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金属β-内酰胺酶研究进展
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β内酰胺酶的分类与检测检测,ββ,检验,内酰胺酶的,内酰胺酶,内酰胺酶和,酶的分类,分类和检测
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硕士论文--多重耐药鲍曼不动杆菌主要β-内酰胺酶基因型及同源性研究
山西医科大学 硕士学位论文 多重耐药鲍曼不动杆菌主要β-内酰胺酶基因型及同源性研究 姓名：杜娟 申请学位级别：硕士 专业：药剂学 指导教师：赵生芳;段金菊
山西医科大学硕士学位论文多重耐药鲍曼不动杆菌主要旷内酰胺酶基因型及 同源性研究摘要鲍曼不动杆菌是目前引起医院内感染的重要病原菌。随着广谱抗菌药物的广泛应用， 多重耐药的鲍曼不动杆菌比例不断上升，并在全球多处的重症监护病房发生爆发流行，成 为抗感染治疗的棘手问题。根据美国院内感染监测数据（Ⅻ小Ｓ）以及中国院内感染病原 菌调查显示，不动杆菌属在医院内感染中占第４位，成为仅次于铜绿假单胞菌的又一个重 要的非发酵病原菌。自１９９１年美国首例碳青霉烯类耐药的不动杆菌属（ＣＲＡ）报道以来， 世界各地陆续出现此类菌株。近两年来，ＣＲＡ已成为国际社会讨论的热点话题之一。因 为一旦亚胺培南耐药，就意味着对现有的常用广谱抗菌药物均耐药，即泛耐药株（ＰＤＲＡ）。 由ＰＤＲＡ引起的感染，常常无药可用，病死率高。 不动杆菌的耐药机制复杂，包括产生灭活酶，使抗菌药物失活；改变作用靶部位，从 而逃避抗菌药物的作用：改变外膜孔蛋白结构和数量，降低了细菌外膜药物的通透性：激 活外排泵系统，进一步降低了细菌胞内抗菌药物的浓度等。近年来山西医科大学第二医院 不动杆菌尤其是鲍曼不动杆菌的分离率不断增加，耐药率也不断上升，本研究筛选２００７ 年７月到２００８年５月临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌，并对其耐药性、同源性及主要ｐ．内酰胺酶基因型进行研究。１、多重耐药鲍曼不动杆菌的筛选及耐药性研究 菌株来源：连续收集山西医科大学附属第二医院２００７年７月到２００８年５月临床分离 的多重耐药鲍曼不动杆菌菌株。 方法：采用Ｋ－Ｂ纸片法，以大肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２、鲍曼不动杆菌ＡＴＣＣｌ９６０６为质 控菌，筛选多重耐药不动杆菌。采用琼脂稀释法测定１２种抗菌药物的ＭＩＣ值。抗菌药物结果按２００７年ＣＬＳＩ标准判定。结果：筛选出６０株多重耐药鲍曼不动杆菌，它们对１２种抗菌药物的抗菌活性中，亚 胺培南、美罗培南的耐药率分别为４５．２％、３３．９％，含酶抑制剂的复合制剂头孢哌酮／舒巴 坦、哌拉西林／他唑巴坦的耐药率分别为３３．３％、５９．０％，米诺环素和多粘菌素Ｅ分别为山西医科大学硕士学位论文１６．１％、９．７％，其它抗菌药物的耐药率均在７０９６以上。２、多重耐药鲍曼不动杆菌同源性研究 菌株来源：连续收集山西医科大学附属第二医院２００７年７月到２００８年５月临床分离 的多重耐药鲍曼不动杆菌菌株。 方法：利用脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ）技术对我院多重耐药鲍曼不动杆菌进行同源性研 究，并对其流行情况、克隆分型进行了分析。 结果：６０株菌株可分为５个克隆株，其中Ａ、Ｂ为主要克隆株。Ａ克隆有３个亚型共 ２８株， Ｂ克隆有１个亚型共９株， Ｃ克隆有２个亚型共４株， Ｄ、Ｅ各有３和２株，另外还有１４株散发菌株。克隆株在病房内、病房间传播成为我院鲍曼不动杆菌分离率上升，菌株不断增加的主要原因。３、多重耐药鲍曼不动杆菌主要Ｂ一内酰胺酶基因型研究 菌株来源：连续收集山西医科大学附属第二医院２００７年７月到２００８年５月临床分离 的多重耐药鲍曼不动杆菌６０株。 方法：利用三维实验、双纸片协同实验，进行各种ｐ一内酰胺酶检测。 利用ＰＣＲ扩增、序列分析明确Ｄ．内酰胺酶基因型，ＰＣＲ扩增主要ｐ．内酰胺酶编码基 因包括：＠ＥＳＢＬｓ基因：ＴＥＭ型、ＳＨＶ型、ＰＥＲ型、ＣＴＸ．Ｍ．１型、ＣＴＸ―Ｍ．９型、ＧＥＳ型、ＶＥＢ型；②染色体携带的ＡｍｐＣ酶基因：ＡＤＣ；③碳青霉烯酶基因：ＯＸＡ．２３型、ＯＸＡ－２４型、ＯＸＡ．５８型、ＩＭＰ型、ＶＩＭ型、ＳＩＭ．１。接合实验、质粒抽提、电转化等明确Ｄ．内酰胺酶基因定位。结果：三维实验阳性，提示菌株可能产Ｂ．内酰胺酶。 ６０株多重耐药鲍曼不动杆菌ＰＣＲ扩增后，ｂｌａＴＥＭ基因阳性的有４２株，ｂｌａＰＥＲ有２０株 阳性，２株菌株携带ＳＨＶ－２基因；１株菌株ＣＴＸ．Ｍ．１组引物扩增得到阳性产物，序列分析 证实为ｂｌａｃＴＸ．Ｍ．３．ｂｌａＡＤＣｔ．７基因阳性的有５７株，ｂｌａＡＤｃｓ基因阳性的有２株；ｂｌａｏｘＡ．２３基因 阳性的有１５株。 对产ＣＴＸ．Ｍ．