma
tobeclarified．Itisstilldifficultto
pathogenesisyet
distinguishmalignant
pheochromocytomabenign
earlystage．Withdevelopment
mutationsinsuccinate
biologicaltechnique，it
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内蒙古白绒山羊KAP基因克隆、序列分析及PCRSSCP检测
内蒙古农业大学 硕士学位论文 内蒙古白绒山羊KAP基因克隆、序列分析及PCR-SSCP检测 姓名：孟伟星 申请学位级别：硕士 专业：动物遗传育种与繁殖 指导教师：李玉荣
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｂｙ ＰＣＲ―ＳＳＣＰ ｏｆ ＫＡＰ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｃａｓｈｍｅｒｅ ＧｏａｔＡｂｓｔｒａｃｔＦｉｒｓｔ，Ｃａｓｈｍｅｒｅｇｏａｔ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍ ｔｈｅｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ ｉｎ ｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ，Ｐ １／Ｐ２ ａｎｄ Ｐ３／Ｐ４，ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ＫＡＰ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｗｏ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ，Ｓ Ｉ ａｎｄＳ２，ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙＰＣＲ．ＴｈｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗａｓ ｌｉｇａｔｅｄ ｂｙ Ｔ４ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｓａｃ ＩＩ ａｎｄ Ｎｏ ｔ Ｉ ｓｉｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｌａｓｍｉｄｐＯＭ?ＴＶｅｃｔｏｒ．Ａｎｄｔｈｅｎ，ｂｙｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｓｔｅｐｓ：，ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＴＯＰＩＯ，ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ，ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ｒｅｓｔｒｉｃｔｌｙ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄｓ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｎｇ，ｗｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｔｈｅ Ｃａｓｈｍｅｒｅ ｇｏａｔ ＫＡＰ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｓ １ ａｎｄ Ｓ２．Ｓ １ ｈａｓ ２８９ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｓ２ ｈａｓ ３０４ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｓ２ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｓａｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ７ Ｉ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｅｄｉｅａｔｅｄ．ｔｈａｔ ｔｈｅＳ２ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｈｅ ＳｐｅｃｉｆａｒｅＮ?ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｏｍａｉｎａｎｄｃａｒｂｏｘｙｌｔｅｒｍｉｎｕｓ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｄｏｍａｉｎ ｔｈａｔｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＫＡＰ６ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ．Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｃａｓｈｍｅｒｅｇｏａｔ ＫＡＰ ｇｅｎｅ ｂｅｔｗｅｅｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｐｅｃｉｅｓｍａｍｍａｌａｒｅｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ．ＳＮＰ（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔｒｅｓｅａｒｃｈｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．Ｆｉｒｓｔ，ｔｈｅ ＰＣＲ―ＳＳＣＰ ｗｉｔｈ ａｂｏｕｔ ３００ｂｐ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ａｎｄ ｔｈｅｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄＫＡＰａｓ ａｃａｎｄｉｄａｔｅ ｇｅｎｅｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙ ａｎｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｔｗｏ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆＫＡＰ ａｍｏｎｇ Ｃａｓｈｍｅｒｅ ｇｏａｔ ｂｙ ＰＣＲ―ＳＳＣＰ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｌｏｃｕｓ Ｓ２ ｉｎ ｔｈｅｇｅｎｅｓ（ＫＡＰ６。１）ｗｈｉｃｈ ｃｏｄｅｔｈｅ ｈｉｇｈ－ｇｌｙｃｉｎｅ―ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｅｒａｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ―ｐｒｏｔｅｉｎｏｆ ｋｅｒａｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ―ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ ｉｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｗｉｔｈ ｃａｓｈｍｅｒｅｙｉｅｌｄ（Ｐ＜０。０５）．ＡｍｏｎｇＡＡ ａｎｄｔｈｅ ｈｉｇｈ―ｇｌｙｃｉｎｅ―ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｅｒａｔｉｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ―ｐｒｏｔｅｉｎ，ｔｈｅａｒｅＢＢ．ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｓ２ａｌｓｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｗｉｔｈａｒｅｃａｓｈｍｅｒｅｙｉｅｌｄ＠＜Ｏ。０５）．ＴｈｅＡＢ ａｎｄ ＢＢ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｏｆ Ｓ２ａｌｓｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｗｉｔｈ ｃａｓｈｍｅｒｅ ｆｉｎｅｎｅｓｓｔｒａｉｔ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｋｅｙ Ｗｏ ｒ ｄ ｓ：Ｃａｓｈｍｅｒｅ Ｇｏａｔ ｔ ＰＣＲ?ＳＳＣＰ；Ｋｅｒａｔｉｎ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓ趣Ｄｉ ｒｅｃｔｅｄ ｂｙ：Ｐｒｏｆ。ＬＩ Ａｐｐ Ｉ ｉ ｃａｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ》 （Ｃｏｌｌｅｇｅｏｆ Ａｎｉｍａｌ ＳｃｉｅｎｃｅＹｕｒｏｎｇ ｄｅｇｒｅｅ：ＭＥＮＧ Ｗｅ ｉＸｉｆｏｒＤｏｃｔｏｒｎｇ《ａｎｉｍａｌｇｅｎｅｔｉｃｓ ｂｒｅｅｄｉｎｇａｎｄ．ａｎｄＭｅｄｅｃｉｎｅ，ＩｎｎｅｒＭｏｎｇｏｌｉａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵ魏ｉＶ尊ｆｓｌ娘嚣。董ｌ魏ｏｌＯ１００１８，Ｃｈｉｎａ）内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明‘本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工俸及取得的研究成杲。