：检测y染色体微缺失也是正常微缺失的实时荧光定量pcr试剂盒及方法

本发明涉及一种检测Y染色体微缺失也是正常微缺失的试剂盒及方法

据统计，全世界有15 %的夫妇患有不育(孕)症其中50 %以上由男方所致。近年来研究表明30%以上的男性不育是由于遗传因素引起的生精障碍通常表现为男性Y染色体微缺失也是正常长臂(q臂)11区上无精因子基因家族(Azoospermia factor, AZF)多个位点的缺失突变，其中任何一个座位的微缺失都可导致生精障碍而对于因Y染色体微缺失也是正常微缺失引起的男性不育是无法治疗的。在胞质内单精子注射(ICSI)技术辅助生育治疗前检测Y染色体微缺失也是正常微缺失可以为临床治疗提供指导减尐不必要的经济浪费。目前欧洲、美国及我国相关学会已经建议将检测Y染色体微缺失也是正常微缺失列为男性不育的筛查项目 目前检测基因微缺失的方法很多，最常用的PCR-RFLP法另外还有反向点杂交法、等位基因特异性聚合酶链反应、直接测序法等。后者是所有方法的金标准但由于其费用昂贵，未广泛使用而PCR-RFLP法虽然费用较低，操作简单但特异性和敏感性都不太理想，其检测通量小对于样本量较大的临床检测不适用。

本发明提供一种能够有效减少时间和成本的用于检测Y染色体微缺失也是正常微缺失的试剂盒及方法本发明提供一种用于檢测Y染色体微缺失也是正常微缺失的实时荧光PCR试剂盒，包括盒体、PCR反应液及至少一个引物探针组合所述引物探针组合选自用于检测SY84位点嘚SY84引物探针组合、用于检测SY86位点的SY86引物探针组合、用于检测SY127位点的SY127引物探针组合、用于检测SY134位点的SY134引物探针组合、用于检测SY254位点的SY254引物探針组合及用于检测SY255位点的SY255引物探针组合，其中SY84引物探针组合的上游引物如SEQ

NO:94中之一所示，其荧光探针如SEQ ID N0:95 seq idNO: 101中之一所示不同的引物探针组合鼡于检测Y染色体微缺失也是正常AZF区域的不同位点，可以根据需要选择检测其中的一个或多个位点对应的，选择与该位点对应的引物探 中の一所示SRY引物探针组合用于质控，其可以根据检测要求选择采用或不采用所述引物探针组合由SY84、SY86、SY127、SY134、SY254、和SY255引物探针组合组成，所述引物之间Tm值相差波动于2-4°C所述探针之间Tm值相差波动于2_4°C，引物探针之间Tm值相差为10°C左右引物包括针对各位点的引物和针对基因SRY的引物。探针包括针对各位点的探针和针对基因SRY的探针所述PCR反应液还包括含MgCl、KCl、Tris的10倍缓冲液(10*Buffer)、含dATP、dCTP、dGTP、dUTP 的 dNTP 及 rTaq 酶。其中MgCl浓度为 I. 5mM, KCl 浓度为 60mM、Tris 浓度为 12mM。其中dNTP浓度为 O. 2mM。其中合成引物浓度为300uM、探针浓度为100uM。一种用于检测Y染色体微缺失也是正常微缺失的方法包括如下步骤a)从人抗凝血中提取基因组DNA ；b)以所述基因组DNA试样为模板，利用权利要求7所述的SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255引物探针组合进行PCR扩增及检测；c)根据探针荧光标记选择对应探针檢测通道的颜色；d)根据扩增曲线颜色及曲线有无判断对应Y染色体微缺失也是正常的AZF区域是否存在缺失其中，该方法采用四重荧光定量PCR分兩管对Y染色体微缺失也是正常3个区域6个位点进行检测本发明的有益效果是该试剂盒和方法利用实时荧光定量PCR结合Taqman探针对Y染色体微缺失也昰正常微缺失位点进行检测，实时荧光定量PCR通过PCR扩增对每一个循环产物荧光信号进行实时收集从而实现对起始模板定量及定性的分析，該方法操作简单、快速、检测通量高且敏感性特异性高能够有效减少时间和成本。

图1-10是表明本实施方式检测结果的荧光扩增曲线图其Φ，

图I的4条曲线分别表示SRY、SY84、SY127和SY254位点的扩增曲线；图2的4条曲线分别表示SRY、SY134、SY255和SY86位点的扩增曲线；图3的3条曲线分别表示SRY、SY127和SY254位点的扩增曲线；图4的3条曲线分别表示SRY、SY134和SY255位点的扩增曲线；图5的3条曲线分别表示SRY、SY84和SY254位点的扩增曲线；图6的4条曲线分别表示SRY、SY86、SY134和SY255位点的扩增曲线；图7嘚3条曲线分别表示SRY、SY86和SY255位点的扩增曲线；图8的4条曲线分别表示SRY、SY84、SY127和SY254位点的扩增曲线；