３型ＥＳＢＬｓ的菌株成功进行接合试验，并对其原始菌和接合菌抽提了质 粒，国内未见相关报道。产ＳＨＶ型的两株菌株虽然成功抽提了质粒，但接合实验虽进行多次仍未成功，转化实验也未成功。其它菌株反复多次接合试验、抽提质粒以及电转化均未成功。Ⅱ山两医科大学硕十学位论文以上研究表明：１、我院鲍曼不动杆菌多重耐药现象严重，对多粘菌素Ｅ的耐药率最低，对头孢哌酮／舒巴 坦的耐药率相对较低。２、我院多重耐药的鲍曼不动杆菌的分离率较高，达３４％；菌株可分为５个克隆株，其中Ａ、 Ｂ为主要克隆株。提示我院有多重耐药鲍曼不动杆菌小型爆发流行的可能，因此，控制院内感染至关重要。３、表型检测显示所有菌株金属酶检测试验阴性；头孢曲松、头孢西丁三维实验提示菌株 产Ｂ．内酰胺酶。 ４、我院多重耐药鲍曼不动杆菌主要的ＥＳＢＬ基因型是ｂｌａＴＥＭ和ｂｌａＰＥＲ，同时检测到ＳＨＶ型基因；碳青霉烯酶基因型为ｂｌａｏｍ２３，全部为ＣＡＲＢ，提示我院的ｐ一内酰胺酶的基因型分布与国内其他地区的分布情况存在很大差异。 ５、我院多重耐药的鲍曼不动杆菌同产多种ｐ．内酰胺酶基因型的菌株较多，提示临床治疗应针对这种耐药分布合理选用抗菌药物。６、对产ＣＴＸ．Ｍ一３型ＥＳＢＬｓ的菌株成功进行了接合试验，并对其原始菌和接合菌抽提了质 粒。质粒介导的鲍曼不动杆菌的耐药性可以在不同种属间广泛传递、导致耐药性播散 的可能，造成医院感染的流行，给临床抗感染治疗构成很大威胁。【关键词】鲍曼不动杆菌；耐药性；ｐ．内酰胺类抗菌药物；ＥＳＢＬｓ：ＡｍｐＣ酶；ＯＸＡ型碳青霉 烯酶；脉冲场凝胶电泳；质粒；接合实验Ｉｌｌ山西医科大学硕十学位论文Ｓｔｕｄｙｏｎｍａｊｏｒ ｐ－ｌａｃｔａｍａｓｅｓａｎｄ ｒｅｌａｔｅｎｅｓｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉ??ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉＡｂｓｔｒａｃｔｐａｔｈｏｇｅｎ ｗｈｉｃｈ ｃａｕｓｅｄ ｔｈｅ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｉｓ ｔｈｅｕｓｅａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｗｉｔｈｏｆａｂｒｏａｄｒａｎｇｅ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ａｇｅｎｔｓ，ｔｈｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｔｈｅ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔｃａｒｅＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓ ｒｉｓｉｎｇ，ａｎｄ ｈａｐｐｅｎｅｄ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｉｎ ｍａｎｙ ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ ａｒｏｕｎｄｕｎｉｔｔｈｅ ｗｏｒｌｄ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｄａｔａ ｏｆＮａｔｉｏｎａｌ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ，Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．ｗａｓ０＇ｒＮＩＳ）ａｎｄ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｈｅ４ ｍｏｓｔｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ 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７０％．ａｎｄ ９．７％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ２．Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｎｅｓｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉＳｔｒａｉｎ Ｓｏｕｒｃｅ：Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉ―ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｊｕｌｙ ２００７ ｔｏＭａｙ ２００８ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｓｈａｎｘｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｐｕｌｓｅ ｆｉｅｌｄ ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＦＧＥ）ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｎｅｓｓ ｏｆ ６０ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｏｔａｌ ｏｆ ６０ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏｔｈｅｐｏｐｕｌａｒ ５ ｃｌｏｎｅｓ．