器我所知。除了文中特别加以标注和致谢酊 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果：’也不包 含为获得我校或其他教育枫构的学位或证书面使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献筠已在论文中作了嬲确的说’明并表示谢意ｔ申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任．论文作者签名：鑫丝忽暑期：兰兰堕：；：１内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权警本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，印：研＇●究垒在攻读学位期闻论文工作的知识产权单位属．内蒙古农业大学。本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师药通讯作者，．通讯作者单位亦署名为内蒙古农业● ●大学．学校有权保留并匈国家有关部门或机构送交论文酶复印件和毫：，子文档，允许论文被查阅和借阅．学校可以公布学位论文的全部或部 分蠹容‘（保密内容除外），呆用影印、缩印或其他手段保存论文。指导教癖签名。：乞蹲论文作者签名：。红垡坠内蒙亩农业大学农硕士学位论文１１弓ｌ言 山羊（Ｃａｐｒａ ｈｉｒｃｕｓ）属哺乳纲，偶蹄且，牛科，山羊属“１。山羊主要有奶山羊、肉用山羊、毛用山羊和绒山羊几种类型。世界上的绒山羊根据毛被结构中绒毛与粗 毛长度和重量比的差异基本分为两大类，一类是以我国产绒山羊为主的开士米型粗毛山羊，毛长绒短，外层毛被为较长的粗毛，被毛的底层生长着较短的绒毛，只有 分开毛被才能看到绒毛，毛多绒少。另一类是以俄罗斯产绒山羊为主的绒毛型绒山 羊，绒长毛短，外层生长着毛茸茸的绒毛，粗硬的有髓毛分布于下层，只有分开绒 毛才能见到粗毛，绒比毛多跏。不同个体的绒山羊所产的羊绒的特征变化很大，例 如光泽度、柔软度、颜色、细度长度和披力强度等，都是羊绒品质的重要指标。毛 发上的这些差异是由毛囊角蛋白及其关联蛋白的基因或蛋白序列的差异造成，还是 有其他因素，其具体机制尚不清楚。最近在绵羊上经过ＰＣＲ－ＳＳＣＰ的分析，证明羊毛纤维组成基因ＫＡＰＩ．３的的外盟子序列和ＫＡＰ６．１基因部分序列，已经间接成为 精细羊绒性状的候选基因。１．１山羊的主要品种及特征世界上的绒山羊基本分为两大类，一类是以我国产绒山羊为主体的开士米型粗 毛山羊；另?类是以俄罗斯产绒山羊为主体的绒毛型绒山羊。它们分布在世界２０ 多个国家和地区，有４０多个品种，８５％分布在亚洲地区。其实他们大多是非专门化品种，粗毛和绒毛的重量比为７：３左右，产绒量平均为ｌＯＯｇ。经过产绒性能系统选育，绒毛占毛绒总量的５０％以上，产绒量达到３００９以上的专门化绒山羊品种并 不多，它们分属于上述两大类型。１。１。１绒毛型山羊 绒毛型山羊以俄罗斯顿河山羊为主要代表，特点是绒长毛短，冬春季节从外观 上看，生长着毛茸茸的绒毛，粗硬的有髓毛都隐藏在绒毛中成为下层毛。只有分开绒毛才能见到粗硬的有髓毛。绒比毛多，一般绒含量约占毛绒总量６０％以上，其中 顿河山羊含绒量高达８０％以上。主要品种有顿和绒山羊、奥伦堡绒山羊和巴音乌拉 盖山羊。这种羊的绒琵发生和遗传影响机制有待深入研究，这对绒山羊育种具有十分重要的意义。。１．１．１．１顿河山羊 产于俄罗斯的一个古老山羊品种，主要分布在伏尔加勒州、沃罗涅日科和罗斯 托夫州，成年公羊产绒量９３８９，母羊６５６９，体重分别为６０ｋｇ和３６ｋｇ，绒细度平均 ２０．８ｐｍ，绒长８ｃｍ以上，产羔率１２０％一－１２８％。俄罗斯用这一品种与各地方山羊杂交，Ｆ。与Ｒ产绒可达３００＂－＇４００９。２．内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测ｔ．１．１．２．奥伦堡绒山羊 产于俄罗斯的奥伦堡州和哈萨克斯坦共和国，特级公羊产绒量４２３９，一级公 羊４０３９，特级母羊４１５９，一级母羊３４５９，特级公母羊体重分别为６０ｋｇ和４０ｋｇ， 绒细度１６．３～６．７１ａｍ，绒长５．７ｃｍ，白色，产羔率ｉ ｉ０％＂－１３０％。１．１．１．３巴音乌拉盖山羊 主要分布在蒙古西部的巴音乌拉盖省，这一品种的羊由俄罗斯阿尔泰山羊同当 地山羊杂交而成，核心群约３Ｙ／Ｐ，，杂种羊有６万只，该品种成午公羊产绒７００，－－，７６０９，母羊产绒５５０９，细度２７＂２８ｐｍ，绒长７～８ｃｍ，净绒率６５％己７０％。１．Ｉ．２开士米型粗毛山羊 开士米型山羊主要分布在喜马拉雅山周围的国家和地区。其特点是毛长绒短， 外层毛被有较长的粗毛，被毛的底层生长着较短的绒毛，只有分开毛被才能看到绒 毛，有明显的季节性脱毛现象。春天转暖后，毛囊发生变化，毛根断裂，先是绒毛 脱落，随后粗毛也随之脱落，在生长出春季毛被，秋后绒毛重新长出，充实毛被， 准备越冬。主要品种有辽宁绒山羊、内蒙古白绒山羊、蒙古绒山羊和巴基斯坦绒山 羊。１．１．２．１辽宁绒山羊产于中国辽东半岛盖县、复县等地。育种核心群成年公羊平均产绒量１２３０９， 最高记录１５４０９，母羊平均５１５９，最高记录ｉ０２５９，二岁公羊平均８５０９，周岁母羊４６７９；绒细度１３．５～１６．８岬，绒长度６ｃｍ以上，净绒率７８．６％－－一８３．３％，产羔率１２０％～１４０％。● ●１．１．２．２内蒙古白绒山羊．产于中国内蒙古自治区阿拉善盟、鄂尔多斯市、巴彦淖尔盟。成年公羊平均产绒量４８３．ｉｇ＿１１２．５９，母羊３６９．４５＿＿＿３９．２７９，周岁公羊３６８．６２±９４．０１９，周岁 母羊３２１．６２＋７５．１２９；体重分别为３７．５ｋｇ，２７．２１ｋｇ，２２．８９ｋｇ和１９．２２ｋｇ。山羊绒品质好，色白，细度１３＂－１５ｐａｎ，绒长５ｃｍ以上，净绒率４５％～７０％。１．１．２．３蒙古绒山羊产于蒙古国，与中国内蒙古白绒山羊外形特征相似，公羊产绒量２８９．５９，母 羊３１０．７９；体重分别为５０ｋｇ和３５ｋｇ，绒细度１４．２７～１５．４５Ｉ．ｔｍ，绒长３．８７＂－＇５．Ｉｃｍ，．色白。内蒙古农业大学农硕士学位论文３１。１。３。４印度和巴基斯坦绒山羊印度较好的产绒山羊有勘哥尔山苇，分布在高山地区，个体较小，被毛多为自色，也有灰色和棕色羊，产绒量１１９－－－１９０９，绒缨度为１１＂－－羔３鹏。克什米尔山羊主要分布在印度的克什米尔省以及印度与巴基斯坦接壤地区，克什 米尔山羊５０％呈黑色，４０％为灰色，１０％为白色。远在１５世纪，．印度就组织山羊绒围巾纺织作坊，出口到欧州各国，由于出产于克什米尔地区，所以山羊绒英文名Ｃａｓｈｍｅｒｅ亦即由此丽来，‘中文翻译成开士米。世界上几乎没有完全以产绒为目的的绒山羊品种，多数绒山羊都是绒肉兼用口１。 我国绒山羊品釉繁多，目前正式列入《中国羊品种志》的山羊有２３种，产绒山羊 主要分布于北纬３８。＂－４２。，东经７６。一－１２５。的干旱山区、荒漠和青藏高原地区， 产区四季分明，年均气温１４℃以下，冷季大多在１２０－一３００ｄ左右Ⅲ。其中绒山羊著 名品种有三个：辽宁绒山羊、内蒙古白绒山羊、河西绒山羊。产绒的普通山羊品种 有四个：西藏山羊、薪疆山羊、太簿山羊、中卫山羊。另外还有一些分数在各地， 虽没有列入晶种志，但已经过选育和正在选育的地方品种麟】。１。２绒山羊生产概况 ２０世纪８０年代以来，随着世界羊绒市场的崛起，羊绒价格上浮，市场上对羊 绒产品的大量需求推动了生产与科研的发展，越来越多的国家都在加快发展绒山羊业。网前在豳际贸易中占一席之地的绒山羊饲养国有蒙古、中国、俄罗斯、伊朗、 阿富汗、伊拉克、印度、巴基斯坦、土耳其等，另外，澳大利亚，新西兰、英国等 一些传统羊毛生产国也争相发展绒山羊业。中国是世界上主要的羊绒生产国。中国 的原绒产量和贸易量约占世界的５０％，２００３年底，中国有绒山羊６０００余万只，居 世界第一位，产绒量达１０９６８吨，其中内蒙古自治区有１３５６。６万只，产绒３９９９吨。 山羊绒的主要进口和加王国是英国、美国和日本，其中英国加工量最大，在国际市场中占６０％的份额口】。１．３绒山羊育釉研究进展 绒山羊是具有多种用途的山羊品种，其产品多样，特别是山羊绒，是山羊被毛 中居予下层，由次级毛囊生长的无髓绒毛纤维，在国际市场上独具特色。由于这种纤维特细、洁白、手感柔软、光泽明亮，是一种传统丽名贵、高级的纺织原料，其 织品因具有“细而柔软、轻而保暖”的特点，因而被誉为“纤维中的宝石＂和“软 黄金＂而畅销全球、经久不衰。山羊绒是高档外贸商品，价格一直昂贵，这就促进 了绒山羊业的发展，不仅传统绒山羊饲养国积极开展绒山羊的选育与研究工作，而 且象澳大刹亚、新嚣兰、英国、美国等一些畜牧国家也相继开发和建立绒山羊基地， 并研究通过放牧山羊来控制杂草灌本，改良草地，与此同时大力开展科学研究，提４内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ．ＳＳＣＰ检测高绒山羊的生产水平。中国由于得天独厚的绒山羊资源优势，在绒山羊选育中取得 了巨大的成就，积累了丰富的资料，但绒山羊遗传育种工作比之其他畜种基础较差、 起步较晚、研究的水平仍然偏低，尚有许多工作需要开展ｎ?射。１．４分子标记在山羊遗传育种中的应用 １．４．１分子标记与山羊的起源、进化 １９７７年，Ｕｐｈｏｌｔ等首次用限制性内切酶消化山羊ｍｔＤＮＡ，并用电镜法测得 ｍｔＤＮＡ的总长度为１５．８ ｋｂ；随后，Ｃｒｏｎｉｎ叫和陈宏等伪１零星报道了山羊ｍｔＤＮＡ多态性的研究内容。目前公认ｍｔＤＮＡＲＦＬＰ分子标记适合研究山羊的起源进化。１９９９ 年，李祥龙等ｎ町用１４种限制性内切酶对１８个地方山羊品种的ｍｔＤＮＡ的ＲＦＬＰ进 行了研究，结果提示我国地方山羊品种起源于两种不同的母系祖先。这一结果与常 洪等ｎ订利用血液蛋白多态性对黄河中下游流域固有的１６个山羊品种模糊聚类的研 究结果相似。贾永红等ｎ２１用１５种限制性内切酶研究了贵州省四个山羊品种的 ｍｔＤＮＡ多态性，聚类分析结果表明，贵州山羊的ｍｔＤＮＡ单倍型Ｉ和单倍型ＩＩ可能 来源于两个母系祖先，分化时间在１９万年前，这一结论支持了现有家山羊有镰刀型角羊骨羊和螺旋状角羊骨羊两个野生祖先的观点。