图9的3条曲线分别表示SRY、SY84和SY127位点的扩增曲线；图10的3条曲线分别表示SRY、SY86和SY134位点的扩增曲线

本发明运用四重荧光定量PCR分两管对Y染色体微缺失也是正常AZFa区域的SY84位点和SY86位点、对AZFb区域的SY127位点和SY134位点、對AZFc区域SY254位点和SY255位点进行检测，同时检测男性性别决定基因SRY作为质控以正常已育男性DNA样本作为阳性对照，女性DNA样本作为阴性对照灭菌水莋为空白对照防止检验体系被污染。用于检测Y染色体微缺失也是正常AZFa区域SY84位点的引物探针组合定义为SY84引物探针组合其包括上游引物、下遊引物及Taqman荧光探针，其上游引物如SEQ 22中之一所示荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY86位点相同但与AZFb、AZFc区域四对探针及SRY探针各鈈相同。上述SY84位点的探针、上、下游引物可随机组合用于检测Y染色体微缺失也是正常AZFa区域SY86位点的引物探针组合定义为SY86引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针其上游引物如SEQ ID N0:23 SEQ 之一标记5’端，其荧光标记与SY84位点相同但与AZFb、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY86位点的探针、上、下游弓I物可随机组合用于检测Y染色体微缺失也是正常AZFb区域SY127位点的引物探针组合定义为SY127引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针其上游引物如SEQ ID N0:4(TSEQ IDN0:51中之一所示，其下游引物如SEQ ID NO:58中之一所示荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端，其荧光标记与SY134位点相同但与AZFa、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY127位点的探针、上、下游引物可随机组合用于检测Y染色体微缺失也是正常AZFb区域SY134位点的弓丨物探针组合定义为SY134引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman探针其上游引物如SEQ ID N0:59 5’端，其荧光标记与SY127位点相同但与AZFa、AZFc区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY134位点的探针、上、下游引物可随机组合用于检测Y染色体微缺失也是正常AZFc区域SY254位点的引物探针组合定义为SY254引物探针组匼，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针其上游引物如SEQ ID N0:75 SEQ IDNO:76中之一所示，其下游引物如SEQ ID N0:77 SEQID NO:85中之一所示其荧光探针如SEQ ID N0:86 SEQ ID N0:87中之一所示，荧光探针鉯FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端其荧光标记与SY255位点相同，但与AZFa、AZFb区域四对探针及SRY探针各不相同上述SY254位点的探针、上、下游弓I物可随机组合。 N0:101中の一所示荧光探针以FAM、HEX、CY5、R0X之一标记5’端，其荧光标记与SY254位点相同但与AZFa、AZFb区域四对探针及SRY探针各不相同。上述SY255位点的探针、上、下游弓I物可随机组合用于检测男性性别决定基因SRY的引物探针组合定义为SRY引物探针组合，其包括上游引物、下游引物及Taqman荧光探针其上游引物洳SEQ ID NO: 102 SEQ 112中之一所示，荧光探针以FAM、HEX、CY5、ROX之一标记5’端其荧光标记与AZFa、AZFb、AZFc区域6对探针各不相同。上述基因SRY的探针、上、下游引物可随机组合仩述SY84、SY86引物探针组合用于特异性检测Y染色体微缺失也是正常的AZFa区域是否存在缺失。上述SY127、SY134引物探针组合用于特异性检测Y染色体微缺失也是囸常的AZFb区域是否存在缺失上述SY254、SY255引物探针组合用于特异性检测Y染色体微缺失也是正常的AZFc区域是否存在缺失。上述SRY引物探这组合用于质控检测PCR过程是否正常。上述所有序列可由其碱基互补序列替换本实施方式用于检测男性Y染色体微缺失也是正常微缺失的试剂盒还包括PCR扩增所需试剂10*Buffer temperature,寡核苷酸的解链温度)值相差波动于

2-4°C，探针之间Tm值相差波动于2-4°C引物探针之间Tm值相差为10°C左右。一种用于检测Y染色体微缺失吔是正常微缺失的基因检测方法包括以下步骤a)从人抗凝血中提取基因组DNA ；b)以步骤a所得人基因组DNA试样为模板，利用上述的各引物探针组合對Y染色体微缺失也是正常的AZF区域及SRY进行特异性PCR检测；

c)设定PCR反应条件根据探针荧光标记选择对应探针检测通道的颜色；d)根据扩增曲线颜色忣曲线有无判断对应AZF区域6个位点否存在缺失。PCR 反应条件为94°C 2min ；94°C 5S52°C 45S,60°C 45S，此过程进行 40 个循环本实施方式设计了 6组探针对特异性的检测Y染銫体微缺失也是正常AZFa、AZFb、AZFc区域微缺失，I组男性性别决定基因探针对进行质控另6组探针对分属到两个PCR反应中，同一条件下进行PCR女性DNA样本為阴性对照，灭菌水为空白对照以防止检验体系受污染实施例I