Ｃｌｏｎｅ Ａ ｈａｄ ２８ ｓｔｒａｉｎｓ，Ｃｌｏｎｅ Ｂｈａｄ Ｗｅｉｎ９ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｃｌｏｎｅ Ｃ，Ｃｌｏｎｅ Ｄ ｆｏｕｎｄａｎｄＣｌｏｎｅ Ｅ ｈａｄ ４ ｓｔｒａｉｎｓ，３ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ２ ｓｔｒａｉｎｓ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｔｈａｔｃｌｏｎｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｗｅｒｅｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔｉｓｏｌａｔｅｓ ａｎｄｈａｄｓｐｒｅａｄ ｗｉｄｅｌｙ ａｍｏｎｇ ｗａｒｄｓｔｈｅｈｏｓｐｉｔａｌｓ．３．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｏｆｍａｊｏｒ争ｌａｃｔａｍａｓｅｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅ ｉｎ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔ八ｂａｕｍａｎｎｉｉＳｔｒａｉｎ Ｓｏｕｒｃｅ：Ｃｏｌｌｅｃｔｍｕｌｔｉ―ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＭｅｄｉｃａｌＡ．ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｊｕｌｙ ２００７ ｔｏ Ｍａｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．２００８ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ ＳｈａｎｘｉＭｅｔｈｏｄｓ：Ｃｒｕｄｅ ｌＢ－ｌａｃｔａｍａｓｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ 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ｓｈｏｗｓ：１．Ｍｕｌｔｉ―ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗａｓ ｍｏｒｅ ａｎｄ ｍｏｒｅ ｓｅｒｉｏｕｓ．Ｃｏｌｉｎｓｔｉｎ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｇｏｏｄ ｓｕｓｃｃｐｔｉｂｉｌｉｔｙａｇａｉｎｓｔＡ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ．Ｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒａｔｅｓ ｔｏ ｃｅｆｏｐｅｒａｚｏｎｅ／ｓｕｌｂａｃｔａｍ ｗｅｒｅ ｌｏｗ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ．２．Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｏｔａｌ ｏｆ ６０ ｓｔｒａｉｎｓ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｔｈｅｒｅ ｉａａｔｈｅｐｏｐｕｌａｒ ５ ｃｌｏｎｅｓ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｗｅｒｅｔｈｅ ｄｏｍｉｎａｎｔｉｓｏｌａｔｅｓ．Ｉｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔｏｕｒｓｍａｌｌ ｏｕｔｂｒｅａｋ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ ｉｎ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙｃａｎｈｏｓｐｉｔａｌ．ｔｅｓｔｓ３．