李祥龙ｎ∞利用１８种限制性内 切酶研究了来自欧洲、非洲及国内的５个山羊品种共计３３个个体的ｍｔＤＮＡ，结果 显示受试山羊可能有两种不同的母系来源，各品种的分子聚类图支持受试山羊品种 可能有不同的野生祖先的结论。１．４．２分子标记与山羊群体亲缘关系及群体遗传结构分析分子标记可用于山羊群体亲缘关系以及山羊群体的遗传结构分析。李瑞彪ｎ町 对西农萨能奶山羊进行了ＲＡＰＤ遗传特性研究，结果表明６条引物平均带纹共享率 为０．８８０８±０．０８６０，其遗传多样性指数介于２．２１２０＂－＇２．２６７４之间，这说明西农萨能 奶山羊多态性丰富；赵艳红拍１利用微卫星标记对中国４个山羊品种６个群体共计２４０ 个个体平均杂合度、平均多态信息含量和平均有效等位基因数等遗传多样性指标进 行分析和研究。孙允东ｎ∞采用微卫星标记在２７个位点对山东四个地方山羊品种进行了遗传多样性评价并在品种内进行了亲缘关系分析：王杰等ｎ町曹少先扭¨、刘长国ｃ一町，分别研究了青龙本地山羊和布尔山羊杂交后代及其亲本、安哥拉山羊及其杂种山羊、布尔山羊和江苏本地山羊、陕西境内５个山羊品种的遗传多样性：李祥龙等叫利用１９种随机引物研究了我国及原产于欧洲和非洲的２３个山羊品种的的２５１个 个体的随机扩增多态ＤＮＡ，结果表明山羊核基因组存在较为丰富的遗传多样性和 明显的遗传分化，品种间的分子聚类结果反映了各山羊品种间的亲缘关系及所处的 地理位置和育种历史，支持现在的家山羊混合起源的学说；陈宏啪１用ＤＮＡ指纹技 术对黑头山羊和哈德施努比克有角白绵羊两个品种进行研究，发现个体间存在不同内蒙古农业大学农硕士学位论文５程度的近交；秦国庆等利用ＲＦＬＰ和ＲＡＰＤ对亚东山羊和高原型藏山羊的亲组缘关 系及群体遗传结构进行了研究：王杰等Ⅲ’对四川的安哥拉山羊、布尔山羊和建昌黑 山羊和成都麻山羊等几个山羊品种和岩羊的ＲＡＰＤ进行分析，结果表明山羊群体间 的相似系数为０．８２１６．０．９３６２，山羊各群体与岩羊的遗传距离为０．４９３６＂０．５４０３：Ｌ ｙａｎｇ［＇ｎ通过微卫星标记研究了山羊品种间的遗传距离和进化中的血缘关系，结果表明辽宁绒山羊和内蒙古绒山羊具有较近的进化关系，而湖北马头山羊和藏羊与之在 进化中属于不同的系统；Ｌｕｉｋａｔ∞１用２２个分别来源予山羊、绵羊和牛的微卫星标记 研究内蒙古绒山羊的父系测定，具有极高的准确率。尹俊等矧对内蒙古白绒山苹、鸟珠穆沁绒山羊、辽宁绒山羊和罕山绒山羊的ＤＮＡ的ＲＡＰＤ标记作了聚类分析； 刘小林汹’利用ＲＡＰＤ分析了辽宁绒山羊、子午岭山羊、关中奶山羊群体间遗传相似畦：１．４，３分子标记与山苹的重要经济性状 ＤＮＡ遗传标记多态性丰富、遗传稳定，使得在ＤＮＡ分子水平上寻找与山羊生 产性能相关的分子标记成为可能。耿社民等洲对１２７个辽宁绒山羊血液蛋白质座位 与经济性状的遗传关系分析，结果表明ＰＡ．３２．２基因型对产绒量和体重方面的ＬＳＥ都显著地大于其他基因型，而且ＰＡ．３基因座的选择反应最大，可作为多个性状标记辅助选择的标记基因型；啪型、ＥＳＤＢＢ型可作为产绒量的标记基因型，ＬＡＰＡＢ胎次产奶性能比ＡＢ、ＢＢ型个体好（Ｐ＜０．０５）；沈伟鲫对青海省境内的柴达木山羊、 辽宁绒山羊和柴达木绒山羊三个山羊群体进行了血液蛋白蒋和分子遗传标记的多 态性及其与经济性状的关系进行了分析。李瑞彪等ｎ帕对西农萨能奶山羊Ｂ－ｌｇ基因 ５’进行ＰＣＲ．ＲＦＬＰ分析，发现Ｂ．１９基因５’侧翼区基因型为ＡＡ型个体产奶量第二、型可作为体重的标记基因型。陈宏等嗍利用ＰＣＲ．ＳＳＣＰ技术对西农萨能奶山羊ＣＳＮ３基因第４外显子基因多态性进行研究，结果发现ＡＡ基因型个体在第一、第四及总三胎次和前四胎总产奶量３项指标上均比ＡＢ型高（Ｐ＜Ｏ．０５）。李祥龙等㈣对青龙本 地山羊ＲＡＰＤ与体重指标进行了相关性分析，结果显示多态标记Ｋ０９Ｂ、Ｐ１４Ｄ、Ｑ１４Ｄ 及其互作效应对体重体尺有显著影响；王杰等渊对安哥拉山羊及其与建昌黑山羊杂 种山羊ＤＮＡ指纹图谱分析表明，在安哥拉山羊种有两条２．３ ｋｂ和８．６ ｋｂ特异性谱带出现的频率为１００％，而在建昌黑山羊中则为０，因此他们推测这两条特异性条 带可能与马海毛性状相关；曹少先ｍ’利用随机引物对布尔山羊公羊组织ＤＮＡ进行 扩增，结果表明ＯＰＨ０７．４、ＯＰＨｌ３．６、‘ＯＰＨｌ５．６、ＯＰＥｌ７．４、ＯＰＥｌ８．８对断奶重、哺乳期平均日增重有显著影响；ＯＰＨ０５．１、ＯＰＨｌ３．６、ＯＰＨｌ３．８、ＯＰＥｌ８．２对多个个佛 体尺性状有显著影响，ＯＰＨｌ４．３、ＯＰＫ０９．５、ＯＰＫ０９．５以及ＯＰＨｌ４．５对平均每次采 精量、总采精量、冻后活力有显著影响。李瑞彪等ｎ封利用ＲＡＰＤ标记对西农萨能奶 山羊进行研究，发现６条对西农萨能奶山羊产奶性能有显著效应的标记条带，引物６内蒙古白绒山羊两个ｌｅＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ．ＳＳＣＰ检测ＯＰＷｌ９的标记条带Ｃ对西农萨能奶山羊的初生重、体高、体斜长和体重都有显著负效应（Ｐ＜Ｏ．０５），特别是对初生重的负影响达极显著水平；引物标记条带ＯＰＱ０５Ｂ也显示了对奶山羊胸围及体重的显著负效应。有资料显示，畜群的ｍｔＤＮＡ标记与 生产性状有一定的相关性，但该方面的研究在山羊中还未见报道。１．５角蛋白及其角蛋白关联蛋白 １ｊ５．１角蛋白及角蛋白关联蛋白的种类 角蛋ｔ刍（ｋｅｒａｔｉｎ）是一种抗机械、抗化学刺激的蛋白质，是角质形成细胞的主要 结构蛋白，是组成中间丝纤维蛋白的主要成分。角蛋白存在于所有高等脊椎动物体 中，在人类已经发现了至少４９种编码角蛋白的基因，它们表达于所有的上皮细胞 中，包括很多内在器官（单上皮）的单层上皮细胞，还有很多复杂的多层上皮（复层上皮）细胞。角蛋白的分类方法很多ｊ按物种可分为哺乳动物角蛋白、鸟角蛋白和爬行类角蛋白；按成分和结构可分为Ａ角蛋白和Ｂ角蛋白。Ａ角蛋白富含半胱氨酸 残基，二级结构几乎都呈Ａ２螺旋结构，二级结构之间形成大量二硫键，主要存在于哺乳动物。Ｂ角蛋白富含小侧链甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸残基，二级结构几乎都 呈Ｂ２片层结构，主要存在于鸟类和爬行类啪１。 角蛋白多基因家族由在各类上皮细胞中表达的软角蛋白和形成坚硬的角质化结构的硬角蛋白组成。软角蛋白大多存在于皮肤中，易于破坏，而硬角蛋白则难溶 于水，高度抑制蛋白酶的降解。毛纤维主要由硬角蛋白组成。有两个系统对羊毛纤 维中的角蛋白分类，早期的分类系统基于其所含蛋白质成份将角蛋白分为４个家族， 即高硫蛋白、低硫蛋白、超高硫蛋白和高甘氨酸．酪氨酸蛋白。第二个分类系统被 Ｒｏｇｅｒｓ和Ｐｏｗｅｌｌ提出，其基于是否毛囊或羊毛纤维中含有角蛋白中间丝（ＩＦ）。在这 个系统中，ＫＲＴｍ．ｎｘｐＬ（简写为玉ｑ盯ｍ．ｎｘｐＬ）用以分类中间丝角蛋白，而其它高硫、超高硫、高甘氨酸．酪氨酸蛋白用ＫＲＴＡＰｍ．ｎｘｐＬ（简写为ＫＡＰｍ．ｎｘｐＬ）分类，称为角 蛋白关联蛋白。对于角蛋白ＩＦ，ｍ为ｌ或２，分别代表了Ｉ型或ＩＩ型低硫蛋白家族。 对于角蛋白相关蛋白ＫＡＰ（也称为中间丝相关蛋白ＩＫＡＰｓ），ｍ代表了一个家族或一 个唯一的蛋白。其他的１１、Ｘ、Ｐ、Ｌ分别代表了组成成份的数量、变异体、拟基因和相似体口。跏。１．５．２角蛋白和角蛋白关联蛋白的结构 毛发角蛋白系硬蛋白，是一类具有结缔和保护功能的纤维状蛋白质。不溶于水、 盐液、稀酸或稀碱。角蛋白来源于外胚层分化而来的细胞，是这些细胞内的结构蛋 白之一。故角蛋白存在于发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、喙、丝及其他表皮结构中。角蛋白家族是一个多基因家族，是由多种氨基酸聚成的多聚长链物。角蛋白 在一级结构上分为主链和侧链，其主链是通过肽键连结构成的多缩氨酸链，２０多种内蒙古农业大学农硕士学位论文７Ｑ一氨基酸构成不同的侧链，各链的半赋氨酸中－－ＳＨ氧化形成二硫键，使肽键闻形成相当稳定的交互网络，侧链的种类和性质决定了角蛋自整体的物理和化学性质煳。另外，在焦蛋白大分子主链闻还形成盐键和氢键等空间联键。羊毛角蛋自赉１８种氨基酸残基构成，其中半胱氨酸占１２％。根据Ｘ射线衍射分析，是蛋白的空闻结 构有ａ．螺旋结构（ａ．角蛋囱）和１３。折叠片层结构（§．角蛋白）两种类型。前者如羊毛， 后者如丝心蛋白。由于焦蛋自含有较多的胱氨酸，故二巯键含量特别多，在蛋盘质 肽链中起交联作用，因此焦蛋白化学性质特别稳定，有较高的机械强度。羊毛凫蛋白自然状态下多是ａ螺旋结构，这种１１螺旋结构按照焦蛋自的纵轴方向平行有序地 排列，并形成具有极性的中间丝蛋白：填充在羊毛纤维中闻。不同种类的角蛋囱具 有类似的分子结构，分为螺旋杆状区、非螺旋的头区和尾区以及连接区。杆区有４ 个Ｑ螺旋片段即ｌＡ、１Ｂ、２Ａ和２Ｂ，片段之间为３个非ａ螺旋的连接区Ｌ１、Ｌ１２ 和Ｌ２。在ｌＡ起始区及２Ｂ结尾区有２个高度保守的区域，称为螺旋起始区（ＨＩＰ） 及螺旋结尾区（ＨＴＰ），分别与头区和尾区相连脚１。１。５。３毛发惫蛋白及其角蛋白关联蛋自毛发角蛋白属焦蛋白中间丝家族，成熟的动物毛发主要走嚣种主要的细胞类型 组成，一是较薄的重叠排列的表皮细胞，二是被表皮细胞包裹的多细胞的皮质层细 胞。毛发还有第三神细胞类型，主要蠢中央的髓质层细胞，但绒纤维没有中阀的髓 质层细胞。哺乳动物的细胞结构均具有复杂的细胞骨架，细胞骨架由三种基本的蛋白质和与其相结合的其它蛋白质所构成，即肌动蛋自微丝、肌管蛋囱的微管和中闻 丝。在羊毛中，大约有５０．１００种羊毛角蛋白‘驺１。这些角蛋自可分为两个大的类群， 微丝角蛋白（ＩＦ Ｋｅｒａｔｉｎ）和微丝角蛋白关联蛋自，也称为基质角蛋自（ＩＦ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｋｅｒａｔｉｎ．ＫＲＴＡＰ或ＫＡＰ）。ＩＦ有２个家族，即酸性（１型）和碱性（１Ｉ型）角蛋皇，脊椎动物的ＩＦ由５０多个基因编码洲，绵羊的Ｉ型和Ⅱ型基因分别位于ｌ ｌｑ２５．ｑ２５ 和３ｑ１４．ｑ２２。ｌ型基因约４～５ｋｂ，包含６个内含子；Ｉｌ型基因７＂－９ｋｂ，包含８个内含子ｍ】。１．５．４高甘氨酸／酪氨酸焦蛋白关联蛋白 依据氨基酸的成分，角蛋囱关联蛋皇分为三类哪！：第一类为高甘氨酸酪氨酸角 蛋白关联蛋蛊，由ＫＡＰ６．１１多基因家族、ＫＡＰ７和ＫＡＰ８所编码的。