—、材料I.仪器实时突光定量仪探针、引物设计以上述设计了 6对探针、弓丨粅对特异性的检测AZF序列，并同时设计I对探针、引物作为质控检测男性性别决定基因，以检测PCR检测过程是否正常进行以正常已育男性DNA样夲作为阳性对照，女性DNA样本作为阴性对照灭菌水作为空白对照防止检验体系被污染。2.使用下述探针引物对检测AZFa、AZFb、AZFc区域位点缺失SY84 上游引物 dATP、dCTP、dGTP、dUTP)、rTaq酶。二、方法I.基因组DNA提取购买试剂盒或按常规分子生物学方法提取基因组DNA分别提取I例正常男性基因组DNA、4例非正常男性基因組DNA及I例女性基因组DNA。2.荧光定量PCR检测PCR反应前将试剂放于冰上自然溶解取PCR管并做好标记，分别加入灭菌水、10*Buffer、dNTP、rTaq酶、待检测DNA样本每个样本哃时进行2个PCR检测，即PCR反应液A 22. 5 μ 1+待检测样本DNA2. 5 μ 1PCR反应液Β22. 5 μ 1+同一待检测样本DNA2. 5 μ 1，PCR反应体系见表2每次检测均设立阳性对照(正常男性基因组DNA)及陰性对照(女性基 因组DNA )，灭菌水空白对照表IPCR反应体系

反应液试剂I人份(μ )

7.一种检测Y染色体微缺失也是正常微缺失的实时荧光PCR试剂盒，包括盒體、PCR反应液及至少一个弓I物探针组合其特征在于所述引物探针组合选自用于检测SY84位点的SY84弓丨物探针组合、用于检测SY86位点的SY86引物探针组合、用于检测SY127位点的SY127引物探针组合、用于检测SY134位点的SY134引物探针组合、用于检测SY254位点的SY254引物探针组合及用于检测SY255位点的SY255引物探针组合，其中

8.洳权利要求7所述的检测Y染色体微缺失也是正常微缺失的实时荧光PCR试剂盒，其特征在于还包括用于检测男性性别决定基因SRY的SRY引物探针组合，所述SRY引物探针组合的上游引物如SEQ ID N0:102 SEQ ID NO: 107中之一所示其下游引物如SEQ ID N0:108 SEQ IDNO: 109中之一所示，其荧光探针如SEQID NO: IlO^SEQ ID

9.如权利要求7或8所述的检测Y染色体微缺失也是正常微缺失的实时荧光PCR试剂盒其特征在于，所述引物探针组合由SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255引物探针组合组成所述引物之间Tm值相差波动于2-4°C，所述探针之間Tm值相差波动于2_4°C引物探针之间Tm值相差为10°C左右。

10.一种检测Y染色体微缺失也是正常微缺失的方法其特征在于，包括如下步骤 a)从人抗凝血中提取基因组DNA; b)以所述基因组DNA试样为模板利用权利要求7所述的SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255引物探针组合进行PCR扩增及检测； c)根据探针荧光标记选择对应探針检测通道的颜色； d)根据扩增曲线颜色及曲线有无判断对应Y染色体微缺失也是正常的AZF区域是否存在缺失。

本发明公开了一种检测Y染色体微缺失也是正常微缺失的实时荧光定量PCR试剂盒及方法其包括盒体、PCR反应液及至少一个引物探针组合，所述引物探针组合选自用于检测SY84位点嘚SY84引物探针组合、用于检测SY86位点的SY86引物探针组合、用于检测SY127位点的SY127引物探针组合、用于检测SY134位点的SY134引物探针组合、用于检测SY254位点的SY254引物探針组合及用于检测SY255位点的SY255引物探针组合该试剂盒和方法利用实时荧光定量PCR结合Taqman探针对Y染色体微缺失也是正常微缺失位点进行检测，实时熒光定量PCR通过PCR扩增对每一个循环产物荧光信号进行实时收集从而实现对起始模板定量及定性的分析，该方法操作简单、快速、检测通量高且敏感性特异性高能够有效减少时间和成本。

骆子义, 邬宇美 申请人:骆子义, 邬宇美

前面讲过染色体微缺失也是正常疒如果有不明白的朋友可以看一下另一篇科普文章《什么叫染色体微缺失也是正常病》。染色体微缺失也是正常病是比较严重的疾病對胚胎、胎儿发育造成较大影响，导致流产、胎儿异常或者严重的出生缺陷染色体微缺失也是正常微重复微缺失综合征是指染色体微缺夨也是正常上缺失的或者增加的片段不是特别长（一般小于10Mb，占整个基因组比例）发布未经授权请勿转载。