Ｍｅｔａｌｌｏ―ｐ－ｌａｃｔａｍａｓｅｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ―ｄｉｓｋ．Ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｐ－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ． ａｎｄｂｌａＰＥｇａｒｅｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅ，ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓｐｒｏｄｕｃｅ４．Ｉｎ Ｏｕｒ ｍｕｌｔｉ－ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ，ｂｌａＴＥＭｔｈｅ ｍａｉｎＥＳＢＬ ｇｅｎｏｔｙｐｅ．ａｂｌａｏｘＡ＿２３ ｗａｓ ｍａｉｎ ｃａｒｂａｐｅｎｅｍａｓｅｓ ｇｅｎｏｔｙｐｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ＣＡＲＢ．Ｉｔ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ ｉｎ ５．Ｔｈｅｒｅｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆｌａｃｔａｍａｓｅｔｈｅｇｅｎｏｔｙｐｅ ｂｅｔｗｅｅｎＯＵｔｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ．ａｒｅｓｔｒａｉｎｓ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｗｏｐ－ｌａｃｔａｍａｓｅｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｉｔ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄｔｈａｔ ｗｅｓｈｏｕｌｄ ｃｈｏｏｓｅ ｔｈｅａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌａｇｅｎｔ６．Ｔｈｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｏｆ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇＣＴＸ…Ｍｒｅａｓｏｎａｂｌｙ ｔｏｔｈｉｓ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ．３ ｔｙｐｅ ＥＳＢＬｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ． ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ， ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｐｌａｓｍｉｄ―ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ Ｃａｎ ｂｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｅｄ ｗｉｄｅｌｙｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｉｔｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ【Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ】Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ；ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；１３－ｌａｃｔａｍ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ；ＥＳＢＬｓ；ＡｍｐＣｅｎｚｙｍｅ；ＯＸＡ；ｐｕｌｓｅｄ―ｆｉｅｌｄ ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ｐｌａｓｍｉｄ；ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｔｅｓｔＶＩ山西医科大学硕士学位论文主要英文缩略语与中文对照表（按字母顺序排列）英文缩 略语ＡＭＫＡＴＣＣＡｍｉｋａｃｉｎ英文全称中文全称阿米卡星 美国典型物种保藏中心 氨曲南 