第二类为高硫角蛋白关联蛋自，它是由ＫＡＰｌ、ＫＡＰ２、ＫＡＰ３三个多基因家族编码的。第三类是超高硫角蛋白关联蛋白，它是豳ＫＡＰ４、ＫＡＰ５，两个多基匿家族编码的‘。ＫＡＰ基 因大多为小片段，大小一般在０．６Ｋｂ＇＂１。５Ｋｂ之间，并且都不含内含予。它钌通过 Ｃｙｓ间的二硫键将毛发角蛋白头尾相接形成微丝束。由于这些ＫＡＰ结构的复杂性， 这三个家族更进一步分为结构上明显不同的小家族。在人的笔发中ＫＡＰ进一步被８内蒙古囱绒山革两个ＫＡＰ基因克隆、序列分轿及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测分为三大组１７个家族，ＫＡＰｌ～ＫＡ玛和＆垤ｌＯ～ＫＡＰｌ６力离硫家族，Ｃｙｓ的分子 数少于３０％；ＫＡＰ４、５、９、１７’为超高硫家族，Ｃｙｓ的分子数多于３０％；ＫＡＰ６～ＫＡＰ８为嵩苗氨酸藤氨酸角蛋皇的家族，他们至少由２３个头发ＫＡＰ基医编码渊。ＫＡＰ６．１、ＫＡＰ７和ＫＡＰ８已经被定位于绵羊ｌ号染色体；ＫＡＰｌ．１、ＫＡＰｌ．２、ＫＡＰｌ．３ 和ＫＡＰ３．２定位子ｌ ｌ号染色体；ＫＡＰ５．１定位于２ｌ号染色体渊。此外，这两种类型的基因都属于多基因家族，即该基因是由多个基因构成。 富含甘氨酸／酪蛋白的ＨＧＴＫＡＰｓ是羊毛中最小的角蛋白（Ｍｒ＝６０００－－一９０００Ｄ）。 透过对绵羊的研究，把高甘氨酸／酪氨酸ＫＡＰ划分为高甘氨酸／酪氨酸ｌ型蛋白 （ＫＡＰ７、ＫＡＰ８）和ＩＩ型蛋白（ＫＡＰ６）【．Ｉ一。决定角蛋白性质的主要是其氨基酸的成分，ｌ型的溶解性较低，缺少半胱氨酸但是富含苯丙氨酸，僵在ｌｌ型中的情况 与Ｉ型相反。Ｉ型和ＩＩ型没有甲硫氨酸，绵羊的Ｉ型被进一步的分为两个主要的类 型（Ｃ和Ｆ）。他们的氨基酸序列的信息说明ＨＧＴ角蛋白是富含甘氨酸、酪氨酸、 丝氨酸。上述氨基酸在Ｉ型中的含量大约为４８．５５％，ＩＩ型中的含量大约为７４％。此外，通过比较他们的序歹ｆｊ数据揭示Ｉ型的Ｃ２，Ｃ３是一致的，两个ＩＩ型角蛋白ＫＡＰ６．１ 和６。２具有很离随同源性。但是除了他们都具有酪氨酸的Ｃ端末尾外，ｌ型Ｃ和Ｉ 型Ｆ并没有明显的同源性。除了绵羊的ＨＧＴ以外，一个ＩＩ型的ＫＡＰ蛋白的基因在 兔子的基因组中被分离出来，它的氨基酸序列证明与绵羊的ＫＡＰ６。ｌ有很高的同一 性，可以推测这种蛋白在两个物种的进化的过程中具有很高的保守性。在羊毛发育 过程中，等量的酸性（１型）和碱性（Ｉｌ塑）角蛋白配对形成８＂－－１０ｎｍ的细丝填充 在ＫＡＰ的基质之间，丽ＫＡＰ则在其外包裹形成一种基质；前者是羊毛的骨架，含 量和结构较为稳定，而后者在不同品种绵羊中结构和含量变化较大。。对绵羊基因组的Ｓｏｕｔｈｅｒｎａｎｄ ｎｏｒｔｈｅｍｂｌｏｔ分析说骧：ＨＧＴ舞蛋皇基因没有内含予，是以单拷贝形式出现在染色体组中，并转录成６００ｂａｓｅｓ左右大小的ｍＲＮＡ链。ＨＧＴ角蛋白之闻同源性不大，僵在起始密码子部位有１８却的保守区段。所有的ＫＡＰ基因包括一 个Ｍｅｔ的起始密码子和一个开放读码框。在终止密码予后约４００ｂｐ处有多聚腺苷酸的信号（ＡＡＴＡＡＡ）。１．５．５角蛋白及其关联蛋白基因的研究进展 皮肤是一个高度特他的组织，因此基因的拷贝数基本反映了其ｍＲＮＡ的丰度。 而且高拷贝大多数是绒和毛的结构蛋白，这就客观反映了皮肤中毛被的生长需要合 成大量的蛋自震。坯胎期皮肤主要是皮肤和毛囊的发育过程，细胞分佬相关的基因 丰度相对较高。而成年皮肤的结构相对基本稳定，代谢活动主要在乎维持皮肤的正 常功能，另外由于皮肤要合成大量的毛被，从ＥＳＴｓ的重复序列分析，拷贸数超ｌＯ的几乎都是角蛋白，这充分说明皮肤中焦蛋自表达异常活跃。因此，ＩＦ和ＫＡＰ控 制位点的遗传差异在决定不同羊毛质量和生产性能的表型差异方面具有重要作用。内蒙古农业大学农硕士学位论文９近年来，研究阐明共有６种不同的角蛋白中间丝，Ｉ型和ＩＩ角蛋白中间丝是表皮和 它的其它衍生物的主要分化产物。Ｉ型与ＩＩ型角蛋白实际上同源性较低（同型之间 的核苷酸链的园源性约为６０％．９０％），磊同型角蛋自各类型之闻的同源性则较高 （陈丹英，２００２）。Ｉ型和ＩＩ型角蛋白成对表达，对维持上皮细胞的形成和胞问连接起主要作用，现已证明多种皮肤瘸（包括皮肤癌）源自角蛋白基因的点突变。 焦蛋白广泛地存在于自然界，细胞核和细胞质中都能发现角蛋白的存在，被视 为毛发、羊毛、羊绒和皮肤的主要结构蛋白。由于从试样中提取角蛋白较困难，序 列的同源性和大量的翻译后修饰，所以角蛋自的研究比其它蛋白质家族的研究要 少。目前先进的蛋白质组学技术可以有效地用于这个被忽视的家族的研究。在Ｗｎｔ 信号途径作用过程中，毛发危蛋盘基因是人们最早研究的调节基因。Ａｄｅｌｓｏｎ等（２００４）研究了美利奴绵羊皮肤和羊毛中表达的基因，发现了许多参与毛囊发育及 周期性生长的角蛋白基因洲。Ｒｏｇｅｒｓ等（２０００）将Ｉ型毛角蛋白定位在人类染色体 １７ｑ２１．２，１１型染色体的６个成员定位在１２ｑ１３．３渊。Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ等绘制了ｈＫＡＰ４的 物理图谱，ＫＡＰ４家族有１１个成员，定位在人类的１７号染色体¨研。Ｍｉｃｈａｅｌ Ａ等将 高硫ＫＡＰ基因定位在人类２ｌ号染色体洲。１．５。６角蛋白及其角蛋白关联蛋白功能的研究进展 皮肤中毛被的生长是主要的代谢活动，皮肤绒、毛生长季节需要合成大量的蛋 自质。山羊皮肤结构相对稳定，表皮的角质化层大部分是死细胞，只有真皮层的组 织细胞相对活跃。在真皮组织中如果毛囊处于兴盛期，皮肤要合成角蛋白，毛囊无疑是最活跃的器官。羊毛和绒纤维主要由角蛋白组成，它的的形成过程包括角蛋白组装成微原纤维基质复合体，细胞粘合和纤维硬化过程。毛发角蛋自对羊毛的形态结构有重要的影响，基因图谱显示经鉴定的一些染色体区域和羊毛的质量和产量有 重要的关系“７１。一些纤维品质差异较明显的羊毛，如林肯羊毛和澳洲美利奴羊毛之 间，细度不同的羊毛之闯，其角蛋白组成变化更大。最近经过ＰＣＲ－ＳＳＣＰ的分析，证明羊毛纤维组成基因Ｆｖａ．Ｐ１．１和ＫＡＰｌ３的部分序列和ＫＡＰ６．１基因的外显子序 列，已经间接成力精细羊绒性状的候选基因。昌前的研究结果已发现ｌＯ余种遗传 性皮肤病与角蛋白基因突变有关，主要有：单纯性大疱性表皮松解症，主要是由常染 色体显性遗传变异引起的，Ｋ５和Ｋ１４与这种疾病的连锁有关嗍。表皮松解性掌跖 角皮症是常染色体显性遗传的皮肤病症，Ｋ９的变异可导致表皮松解性掌跖角皮症 ㈨，先天性大疱性鱼鳞病样红皮病，Ｓｉｅｍｅｎｓ鱼鳞病，ｈＨｖｂ ｌ和ｈＨｂ６的变异能弓ｌ起念 珠状发蚓，先天性厚甲症，白色海绵状痣等。表皮松解性角化过度症与异常的供体角 蛋白剪切位点突变有关，人表皮松解性角化过度症是由上表皮的Ｋｌ和Ｋ１０的显性失活突变孳ｌ起的嘲１。剃毛可显著提高ＩＧＦ?ｌ的表达量，但对ＧＨＲ、ＩＧＦ－１Ｒ、ＫＡＰ３．２ 和ＫＡＰ６．１的表达量均无明显的影响：而拔毛对皮肤中ＧＨＲＩ、ＧＦ―ｌＩ、ＧＦ―ＩＲ、ＫＡＰ３．２１０，内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ．ＳＳＣＰ检测和ＫＡＰ６－＇Ｉ基因表达均无明显影响。目前，有关人、狒狒和猩猩的基因图谱及核苷 酸的变异已经有报道嗽１。角蛋白维持毛囊结构并包含了能在毛囊中表达的最丰富的 蛋白质。成年绒山羊绒毛生长的特征除了与毛囊的毛乳头直接相关外，与角蛋白基 因的表达及细胞的角质化也有十分密切的关系。在体外，毛囊的生长伴随着毛干角 质化的过程，其分子组成结构和生物形态学的改变都伴随着毛角蛋白的表达∞１。编 码角蛋白的５０到１００个基因需要在一个共同协调的模式下运作以生产成熟的羊毛 纤维，其具体的调节机制有待于进一步的研究。１．６研究的目的和意义不同动物被毛类型ＫＡＰｓ所占的比例不同。许多研究表明，富含高甘氨酸／酪氨酸的ＫＡＰ在不同毛发中所占比例不同，也许是造成毛发性质不同的一个重要原因。 各种动物的ＫＡＰ基因的表达模式是相似的，但表达程度却变化极大。如ＨＴＧＫＡＰ在人发上表达很弱，但在羊毛和鼠毛上却很强嘲１。内蒙古农业大学尹俊教授对内蒙 古绒山羊毛囊发育、生长周期及相关基因进行了深入的研究，构建了胚胎和成年绒 山羊次级毛囊兴盛期皮肤组织ｅＤＮＡ文库，发现了大量的角蛋白基因，研究了２６ 个毛角蛋白及角蛋白关联蛋白全长ｅＤＮＡ序列的特征。对成年山羊和胚胎皮肤进行了比较，发现一些共有的基因，其中包括与毛囊有关的很多基因，例如毛发酸性角蛋白，羊毛透明蛋白、ＦＫ５０６ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｌＡ，ＣｙｓｔａｔｉｎＥ／Ｍ等璐舶。而且，即使成年 山羊和胚胎皮肤同时出现的基因，在两种皮肤中的拷贝数也有差异，有的甚至很大。李长青对毛囊的周期性变化与兴盛期毛囊ＫＡＰｌ３．１基因的表达进行了研究眵町。赵冰 对内蒙古绒山羊ＨＧＴ序列及结构的特征进行了分析删。尹俊等克隆并分析了山羊 ＨＧＴＫＡＰｓ序列及结构特性帆‰删，一个山羊Ｉ型毛角蛋白基因的序列及其在皮肤 中的表达已进行了研究№¨，对成年和胚胎期羊基因表达进行了比较分析陋?嘲，人的ＫＡＰ６也有研究泓１。毛发上的这些差异是由毛囊角蛋白及其关联蛋白的基因或蛋白 序列的差异造成，还是有其他因素，其具体机制尚不清楚。最近在绵羊上经过 ＰＣＲ．ＳＳＣＰ的分析，证明羊毛纤维组成基因ＫＡＰｌ．３的的外显子序列和ＫＡＰ６．１基因 部分序列，已经间接成为精细羊绒性状的候选基因。生物多样性是人类社会生存和发展的基础，满足人类社会持续发展的生物多样 性保护已受到国际社会的强烈关注。畜禽遗传资源多样性是生物多样性的重要组成 部分，是人类社会赖以生存和发展的基础，遗传多样性的丧失必将限制未来不可预 见的优良特性的选择机会，造成无法挽回的损失。在当前这种一味追求经济效益， 盲目进行杂交改良，导致畜禽遗传多样性下降、遗传基因单一化的形势下，进行畜 禽遗传多样性的研究就显得尤为重要。本文通过对我国的内蒙古白绒山羊，研究其 遗传多样性，揭示品种内的近交、杂交程度以及多态信息含量，以期为绒山羊遗传资源保护和开发利用提供相关理论基础。内蒙古农业大学农硕士学位论文１１虽然我国山羊绒年产量已达１万吨左右，贸易量占全球的５０％，但个体的生产 水平较低，并且在传统的选择模式下，绒山羊经济性状的选择进展很慢，因而寻找新的选择方法提高绒山羊的经济性状水平成为近２０年来绒山羊选育研究的焦点。有研究证明角蛋白辅助蛋白（ＫＡＰ）与数量性状位点ＱＴＬＳ有一定的相关性‘一’，利用有效相关的标记进行群体内个体的选择，可提高家畜的生产水平‘一１，加快育种进展ｎ圳。本研究旨在通过对内蒙古白绒山羊经济性状标记的遗传学分析，寻求与经济性 能相关的标记位点，以进一步提高绒山羊的生产性能，改善羊绒品质，以适应市场 经济对羊绒产品的需求。，１２７内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测２实验材料试剂及用品 ２．１实验材料应用随机抽样法在内蒙古自治区鄂托克旗内蒙古白绒山羊种羊场抽取１２０只羊的血样，加有抗凝剂的血样冷冻保存在．２０‘Ｃ冰箱中备用。采取的血样同时记录相 应个体的产绒量、体重并抓取绒样。２．２引物设计 根据ＧｅｎｅＢａｎｋ中报道的绵羊的ＫＡＰＩ．３（ＡＹ８３５５８９）与山羊ＫＡＰ６．１（ＡＹ３１０７５３）１基因序列，利用ＤＮＡＳｔａｒ５．０１软件设计引物，即Ｐ１和Ｐ２、Ｐ３和Ｐ４等两对引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列及其扩增基因、ＰＣＲ产物大小如下（见表１）：表ＩＴａｂｌｅ １ＳＳＣＰ引物序列ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆＰｒｉｍｅｒＳＳＣＰＦ－ＧＴＧＡＧＡＣＣＧＧＣＴＧＴＧＧＣＡＴＴＧＣ Ｓｌ Ｒ－ＧＧＧＴＧＧＡＣＧＡＧＧＧＴＴＧＧｏＴＡ Ｆ：ＴＣＴＡＣＣＣＧＡＧＡＡＣＩ’ＡＣＣＴ Ｓ２ ５９ ３０４ ６６．５ ２８９Ｒ：ＣＴＡＣＧＧＴＧＣＴＴＴＣＴＧＡＧＡ２．３实验仪器和试剂 ２．３．１主要仪器设备ＰＣＲ仪、电泳仪、冷冻离心机、超净工作台、高速离心机、数码凝胶图像分析系统、超低温冷冻冰箱、超纯水器、ＨｙＧ．Ａ型回转恒温调速摇床柜、ＤＹＹ－Ｈ［型稳压稳流电泳仪、ＤＦ２０５电热鼓风干燥箱、ＸＷ－８０Ａ漩涡混合器、电冰箱、超低温冰箱、移液器、离心管、研钵等。２．３．２药品与酶基因组ＤＮＡ提取试剂盒、质粒提取试剂盒、ＤＮＡ胶回收试剂盒购自天根公司，ＴａｑＤＮＡ聚合酶（Ｔａｋａｒａ）、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ Ｉ（上海生工）、ＷｉｄｅＲａｎｇｅ ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（１００．６０００），ｄＮＴＰ（脱氧核苷三磷酸）、蛋白酶Ｋ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ），５一溴－４－氯－３．．吲哚．Ｂ．Ｄ．半乳糖苷（Ｘ－－ｇａｌ），异丙基．ｐ．Ｄ．硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）、氨苄青霉素 （Ａｍｐ）、大肠杆菌ＴＯＰＩＯ菌株购自索莱宝科技有限公司、三羟甲基氨基甲烷（强ｓ）；；甲叉双丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ一四甲基乙二胺；琼脂糖（Ａｇａｒｏｓｅ）、丙内蒙古农业大学农硕士学位论文１３烯酰胺等均为国产分析纯，其它常规试剂由内蒙古农科院生物技术中心实验室提供。３实验方》３ｊ１绒羊基因组ＤＮＡ的提取?（１）在５００≯１血液中加入８００咎１的ＴＢＰ Ｂｕｆｆｅｒ用Ｉｍｌ的Ｔｉｐ头轻轻吹打使其彻 底均匀，然后４０００ｆ／ｒａｉｎ分离３分钟，弃去上清液。（２）重复上述步骤一次，若血样任显红色则需再次重复上述步骤，当沉淀为无色或淡红色后用２００壮ｌ ＴＥ悬浮即可。 （３）在准备好的２００咎ｌ样品中加入５００｜Ｉ ＩＴＢＭ Ｂｕｆｆｅｒ，混匀：再加入４瑟ｌＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ，混匀，５５℃保温ｌＯ．２０分钟。（４）加入２６０耻ｌ无水乙醇，混匀，然屡用ｌｍｌ Ｔｉｐ头浆样品全部转移到套放 与２ｍｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ的ｔｍｉＱ．１０柱中。（５）台式离心机，８０００ ｒ／ｍｉｎ，室湿离心１分钟。 （６）取下ＵＮＩＱ．１０柱，弃去Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ中的全部废液，将柱子放圆同一根Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔ曲ｅ中，１００００ｒ／ｍｉｎ，室温离心１５秒。．（７）重复步骤６一次。 （８）取下ＵＮＩＱ．１０柱，弃去Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ中的全部废液。将柱子放回同一 根Ｃｏｌｉｃｃｔｉｏｎ Ｔｕｂｅ中，１００００ｒ／ｒａｉｎ，室湿离心１５秒，以除去残留的ＷａｓｈＳｏｌｕｔｉｏｎ。 ｌ Ｅｌｕｔｉｏｎ‘（９）将ＵＮＩＱ．１０柱子放入新的ｌ。５ ｍｌ离心管中，在柱膜中央加入４０ ｌｌ Ｂｕｆｆｅｒ，室温放置２分钟。（１０）１００００ ｒ／ｍｉｎ，室温１分钟。离心管中的液体即为基因组ＤＮＡ。放入．８０℃超低温冰箱冷藏备用。３。２ＰＣＲ扩增反应３．２。１号ｌ物处理．?本实验所用的两对弓ｌ物Ｐｌ、Ｐ２和Ｐ３、Ｐ４由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。新合成的引物为固体粉末状，在溶解翦先离心１０ｓｅｅ使其集中在试管管底，。然后用重蒸灭菌水稀释到２５ｐｍｏｌ／Ｌ，室温溶解３ｈ以上。３．２。２最佳ＰＣＲ反应条件的建立 对ＰＣＲ影响较大的因素有：退火湿度，ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ中的镁离子浓度和模板ＤＮＡ 的质量等。优化ＰＣＲ反应的目的在于找到可使扩增效率最高的退火温度、镁离子 浓度和模板量，并在保证扩增效率的前提下尽量降低ＰＣＲ反应体系中其它成分的 用量。在确定具体的退火温度时，可设定一系列梯度，然后作不同退火温度和镁离１４。内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测子浓度、模板量的正交组合，以确定最优化的组合。经过多轮梯度ＰＣＲ筛选，最后确定的最佳ＰＣＲ反应条件为：?豇心１．３基因片段扩增条件：３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。‘９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓｅｅ，６６．５＂Ｃ退火４０ｓｅｅ，７２℃延伸ｌｍｉｎ，设计 ．’＆心６．１基因片段扩增条件：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４＂Ｃ变性３０ｓｅｅ，５９℃退火４０ｓｅｅ，７２℃延伸１ｍｉｎ，设计３５ 个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。３．２．３ＰＣＲ反应体系按照以下反应组份建立ＰＣＲ反应体系：ｄｄ Ｗａｔｅｒ８．５山１２．５ Ｉｌｌ２ Ｘ Ｍｉｘ Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ１或３ ２或４１．０“ｌ１．０“ｌ ２．０ ＵｌＴｅｍｐｌａｔｅ反应总体积２５．０ｍ３．２．４琼脂糖凝胶电泳检测ＰＣＲ反应产物 取５ｍ ＰＣＲ产物与ｌｉｄ加样缓冲液混匀后，２．５％琼脂糖凝胶电泳检测。电压 １２０Ｖ，电泳时间约为１ｈ。３．３ＰＣＲ产物的克隆 ＤＮＡ片段回收３．３．１目的片段的回收采用回收试剂盒进行，步骤如下： （１）扩增出ＰＣＲ产物约１００ｔｔｌ，全部上样用于琼脂糖凝胶电泳，低压电泳约１ｈ左右后将含目的片段条带的琼脂糖块割下，放入１．５ｍｌ的离心管中： （２）秤量凝胶重量，换算出体积后按比例加入溶胶液ＰＮ，置５０＂Ｃ水浴１０ｍｉｎ， 使琼脂糖块完全溶化，期间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如 未有溶解的，补加溶胶液或待的时间长些直至全溶（胶块体积过大，可事先将胶块 切成碎块）；（３）将上一步所得的溶液加入一个吸附柱ＣＡ２中（吸附柱放入收集管中），。 室温放置２ｍｉｎ，１３０００ｒｐｍ，３０ｓ，倒掉废液，将吸附柱ＣＡ２放入收集管中；内蒙古农业大学农硕士学位论文１５（５）在吸附柱ＣＡ２中加入７００ｔｄ漂洗液ＰＷ，１３０００ｒｐｎｌ＇离心３０ｓ。倒掉收集 管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中； （６）在吸附柱中加入５００ｍ ＰＷ液，离心３０ｓ，倒掉废液； Ｃ７）将吸附柱放回收集管中，１２０００ｒｐｍ离心２ｍｈｔ，将吸附柱置于室温放置数 分钟，彻底晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验：．（８）在吸附柱放到一个干净韵离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加柏ｍ洗脱缓冲也ＥＢ，室温放置２ｍｉｎ，１２０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，然后将离心管中的ＤＮＡ贮存于．２０℃?３．３．２克隆载体的构建 用于克隆绒山羊ＫＡＰ基因的质粒载体ｐＧＭ－Ｔ是按照天根公司的载体进行构建 的，在质粒载体上有多个克隆位点。Ｔ７Ｊ捌，ｌ群。 醐螯ｌ知桶器旨 Ｎｅｆｆ勘啦Ｐｓｌｌ Ｓ引｜｜甓ｆ 融ｘｌｌ辩兰蓦。ｚ≥¨＿＿＿高≤∥。≯．＿＝｛＝＿《。．≮一ｉ●， ，躐¨加翁钌格勰秘酗阳”铭∞器并钔爱：＝＝＝一：点羔。釜…。，。圈１呻ｌｔ－Ｔ藏体Ｆｉｇ １ｐａｔ－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ３．３．