标准核昔酸序列比对程序Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ＡｚｔｒｅｏｎａｍＳｔａｎｄａｒｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｎｕｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴＡＴＭＢＩＡＳＴｎＢＩＡＳＴｐ Ｂｐ ＢＨＩ ＣＡＲ ＣＡＲＢ ＣＡＺ ＣＥＣ ＣＩＰ ＣＬＯ ＣＬＳＩ ＣＯ ＣＰＳ ＤＤＤ ＤＤＤｓ ＣＲＯ ＣＴＸ ＥＳＢＬｓ ＦＥＰ ＦＯＸ ＧＥＮ ｈ ＩＳｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ－ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ Ｂａｓｅ ｐａｉｒ Ｂｒａｉｎ－ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ―ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒＣａｒｂａｐｅｎｅｍ―ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ标准氨基酸序列比对程序 碱基对脑心浸液碳青霉烯类耐药的不动杆菌 碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌 头孢他啶 头孢克罗环丙沙星 氯哗西林Ｃｅｆｌａｚｉｄｉｍｅ Ｃｅｆａｃｌｏｒ Ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ Ｃｌｏｘａｃｉｌｌｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｏｌｉｌｌｓｔｉｌｌ临床实验室标准化研究所多粘菌素ＥＣｅｆｏｐｅｒａｚｏｎｅ／ｓｕｌｂａｃｔａｍｄｅｆｉｎｅｄ ｄａｉｌｙ ｄｏｓｅ头孢哌酮／舒巴坦限定日剂量ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ丘ｅｑｕｅｎｃｙＣｅｆｉｒｉａｘｏｎｅ Ｃｅｆｏｔａｘｉｍｅ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ―ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ Ｃｅｆｅｐｉｍｅ Ｃｅｆｏｘｉｔｉｎ Ｇｅｎｔａｍｉｃ：ｉｎ用药频度 头孢曲松 头孢噻肟超广谱１３一内酰胺酶头孢吡肟 头孢西丁庆大霉素 小时 中介 亚胺培南 叠氮钠 左旋氧氟沙星４２ｈｏｕｒ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ＩｍｉｐｅｎｅｍＳｏｄｉｕｍ Ａｚｉｄｅ ＬｅｖｏｆｌｏｘａｃｉｎＩＰＭＪ５３Ａｚｉ ＬＶＸ山西医科大学硕十学位论文ＭＣ Ｍ．Ｈ ＭＩＣｍｉｌｌ ｍｌ ｍｍ ｔｏｏｌ ＮＣＣＬＳＭｉｎｏｅｙｅｌｉｎｅ米诺环素Ｍｕｅｌｅｒ．Ｈｉｎｔｏｎ ＭｉｎｉｍｕｍＭｉｎｕｔｅ ＭｉｌｌｉｌｉｔｅｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ琼脂培养基最低抑菌浓度 分钟 毫升 毫米 摩尔 美国临床实验室标准委员会 氧氟沙星 磷酸盐缓冲液ＭｉｌｌｉｍｅｔｅｒＭｏｏｒｅＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＳｔａｎｄａｒｄｓＯＦＸ ＰＢＳ ＰＦＧＥ ＰＣＲ ＰＩＰ Ｒ ＩＵＦＯｆｌｏｘａｃｉｎ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｐｕｌｓｅｄ－ｆｉｅｌｄ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＰｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ脉冲场凝胶电泳 聚合酶链反应哌拉西林 耐药 利福平 敏感 秒钟 磺胺甲基异恶唑／甲氧苄啶 舒巴坦 他唑巴坦ＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎｒｅｓｉｓｔａｎｔＲｉｆａｍｐｉｃｉｎＳＳｅＣｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ＳｅｃｏｎｄＳＸＴ ＳＵＢ ＴＺＢ ＴＺＰＴｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ／ｓｕｌｐｈａｍｅｔｈｏｘａｚｏｌｅ ｓｕｌｂａｃｔａｍ ＴａｚｏｂａｃｔａｍＰｉｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ／Ｔａｚｏｂａｃｔａｍ哌拉西林／他唑巴坦４３学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中任何引 用他人的成果均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任 何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 本人如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： １、交回学校授予的学位证书； ２、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； ３、本人按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉损害，进行公开 道歉。 ４、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。论文作者签名：学位论文版权使用授权书本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山西医科 大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为山西医科大学。（保密论文在解密后应遵守此规定）论文作者签名： 指导教师签名：同期：――年――月――日 日期：――年――月――日（本声明的版权归山西医科大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用）山两医科大学硕士学位论文．＾上．－Ｊ－刖声一、研究背景不动杆菌属是目前引起医院内感染的重要病原菌。不动杆菌为条件致病菌，广泛分布 于水、土壤、医院环境和人体的皮肤表面，主要引起医院获得性肺炎尤其是呼吸机相关性 肺炎、菌血症、尿路感染、继发性脑膜炎等【１１。随着广谱抗生素的广泛应用，多重耐药的不动杆菌属比例不断上升，并在全球多处的重症监护病房发生爆发流行，成为抗感染治疗 的棘手问题。解放军３０４医院对该院１９９５年．２００２年烧伤病区８年来抗生素的使用情况与铜绿假单胞菌的耐药水平之间的关系进行了研究表明【２１，８年间铜绿假单胞菌对多种抗 生素的耐药率有明显的变化，与之相对应，铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药率分别与大环 内酯类、碳青霉烯类和第三代头孢菌素的使用量呈正相关。根据美国院内感染监测数据 （ＮＮＩＳ）以及中国院内感染病原菌调查显示【３】’不动杆菌属在医院内感染中占第４位。 １９９１年美国报道了首例碳青霉烯类耐药的不动杆菌（ＣＲＡ），此后世界各地陆续出现此类菌 株。近年来，碳青霉烯类耐药的不动杆菌引起了各国学者的广泛关注，成为国际社会讨论 的热点话题。亚胺培南等碳青霉烯类药物耐药，就意味着对现有的常用广谱抗菌药物均耐药，即产生泛耐药株（ＰＤＲＡ）。由泛耐药株引起的感染，常面临无药可用的境地，病死率 高。不动杆菌属的耐药机制复杂，包括产生灭活酶，使抗生素失活；改变作用靶部位，从 而逃避抗菌药物的作用：质粒介导的种间传递和染色体介导的垂直传递产生的耐药；代谢途 径的改变等。介导不动杆菌尤其是鲍曼不动杆菌对Ｂ．内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制有 【ｌ】：产生灭活抗菌药物的１３－内酰胺酶；改变外膜孔蛋白的结构和数量，降低了细菌外膜药 物的通透性；激活外排泵，降低了细菌细胞内抗菌药物的浓度。人们从多重耐药的不动杆菌中发现的多种Ｄ内酰胺酶，包括Ａｍｂｌｅｒ分子分类的Ａ、Ｂ、Ｃ和Ｄ类。其中Ａ、Ｃ、Ｄ类为丝氨酸酶，Ｂ类为会属酶。 不动杆菌中最常见的ｐ．内酰胺酶为ＴＥＭ．１。而Ａ类超广谱酶（ＥＳＢＬｓ）最近也在鲍曼 不动杆菌中发现。ＰＥＲ－１型超广谱酶在鲍曼不动杆菌中最常见，已经有报道在土耳其和韩 国出现流行，在法国、比利时、玻利维亚、美国和我国也有报道１４］。【引。携带有ＶＥＢ．１型超广谱酶的鲍曼不动杆菌也在法国和比利时出现了播削１１。在我国，产ＳＨＶ一１２型超广谱酶的鲍曼不动杆菌已有报道【９１。而荷兰报道了一株同时携带ＳＨＶ．１２和ＴＥＭ．１１６型ＥＳＢＬｓ山两医科大学硕士学位论文的鲍曼不动杆菌【ｌｏ】。意大利学者报道了产ＴＥＭ．９２型ＥＳＢＬｓ的鲍曼不动杆菌【１１】，日本、 玻利维亚报道了产ＣＴＸ．Ｍ．２型ＥＳＢＬｓ的鲍曼不动杆菌【１２】。由于鲍曼不动杆菌中ＥＳＢＬｓ 的检测并没有标准化的方法，并且常常可能受到染色体介导头孢菌素酶的影响，ＥＳＢＬｓ在鲍曼不动杆菌中真实的分布情况较难确定。 金属酶在不动杆菌属中的出现和增加是一个危险的信号。金属酶能够水解包括碳青霉烯类抗生素在内的Ｄ．内酰胺类抗生素，仅对氨曲南没有水解能力【１３】。Ｂ类酶因为在活性位 点携带具有催化活性的金属离子，而和Ａ类和Ｄ类碳青霉烯酶区别。ＩＭＰ型金属酶最早在 １９９１年于日本的铜绿假单胞菌中发现【１４】，到目前已经在世界各地多种细菌中广泛出现。在 鲍曼不动杆菌中，ＩＭＰ型碳青霉烯酶最早在远东地区发现，常存在于Ｉ类整合子的基因盒中【ｌ】。虽然ＩＭＰ型金属酶并不是鲍曼不动杆菌中最主要的碳青霉烯酶，但是有诸多的亚型已经在鲍曼不动杆菌中发现，包括：ＩＭＰ．