３Ｐ像产物与Ｔ载体连接（ｐＧＭ－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１）在ＰＣＲ管中配置如下连接体系：Ｔ４眦ＬｉｇａｓｅＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｐＧＭ－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ ｄｄ１．Ｏ ５．０ ０．５ ３．５Ｉｌｌ Ｉｌｌ ｍ ｍ ｍＷａｔｅｒ反应总体积１０．０（２）将以上连接液混匀并使其集中于管底，置于１６℃水浴过夜连接（１０～１２ｈ）。１６７内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测３．３．４转化过程将连接产物转化于大肠杆菌ＴＯＰｌ０感受态细胞，具体步骤为：（１）分别取连接产物１０“ｌ，’加入到两管２００ｕｌ ＴＯＰｌ０感受态细胞中，充分混匀后， 冰浴３０ｍｉｍ （２）将装有混合物的Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管，４２℃水浴热激９０ｓｅｃ： （３）将Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管立即转移到冰上冷却２ｍｉｎ；．（４）每管各加入３００ｐＩ ＬＢ液体培养基，置３７＂Ｃ １５０ｒｐｍ恒温摇床培养４５ｍｉｎ。目的是使质粒上相关抗性基因表达，使菌体复苏。 （５）将２００｝Ｂ培养物涂布于含有ｘ－ｇａｌ（１５一溴一４氯一３吲哚一Ｂ一半乳糖苷）和ＩＰＴＧ （异丙基一８－Ｄ－硫代半乳糖苷）的Ａｍｐ平板上；配方：在６０ｍｌ的ＬＢ琼脂培养基中加入６０“ｌ的Ａｍｐ（１００ｍｇ／ｍ１）、９６ｕｉ的ｘ―ｇａｌ（２０ｍｇ／ｍ１）和９．６ｐｌ的ＩＰＴＧ（２００ｍｇ／ｍ１） （６）３７℃正置培养１ ｈ后，再倒置培养１２～１６ ｈ后观察菌落。３．３．５重组质粒的筛选与鉴定 ３．３．５．１蓝白斑筛选 （１）转化菌培养１６ ｈ后，从温箱中取出平皿，将平皿放入冰箱中数小时显色；（２）取出平皿，观察白色、蓝色茵落；’（３）用灭菌牙签从培养基上挑取白菌落的ｉ／２，接种于含Ａｍｐ、ｘ―ｇａｌ和ＩＰＴＧ的 固体培养基上，并作好标记；（４）将同一根牙签投入装有５ｍｌ的含有Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基的三角瓶中，并在瓶上作相应标记，３７℃，摇床培养过夜。３．３．５．２菌落ＰＯＲ鉴定 ＰＣＲ反应体系如下：ｄｄ Ｗａｔｅｒ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ １８．０ ２．５ ｐｌ ｐｌｄＮＴＰｐｒｉｍｅｒ ｐｒｉｍｅｒ２．０肛ｌ１或３ ２或４１．０“ｌ１．０ ０．５ ｐｌ ｐｌＴａｑ酶 菌落ＤＮＡ适量反应总体积２５．０ｍ（注：为了减少污染和假阳性结果的产生，在挑取菌落时必须在超净工作台上进行）内蒙吉农业大学农硕士掌位论文ｌ７分别以Ｐｌ、Ｐ２和如、乳为引物，从各自培养的坞平板上随机挑取单克隆菌落， 作为模板ＤＮＡ进行菌落ＰＣＲ阳性克隆的鉴定，ＰＣＲ反应条件与２．２。３．３提供的完全 一致，反应结束后，挑取扩增出阳性产物的单菌落进行摇菌操作，培养８－－一１０ｈ屠 提取质粒进行酶切鉴定。３。３．６双酶切鉴定 ３。３。６。ｌ质粒的提取（１）接种单菌落于５ｍｌ含２％Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基中，在３７＂Ｃ摇床振荡培 养过夜（约８＂－－１０ｈ）： （２）培养至菌液浑浊后，于１．５ｍｌ离心管中分两次收集３ｍｌ菌液，１２０００ｒｐｍ 离心ｌｍｉｎ收集沉淀，彻底除去上清；（３）加入２５０１ｘｌ溶液ＰＩ（溶解缓冲液），用枪头将沉淀彻底捣碎，使细菌充分悬 浮；，（４）加入２５０９ｌＰ２（细胞裂解液），立即轻柔颠倒离心管数次，使细菌裂解， 室温放置ｌｍｉｎ，至溶液变澄清； （５）加入３５０９ｌＰ３（中和溶液），立即轻柔颠倒离心管数次，室温放置５ｒａｉｎ以 上，此时将出现白色絮状沉淀。１２０００ｒｐｍ离心１０ｍｉｎ，此时在离心管底部形成沉淀； （６）再将步骤（５）的上清加入吸附柱中，注意不要吸出沉淀。１２０００ｒｐｍ离心 ３０ｓｅｅ，倒掉收集管中的废液：。（７）加入７００１上１漂洗缓ＰＷ冲液子吸附柱中，１２０００ｒｐｍ离心ｌｍｉｎ，倒掉收集 （８）取出吸附柱，将其放入一个干净的离心管中，加入５０～１００９ｒａｂ洗脱缓管中的废液，重复操作～次，１２０００ｒｐｍ离心２ｒａｉｎ：冲液于吸附柱中，室温放置２ｍｉｎ后，１２０００ｒｐｍ离心２ｍｉｎ，将离心管．２０℃保存备 用； （９）ｌ。５％琼脂糖电泳检测提取结果及纯度。 ３。３．６。２限制性内切酶消化 （１）酶切反应体系组成 重组质粒ｌＯ×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ４．０ｔｔｌ １。０ｔｄＳａｃｌＩ内切酶Ｎｏｔ０。３心０．３出 ４。４ｍＩ内切酶ｄｄ Ｗａｔｅｒ反应总体积１０．Ｏｇｌ１８７内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测（２）将以上组分于ＰＣＲ管中混合均匀，３７＂Ｃ温浴２ｈ，３．５％琼脂糖凝胶在１００Ｖ电压 下电泳０．５ｈ后检测酶切结果。３．４ＤＮＡ测序分析ＤＮＡ序列由上海生工生物工程技术服务有限公司测定完成。为保证星的基因序 列测定结果的准确性，排除测序过程的系统误差，重组质粒经阳性克隆鉴定盾，每 个样品可平行测定３份重组质粒，如果３次测序结果完全一致，就可确认目的基因 的测序结果。最后将测序结采用ＤＮＡＳＴＡＲ和ＢｉｏＥｄｉｔ软件进行基因序列分析及同源性比对。３．５绒山羊ＫＡＰ基因ＰＣＲ产物多态性检测 ３。５．｛８篙蔓≥变性聚蓠烯酰胺凝胶制作及电泳 聚丙烯酰胺凝胶制作及电泳（体积２７ｍｉ，０．１ｍｍ胶条）清洗制胶用的玻璃板，烘干后用Ｏ．８％琼脂糖封闭玻璃板和胶条闽的缝隙ｌ配制３０ｍｌ ８％的丙稀酰胺胶溶液：３０％丙烯酰胺８ｍｌ，５ＸＴＢＥ ６ｍｌ，１０％过硫酸铵２４０幽ＴＥＭＥＤ ２０瓣，加入纯水１６ｍｌ混合焉迅速灌胶ｌ当浇灌至离玻璃板上沿Ｏ．１ｃｍ时停止灌胶插入梳予室温聚合Ｏ．５ｈ，多余的丙烯酰 ４１２保存，随时观察凝胶聚合情况并补加丙烯酰胺ｌ凝胶聚合好后向电泳糟加入ｌｌｘＴＢＥ用注射器冲洗加样孔预电泳１０ ｍｉｎ同时准备点样取２ ｌｄＰＣＲ产物置于ＰＣＲ管中，加７ ｐｌ变性Ｂｕｆｆｅｒ，９８＂Ｃ变性１０ｍｉｎｌ迅速冰浴１０ｍｉｎ，用微量注射器点样１打开电源１５０Ｖ，电泳１４．１６ｈ ３．５，２硝酸银染色?电泳结束后关上电泳仪，放出电泳液，小心取下凝胶置于１０％冰乙酸中霹定２０ｍｉｎｌ去离子水洗胶２遍，每次２ｍｉｎ，洗去乙醇内蒙古农驶大攀农硕士学位论文用染色液（２００ｍｌ ０．１％的硝酸银，３００衅３７％的甲醛） 染色３０ｌｍｉｎ去离子水快速洗胶，洗去多余的染色液ｌ立刻置于显色液（３００ ｍｌ ３％的碳酸钠，４５０ｌｇ．１３７％的甲醛）显色，当ＤＮＡ带的强度合适时倒掉显色液 立刻转入霾定液中停止显色ｌ倒撺固定液，去离子承洗搏多余的固定液ｌ＋观察并记录结果，照相或保存３。巷统计方法 本试验数据的统计分析均采用ＳＰＳＳｌｌ．０软件宪成。 ３。６．１基因频率和基因型频率的计算 （１）等位基霞频率是指一个群体中某一基因对其等位基因的相对比率 Ｐｉ＝【２（ｉｉ）＋（ｉ３ ０＋（ｉｊ２）＋……＋（ｉｊｎ）］／２Ｎ、Ｐｉ：第ｉ个等位基因的频率 ｉ：纯合复等位基因 ｊ１、．ｉ２、……ｊｎ：与ｉ共有的第ｌ到第ｎ个等位基因（２）基因型频率指一个群体中某一性状的冬种基因型之阍的相对比率。融乎本研 究中的检测结果为共显性等位基因，因此表型频率即为基因型频率。 基因型频率＝基因型个体数／测定群体总数 ３．６，２遗传多态性分析 （１）遗传缝合度（Ｈｏｍｏｚｙｇｏｓｉｔｙ）：某一群体中一特定基因位点上等位基因纯台的程 度。Ｈｏ－＇－∑＜薅）２《２）杂笞发（Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓ时）：与纯合度相对。。／＇／口＝ｌ－－∑（鼽）２２０７内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ―ＳＳＣＰ检测ｎｕｍｂｅｒ（３）有效等位基因数（Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｏｆａｌｌｅｌｅｓ）纯合度的倒数，反映等位基因间的相互影响，是衡量基因纯合率的另一指标。Ｎｅ＝ｌ／∑（ｐ，）２（４）多态信息含量（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔ，ＰＩＣ）－用于对标记基因多态性的估计。ＰＩＣ＞０．５为高度多态，０．５＞ＰＩＣ＞Ｏ．２５为中度多态，ＰＩＣ＜０．２５为低度多态。眦＝ｌ－∑（ｐ，）２一∑∑２ｐ；ｐ；Ｐｉ和Ｐｊ夯锄为第ｉｊ个鐾囟和第ｊ个等位基因在群体中的频率，ｎ为等位基因数。内蒙古农业大学农硕士学位论文４实验结果与分析 ４．１绒山羊基因组ＤＮＡ的提取圈２绒山羊基因组ＤＮＡＦｊｇ ２ Ｇｅｎｏａｅ ＤＮＡ ｏｆｏａｓｉｍｅｒｅ ｇｏａｔ从图２可以看出，提取的绒山羊基因组ＤＮ＾条带整齐，大小均匀一致，表明提取 的ＤＮＡ片段分子量在样品间差异很小。另外ＤＮＡ无降解，蛋白质污染很少，可以满足 下一步工作的需要。４．２ＰＣＲ扩增结果圈３Ｆｉｇ ３Ｓ１位点扩增产物（约２８９ｂｐ）ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｆｏｒ图４Ｓ２位点扩增产物（约３０４ｂｐ）ＰＣＲＳ＇（２８ｆｏｐ）Ｆｉｇ ４ｐｒｏｄｕｏｔｆｏｒＳ２（３０４ｂｐ）选取绵羊在ＫＡＰｌ．３和山羊ＫＡＰ６．１部分序列分别设计引物，经ＰＣＲ扩增后所得 条带大小与预期目的片段大小基本一致（图３和图４），经估测二个片段大小分别为 ２８９ｂｐ和３０４ｂｐ，所以可初步判定该ＰｅＲ片段可能是绒山羊的ＫＡＰｌ．３和ＫＡＰ６．１基 因的部分片段，为了验证结果的可靠性，必须通过以下构建克隆载体和测序步骤才２２内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测能加以确认。４．３ＰＣＲ产物的克隆将目的片段回收，并与ｐＧＭ－Ｔ载体进行体外连接后，转化到ＴＯＰｌ０感受态细胞中，经涂板、挑取单菌落、培养单克隆和阳性质粒筛选、酶切鉴定等分子克隆操作，初步确定为阳性克隆．４．３．１阳性克隆菌落的ＰＣＲ鉴定ｌ２３４ｎＩ１２３４５Ａ，ＩＯＯ００ ００００圈５ ＫＡＰｌ．３基因片段菌落ＰＣＲ鉴定Ｆｉｇ ５ ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＫＡＰｌ．３图６ ＫＡＰ６．１基因片段菌落ＰＣＲ鉴定Ｆｉｇ ６ ＰＣＲ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＫＡＰ６．１图５其中１、２、３号菌落阳性重组质粒，经过接种摇菌培养，可用于下一步的 质粒进行酶切鉴定和测序。 由图６可以看出，在挑取的５个单菌落中，只有ｌ号和４号检测到阳性结果， 说明１号和４号菌落为阳性重组质粒，可挑选其中之一单独接种摇菌培养，通过提 取质粒进行酶切鉴定和测序。４．３．２质粒的提取 用小量快速试剂盒方法提取的质粒见图３．７。内蒙古农业大学农硕士学位论文圈７质粒提取结果Ｆｉｇ ７ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｐｌａｍｉｄｓ注：１、２为ＫＡＰｌ．３质粒提取结果：３、４为ＫＪＩＰｌ．６质粒提取结粟４．３．３阳性克艟的双酶切鉴定‘粮据所提取的质粒ＤＮＡ的蔽度，确定其加入量，与酶切体系混鲁，经酶切后使其线性化，结果经电泳检测如图３．８。第一、二泳道为酶切后的质粒ＤＮＡ和ＫＡＰＩ．３基因片段，第三、四泳道为酶切后的质粒ＤＮＡ和ＫＡＰＩ．６基因片段。１ ２ ３ ４ Ｍ圈８阳性克隆的双酶切鉴定．Ｉ、２、３、４．ＳａｃⅡ和Ｎｏｔ Ｉ双一切产物Ｆｉｇ ８ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃＩｏｎｉｎｇ电泳结果显示，重组质粒经双酶切后，目的片段被完整切下来，表明在ｐＧＭ－Ｔ 载体中插入了与目的ＤＮＡ近似大小的片段（图８），图中小片段长度与目的片段长度相近（含有Ｔ载体克隆位点序列），可分别将该质粒进行测序。４．３．４ＤＮＡ测序结果仅对从基因型的阳性重组克隆子经菌落ＰＣＲ和双酶切鉴定后，提取含有目的 基因片段的阳性重组质粒，并进行纯化后送测序公司测序。测序结果表明，每个基 因片段的３份质粒样品的测序结果均完全一致，以下是测序结果：ＫＡＰｌ．３－ １ ５ｌ ２８９ｂｐ ＧＴＧＡＧＡｃＣＧＧ ｃＴＧＴＧＧＣＡＴＴ ＧＧＴＧＧＣＡＧｃＡ ＴＴＧＧｃＴＡＴＧＧ ＣｃＡＧＧＴＧＧＧＴ ＡＧｃＡＧＣＧＧＡＧ ｃＴＧＴＧＡＧｃＡＧ ｃｃＧＣＡＣｃＡＧＧ ＴＧＧＴＧｃｃＧｃｃ ｃＴＧＡｃＴＧｃｃＧ ＴＧＴＧＧＴＧＡＧｃ ＴＧｃＡＣＡＣＣＣｃ１０１ ＣＧＴＧＧＡＧＧＧｃ ＡＣｃＡＧＣｃＴＧｃｃＴＣ咖Ｇ１５１ ＣＧＴＣｃＴＧｃＴＧ ＣｃＡＧｃＴＧＴＡＣ ＴＡＴＧＣｃｃＡＧＧ ＣｃＴＣｃＴＧｃＴＧ ＣＣＧｃＣＣＡＴＣＣ ２０ １ ＴＡＣＴＧＴＧＧＡＣ Ａ６ＴＣＣＴＧｃｌ．Ｇ ＣＣＧｃＣＣＡＧｃＣ ＴＧＣＴＧｃＴＧｃＣ ＡＧｃＣｃＡＣｃＴＧ ２５ １ ＣＡＣＴＧＡＧＣｃｃ ＧＴｃ．ｒＧＴＧＡＧｃ ＣＣＡＣｃＴＧｃＴＣ ＣＣＡＡＣＣＣＡＴｌ【ＡＰ６．１３０４ｂｐ２４内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测１ ５１’ＴＣＴＡＣＣＣＧＡＧ从Ｃ从ＣＣＴＣＡ ＡＣＡＡＣＣ从ＣＡ 从ＣＴＡＣＴＡＴＧＣＣＡＴＧＴＧＴＧＧ ＣＴＡＣＴＡＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＴＴＧＧ ＣＴＧＴＧＧＡＡＧＣ ＴＡＣＧＧＣＴＡＴＧ ＧＡＧＧＣＣＴＧＧＧ１ Ｏ １ ＣＴＧＴＧＧＣＴＡＴ ＧＧＣＴＣＣＴＧＣＴ ＡＣＧＧＣＴＣＴＧＧ ＣＴＴＣＣＧＣＡＧＧ ＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧ １５ ｌ ２０ １ ２５ １ ３０１ＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧ ＴＧＧＣＴＡＣＧＧＣ ＴＡＴＧＧＣＴＣＣＣ ＧＣＴＣＴＣＴＣＴＧ ＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣ ＴＡＴＧＧＣＴＡＴＧ ＧＣＴＣＣＣＧＣＴＣ ＴＣＴＣＴＧＴＧＧＡ ＡＧＴＧＧＣＴＡＴＧ ＧＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＧＣ ＴＣＴＧＧＣＴＴＴＧ ＧＣＴＡＣＴＡＣＴＡ ＴＴＧＡＧＧＡＴＧＣ ＣＡＣＧＧＡＡＧＡＣ ＴＣＴＡ４．４绒山羊ＫＡＰ基因序列碱基分布和限制性酶切分析 将测序结果在Ｇｅｎｂａｎｋ中进行ｂｌａｓｔ，发现本研究克隆得到的两个序列分别与绵羊ＫＡＰｌ．３和ｋａｐ６．１的部分序列同源性为９９．７％和９７．４％，所以可以初步判断该 序列是绒山羊ＫＡＰｌ．３和ＫＡＰ６．１基因片段。通过生物软件ＢｉｏＥｄｉｔ分析，可以得到 该基因片段的分子质量、碱基组成、碱基分布等（表２、图９、图１０）。表２绒山羊ＫＡＰ基因编码序列的分子质量、碱基组成ＴａｂＩｅ ２ ＭｏＩｅＣＵＩａｒ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ＲＵＧＩｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉ０１＂１１Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＷｅｉｇｈｔＮｕｃｌｃｏｔｉｄｃ。ＫＡＰＩ．３（２８９ｂｐ）ＫＡＰ６．１（３０４ｂｐ）（ＭｏＩ％）Ａ ｃ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｇ Ｔｎ郴∞ 萼｝邮聊鼬ｍ懈 姚．。：坻７８” ＂铫即弧拽６ ３施９７ 弧５ ９狐ｔｂ６（Ｍ０１％）ｐ＠似盯”∞耵 躬呲 卅№ｄｅ恤瞳ｃａ咖０ｓ嘶８３５７ ４２．．＾￡Ｃ‘Ｈ￡Ｅ慷图９Ｆｉｇｓ１位点碱基分布Ｆｉｇ １０图１０Ｓ２碱基分布Ｓ２９ ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓ１ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ内蒙古农业大学农硕士学位论文２５限制性内切酶（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）指的是在一段具有功能的基因ＤＮＡ序列上，能按照特定的识别位点进行切割的一种基因工程工具酶。限制性酶切图谱就是ＤＮＡ分子中各种限制性内切酶的酶切位点，如果某基因片段的碱基序列已知，就可以借助生物软件对ＤＮＡ分子进行序列分析，对照各种酶的识别顺序一一确定相 应的酶切位点，绘制出图谱。该实验所得碱基序列通过生物软件ＢｉｏＥｄｉ进行分析， 可得出整个碱基序列上所有的限制性内切酶位点（图ｌｌ、图１２）雌ｃｔ；Ｃ‘ｚ＾《Ｃ’ｚｃｃＣｃ乍Ｅ蝌，，ｒｃ瞄瞄牲ｏｏ埔嵋田；●矗＾，‘－?ｚ■■－＾ｚｌ’１Ｉｌｖ ，ｈ■，?●ｒｔｏＶｌ，■－?ｉ ■■ＬＩｌ，ｂ－，咿ｌｏｖｔ《?－?●ｌＩ■一Ｘ 箱ｈ▲攀●ｏｚ轴，重霉●●ｚ。。＝“ｌ“‘之－ｌ‘“－．日ｌ。”Ｉ｜－＿ｔ’“。ｌｋｌ。名：“。ｖｔ。“。ｃ＿。宁“图１Ｆｉｇ １１１ＫＡＰｌ＋３謦歹ｌｌ的限触性酶切分耩Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｙｓｉｓ ｏｆＫＡＰｌ。３ＣＣ＂ａ骺ＴＩ舯ａｏ＾＾钟●口 《■≥＾Ｊ‘：＃日ｕｃ●《：ｃＴＴ群Ｉ辱●ｏ ｔ＿，ｗＸ■●－●Ｘ年ｔ，薰 ■Ｉ＿●Ｚ一?‘，ｌ＇－，，ｒｌ口１，ｚ’ｂ，ｆｔｏ｝％量－工茸＇缸，虐’ｔａＦＶＺ““７－＂－，”毛一‘ｏｗ““ “‘警ｈ“枷一‘。””４、＂“““。；：罢 ｌ二ｉ冀‘：ＩＰｊＬ●葚“”翱１ ２ ＫＡＰ６。ｌ廖列的限制性酶切分攒Ｆｉｇ １２ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ａｎａｙｓｉｓ ｏｆＫＡＰ６。１４。５绒山革ＫＡＰ基因ｃＤＮＡ序列与其他哺乳动物的同源性和进化分析２６内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测４．５．１绒山羊ＫＡＰｌ．３ ｃＤＮＡ序列及同源性和进化分析 克隆片段ＫＡＰＩ．３属于中度同源序列，基因序列在物种间变异小，分子进化上相当保守。经搜索ＧｅｎＢａｎｋ，找到其他哺乳动物包括绵羊、人、马、狗、黑猩猩、 和褐鼠ＫＡＰ基因的ＤＮＡ序列或ｍＲＮＡ序列，然后运用ＤＮＡＳＴＡＲ软件进行多序列比对。 结果显示，克隆得到的绒山羊ＫＡＰｌ．３基因片段与绵羊、人、马、狗、黑猩猩、和 褐鼠的同源性分别是９９．７％、８０．３％、８６．９％、８４．４％、８１．０９６和７６．５％（图１３）；其中 与绵羊的ＫＡＰＩ．３同源性最高（９９．７％）。与人、马、狗和黑猩猩的同源性比较低一点，其中与鼠的同源性最低（７６．５％）。同时对ＫＡｌ．３基因的核酸序列进行了进化分析，结果表明ＫＡＰ基因在哺乳动物的分子发育进化中很保守。 用ＤＮＡＳｔａｒ分析软件对该序列的ＯＲＦ分析，未发现完整的ＯＲＦ开放读码框， 通过与绵羊的ＫＡＰＩ．３ｃＤＮＡ全序列比较发现，克隆所得的片段位于绵羊ＫＡＰＩ．３ｃＤＮＡ 全序列开放预读框的３’末端。其本身不包含启动子和终止子等非编码区序列，因 此可以推断克隆所得到得基因片段为处于绒山羊ＫＡＰＩ．３外显子区域，属于编码区。ＢＳｈｅｅｐ Ｈｕｌｔａｎ Ｈｏｒ５ｅＤｏｇｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｎｏｒｖａｙ七ａｔ妄垒鱼曼！曼堡！堡写竺曼竺至量！堡鱼』：一生―里―旦―旦二旦―旦二！．－』Ｌ』埠４００ ４１０４２０内蒙古农业大学农硕士学位论文２７Ｅ幻ｏｔｉ仁ｙ』Ｌ』Ｌ＿曼监色量宝！堡写量Ｚ堡宝璺曼量量篁；堡宝互堡！堡！壁垒；４３０ Ｂ Ｓｈｅｅｐ ４４０４５０ 工３６ ３６９ ４０５ ２６６ ３４４ＨｕｍａｎＨｏｒｓｅ ＤｏｇｃｈｉｍｐｎｚｅｃＮｏｒｖｅｒｙ ｒａｃ Ｍａ，ｏｒｉｔ；ｙ４４６３６Ｓｊ三―垒―』Ｌｊ三三堡曼墨曼辱￡曼量￡曼墨！曼妄＝堡曼！曼￡￡墨曼曼葺４６０ ４７０ ４８０工６６ ３９９Ｂ ＳｈｅｅｐＨｕ皿ｅｕ％Ｈｏｒ５ｅＤｏｇ４３５２９６ ３７４ ４７６ ３９Ｓｃｈｉｍｐ∽ｚｅｅＮｏｒｖａＹｒ＾ＣＭａｊｏｒｉｔｙ４９０ Ｂ ５００ ５工０ １９６ ４２９ ４６５ ３２６ ４０４ ５０６ ４２５ＳｈｅｅｐＨｕｍａｎ Ｈｏｒｓｅ Ｄｏｇ ｃｈｉｍｐ ８＝ｎｚｅｅ ＮｏｒｖａＹ ｒａｔＭａｊ ｏｒｉ七Ｙ垒．＿！曼曼！垒曼王曼＝堡堡垒星垒堡！曼量；堡曼！曼曼￡曼呈曼写５２０ ５３０ ５４０ ２２６ＢＳｈｅｍｐ Ｈｕｍｅ口ｎ ＨｏｒｓｅＤｏｇ４５９４９５ ３５６４３４５３６ ４５Ｓｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ ＮｏｒｖａＬｙ ｒａ七 Ｍａ）ｏｒｉ七ｙ垒堡曼曼！曼曼！堡写！堡星王垒里！曼曼；＝＝＝二＝！堡！曼牟５５０ ５６０ ５７０ ２５工ＢＳｈｅｅｐ Ｈｕｍａｎ ＨｏｒｓｅＤｏａ４８４５工９ ３８６ ４５８ ５６０ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅ Ｎｏｒ∞，ａｙ 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（ＡＴＧ－ＴＧＡ），位于克隆片段的３３ｂｐ到２４８ｂｐ之间，共编码７１个氨基酸。Ｍ旱）ｏｒｉｔＹ￡！！里！￡！垒曼｛曼垒二二二＝＝垒曼辱垒！垒垒曼！型垒牟！垒垒里８６０ ８７０ ８８０２５Ａ Ｇ０ａＣ Ｓｈｅｅｐ Ｃａ七七工ｅ Ｈ０【ｓｅ ＨＯＵＳｅ ＭＯＵＳｅＳ５ 工２９ ２Ｚ工 ３０８ ２２工 ８５９Ｒａｂｂｉ七Ｍａｊ ０【ｉｃｙ曼垒皇￡垒｝曼垒！曼！曼！曼曼Ｓ！垒！！』Ｌ』Ｌ至二垦―皇―毒―垒―￡二！―叁―￡―！―垒―￡８９０ ９００ ９１０ Ｓ９ ８９ １６３ ２Ｓ５ ３４２Ａ Ｇ０ａ七 Ｓｈｅｅｐ ＣａＣ七ｌｅ Ｈ０【ｓｅ ＨＯＵＳｅ Ｒａｂｂｌ七 ＭＯＵＳｅ２Ｓ５ ８９３内奠古农业大学农硕士学位论文Ｍａｊ ｏ【ｉｔＹ约Ａ Ｇｏａｔ Ｓｈｅｅｐ Ｃａｔｔｌｅ ＨＯｒ３ｅ９３ １２３ １９７ ２８９ ３７６ ＨＯｕ３ｅ ２８９ ９２７ＨＯｕ３ｅＲａｂｂｉＣＨａＪ ｏｒｉｔＹ』Ｌ』己』三ｊ￡＿＿垦―曼―曼―导―！―堡―！业曼．！皇！｛堡￡！曼￡！壁！！牟曼堡垒￡！曼９６０ ９７０９８０１２７ ｌＳ７ ２３ｌ ３２０ ４１０Ａ ６０ａｔ Ｓｈｅｅｐ Ｃａｔｔｌｅ ＨＯｒ３ｅ ＨＯＵＳｅ ＨＯＵＳｅ３２０Ｒ８ｂｂｉ七９５８Ｍａｊ ＯＥｉｔｙ三旦生ｏＵ』』旦坐旦导！曼堡堡￡！曼！曼早￡！垒！壁垒￡！皇：９９０ １０００ １０１０ １０２０ １６ｌ １９ｌ ２６５ ３Ｓｌ ４４４ ３Ｓｌ ９８９Ａ Ｇｏａｔ Ｓｈｅｅｐ Ｃａｔｔｌｅ ＨＯｒ５ｅ ＨＯＵＳｅ ＲａｂｂｉＣ ＨＯＵＳｅＭａｊ ｏｒｉｔｙＧＧＣ Ｔ Ａ ＣＧ６ＣＴＧ Ｔ Ｇ ＧＣＴ ＣＣＧＢＣＴ ＧＴ ６ ６ＣＴ ＧＴ ＧＧＡ Ｔ１０３０ Ａ ＧＯａＣ Ｓｈｅｅｐ Ｃａｔ七１ｅ ＨＯｒＳｅ ＨＯＵＳｅ ＲａｂｂｉＣ ＨＯＵＳｅ工０４０１０５０ １９５ ２２５ ２９９ ３７６ ４７８ ３７６ １０２０Ｈａｊｏｒｉｔｙ６ Ｔ ６ＧＣ Ｔ Ａ Ｔ Ｇ １０６０ＧＣ Ｔ Ａ Ｔ ＧＧＣ Ｔ ＣＣＣＧＣＴ ＣＴ ＣＴ ＣＴ ＧＴ ＧＧ１０７０１０８０ ２２９ ２５９ ３３３ ４１０ ５１２Ａ Ｇｏａｔ Ｓｈｅｅｐ Ｃａｔｔｌｅ Ｈｏｒｓｅ Ｈｏｕｓｅ Ｈｏｕｓｅ４１０ 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根据单因素方差分析，利用ＳＰＳＳｌｌ．５软件包过程分析各位点对经济性状影响 的效应。然后通过多重比较，分析各个基因型对羊毛经济性状影响的效应。４．６．２各个位点的基因频率和基因型频率裹３位点的基因频率和基因型频率Ｔａｂ Ｉｅ３Ｇｅｎｅ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ｆｒｅｑｕｅｎｔ ｉｅｓ４．６．３各个位点的遗传参数值 不同位点多态性作为分子标记研究指标的可行性与其自身及在特定群体中表现出的遗传特性有关。纯合度反映某一基因位点上等位基因间纯合的程度。杂合度又称基因多样度，反映群体遗传变异程度的大小，反映各群体在几个座位上的遗传 变异。一般认为它是度量群体遗传变异的一个最适参数，它与纯合度相对。３２内蒙古白绒山羊两个ＫＡＰ基因克隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测表４多态性位意的纯合度、杂合度、有效等佼基嚣数硬多淼信恚含量Ｔａｂｌｅ ４Ｈｏｍｏｚｙｇｏａｉｔｙ、ｈｅｔｅｒｚｙｇｏａｉｔｙ、Ｎｅ、ＰＩＣｏｆｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｌｏｃｕｓ衡量群体在一个位点上的遗传交异的指标除纯合度、杂合度夕＾，还有有效等位基因数、多态信息含量（ＰＩＣ）等。当ＰＩＣ＞０．５时，该座位为高度多态，０．５＞ＰＩＣ＞Ｏ．２５隽中度多态，ＰＩＣ＜０。２５为低度多态。对于～个群体两言，ＰＩＣ高、等伎基因数露多、 杂合度大，则该位点的遗传变异性就高，有较大的选择潜力。由上表（表４）可知， 位点Ｓｌ、Ｓ２均处于中度多态。 ４．６。４各个位点的基因和基因型与绒山羊经济性状关系分析 用孳｜物扩增产物的ＳＳＣＰ所得的基因型同绒出羊经济性状进行单嚣素方差分析 和多重比较分析（ＳＰＳＳｌｌ．５统计软件），结果见下： ４．６．４．１各个位点与绒山羊经济性状的单因素方差分析表５蒸函与经济性状之间的方楚分析Ｔａｂｌｅ ５ ＡＮＯＶＡ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｔｒａｉｔｓ洼：表孛宰表示羞舜显著（Ｐ＜Ｏ．０５）４．６．４．２各个基因型与绒山羊经济性状的多重比较通过ＰＣＲ－－ＳＳＣＰ检测，内蒙古自绒山羊Ｓｌ和Ｓ２位点平均杂合度分别为０．４８８７ 和０．４９９４：平均多态信息含量分别为０．３６９３和０．３７４７，Ｓ１，Ｓ２位点处于中度多态。内蒙吉农业大学农硕士学位论文３３应用ＳＳＰＳＩＩ。５软件进行单因素方差分析发现Ｓ２位点的基因与产绒量性状有显著的 相关性（Ｐ＜ｏ．５）。通过多重比较分析发现在产绒量性状上，Ｓ２位点ＡＡ基因型和ＢＢ 基因型有显著相关性（Ｐ＜ｏ．０５），ＡＢ基因型和ＡＡ基因型的差异不显著（Ｐ＞Ｏ．０５）；在 细度性状上ＡＢ基因型和ＢＢ基因型有显著相关性（Ｐ＜ｏ．０５），遵过以上分析，找出决 ．定绒山羊经济性状的候选基因，通过基因型可以对经济性状进行标记选择，这正是 我们所说的标记辅助选择。面我们所选基因编码的蛋自质正是羊绒纤维的组成成分，将其作为候选基因具有一定的功熊基础。３４内蒙古自绒出羊嚣个ＫＡＰ基因党隆、序列分析及ＰＣＲ－ＳＳＣＰ检测５讨论 ５。１绒山羊基因组ＤＮＡ的提取绒山羊基因组ＤＮＡ的提取是整个分予尧隆操作的第一步。作为ＰＣＲ模板的 ＤＮＡ，其质量的好坏和浓度的大小将直接影响到ＰＣＲ反应的效率。ＤＮＡ提取的正 确操作是保证基因组质量的关键环节。如祭所提取的ＤＮＡ模板中含有一定浓度的 有机物、盐或糖份等，将会抑制Ｔａｑ聚合酶的活性，降低ＰＣＲ反应的特异性，这 一点应在ＤＮＡ提取过程中注意，特别应解决好以下凡点：一是用蛋白酶Ｋ消化前， 将离心出来的白细胞沉淀尽量用枪尖捣碎，使蛋白酶Ｋ与白细胞能充分反应，消化 完全；＝是用无水乙醇沉淀ＤＮＡ前，使用的乙醇最好是冰箱预冷过的，并且２倍体积的无水乙醇一定要量取准确，因为乙醇过少会沉淀不出来ＤＮＡ，过多刘会将 大量的盐份、糖份等ＤＮＡ抽提液中的杂质析出，从而严重影响模板的质量；三是 提取的ＤＮＡ要尽量傲到浓度均一，这一点可透过提取过程中各种成分的准确添加和适当的稀释倍比来解决；四是ＤＮＡ经乙醇洗涤后，应该在室温或用真空抽干机除去残留的乙醇，注意必须清除彻底，否则将严重影响蜃续反应。５。２ＰＣＲ反应一般来说，影响ＰＣＲ扩增效果的因素包括ＰＣＲ技术所涉及的饪何反应因子和 循环参数，主要包括Ｔａｑ酶浓度、模板浓度和纯度、引物浓度、ＭｇＣｌ２浓度及温度 循环参数等。今天，用于现代分子生物学实验的各种试剂已经高度商业纯和系列化，例如许多公司已经能够生产含有～定浓度ＭｇＣｌ２的ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ，所以整个ＰＣＲ反应体系的优化首先是调整Ｔａｑ酶和ＤＮＡ模扳浓度，Ｔａｑ酶浓度的调整主要是从经 济方面考虑，而ＤＮＡ模板浓度则是主要考虑扩增的特异性问题。赵凯（１９９９）报道，２５ｕｌ反应体积中ＤＮＡ超出６０ｎｇ时会发生弥散现象，即对扩增效果不利。所以一致认为，在２５ｕｌ反应体积中，最适的浓度应为２５ｎｇ左右。但本实验发现，在能 扩增出特异条带的ＤＮＡ浓度范围之内，当浓度跨度相差１００倍时，ＰＣＲ反应依然 有特异性好的产物，这一点在进行二次ＰＣＲ时尤为明显。说明在ＰＣＲ反应时，一 般性的扩增实验对ＤＮＡ的耐受范围是比较大的。其次在设定温度循环参数时，如 果发现有多条霉≥特异性条带产生，就应该减少反应循环次数，同时逶当缩短延伸时 间，就可以达到比较理想的扩增效果。５．３连接转化和克隆操作在进行目的片段的连接转化和克隆操作时，也有以下方面值得考虑。首先，目 的片段与质粒载体进行连接实验时，连接效率的好坏主要取决予感受态细胞的质? 量、ＰＣＲ产物纯化效果及连接时间。如果感受态细胞质量较好，并且连接时间足够 长，ＰＣＲ产物的浓度就显褥比较关键。如果浓度过低，在进行菌液涂板对，就应该内蒙古农业大学农硕士学位论文３５增大量涂板，这样才能保证培养后有足够的阳性菌落产生。另外在进行菌落ＰＣＲ反应时，单克隆菌落的挑取必须在超净工作套间进行，否则外界杂菌的污染将导致 假阳性结果的产生。其次，在进行酶切操作时，应该根据酶切片段的大小选择适当 的胶浓度和样梳。最后在进行ＤＮＡ测序时，因为测序对于模板质量要求非常高，所以无论是ＰＣＲ产物还是质粒样品，纯化必须要彻底，尽量除去引物、杂带等可能对测序结果有影响的因素，这榉才能保证测序结果准确、测序峰图理想。５。４影响ＳＳＣＰ分析的因素