１、ＩＭＰ．２、ＩＭＰ．４、ＩＭＰ一５、ＩＭＰ．６、ＩＭＰ．１１【１３】，【１５】。除了ＩＭＰ型金属酶外，整合子介导的ＶＩＭ．２型金属酶也在韩国的鲍曼不动杆菌中出现【ｌ２００６年韩国学者又在鲍曼不动杆菌中发现了一类型的金属酶，命名为ＳＩＭ．１（ＳｅｏｕｌＩｍｉｐｅｎｅｍａｓｅ）［１ ７】。６１。与其他许多革兰阴性菌一样，不动杆菌也携带一种染色体介导的Ｃ类酶基因。最近的系 统进化分析方法提示，不同的不动杆菌属细菌染色体介导的ａｍｐＣ酶基因极可能来自于一个 共同的ｐ．内酰胺酶祖先，不动杆菌属菌种之ｆ司ａｍｐＣ基因亲缘关系明显高于与其他菌种的相关性，不动杆菌染色体介导的ａｍｐＣ酶代表着一个新的ｐ．内酰胺酶家族，命名为ＡＤＣｓ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ－ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎａｓｅｓ）［ＩＳ】。目前已经发现并在ＧｅｎＢａｎｋ上登入的ｂｌａＡＤＣ基因已经有２８种【１１。不动杆菌属菌种众多，肯定还会有众多的ＡＤＣｓ基因尚未发现。 Ｄ类ＯＸＡ型Ｄ一内酰胺酶通常具有庆大的青霉素酶活性。一些ＯＸＡ酶能够水解广谱头孢 菌素，比如ＯＸＡ型超广谱酶【１９】。但最令人担忧的是具有碳青霉烯类抗生素水解能力的ＯＸＡ 型酶。最早在鲍曼不动杆菌中发现的具有碳青霉烯酶活性的ＯＸＡ酶是ＯＸＡ．２３，在１９８５年 苏格兰一株临床分离的鲍曼不动杆菌种发现，当时碳青霉烯类抗生素尚未在临床开始使 用。从那时起，质粒介导的ＯＸＡ．２３（最早命名为ＡＲＩ．１，ＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒＲｅｓｉｓｔａｎｔｔｏ Ｉｍｉｐｅｎｅｍ） 陆续在英国、巴西、玻罩尼西亚、新加坡、韩国和中国出现【２０】’【ｌ ９１。另一种质粒介导的ＯＸＡ 型碳青霉烯酶，ＯＸＡ．５８，也在法国、英国、阿根廷、西班牙、土耳其、罗马尼亚、澳大 利亚、希腊、苏格兰、科威特等国的鲍曼不动杆菌种出现口１１。【２３】。通过基因同源性分析，可 以将ＯＸＡ型碳青霉烯酶分成８组【１９１。一般认为ＯＸＡ型碳青霉烯酶对碳青霉烯类抗生素的水 解活性比较弱，但是随着插入序列ＩＳＡｂａ的发现，学者们对ＯＸＡ型碳青霉烯酶介导鲍曼不２山西医科大学硕士学位论文动杆菌碳青霉烯类抗生素的耐药作用有了新的认识【２３】．【２５】研究发现，鲍曼不动杆菌特有的 插入序ＹＵＩＳＡｂａｌ常与ＯＸＡ－２３、ＯＸＡ．５１组基因关系密切，不仅与其基因传递关系密切，而 且能够很大程度上增强这些耐药基因的表达水平，从而介导对ｐ．内酰胺类抗生素的高水平耐药【２５１。不动杆菌对目前使用的抗生素均可产生耐药，而且很容易通过交叉感染在院内流行，给临床抗感染治疗带来挑战，因此如何控制和治疗鲍曼不动杆菌尤其多重耐药引起的感染 已成为临床关注的重点。根据ＭＹＳＴＩＣ（ＭｅｒｏｐｅｎｅｍＹｅａｒｌｙ Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｔｅｓｔ ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）耐药监测的数据结果，从１９９８年到２００５年鲍曼不动杆菌对美罗培南的耐药率 从５．９％上升到２８．６％，敏感性从８４．９％下降到６４．４％【１１。美国学者总结了ＭＹＳＴＩＣ、ＳＥＮＴＲＹ（ＳＥＮＴＲＹＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅＰｒｏｇｒａｍ）、ＴＳＡＲ（ＴａｉｗａｎＣａｒｅ Ｕｎｉｔ ＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅＳｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ ｏｆＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、ＩＣＵＳＳ（ＩｎｔｅｎｓｉｖｅＳｙｓｔｅｍ）、ＴＳＮ（ＴｈｅＮｅｔｗｏｒｋ）等几个临床细菌耐药监测的结果，显示鲍曼不动杆菌对坏丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、头孢他啶、头孢吡肟、氨苄西林／舒巴坦、哌拉西林／他哗巴坦、复方新诺明等的耐药性均在逐年升高【１１。 近年来山医大二院鲍曼不动杆菌分离率不断增加，耐药率也不断上升，本研究筛选了２００７年７月到２００８年５月临床分离多重耐药鲍曼不动杆菌菌株，分析了其耐药性、同源 性及主要ｐ．内酰胺酶（ＥＳＢＬｓ）基因型。由于各地区病人情况、感染菌株及抗生素使用习 惯不同，使感染菌的耐药特性各不相同，因此只有加强对本地区细菌耐药的流行病学及机 制研究，才能更好地为本地区临床合理用药提供有力的依据。二、研究步骤山西医科大学硕士学位论文调查山医大二院１９９８－２００８年鲍曼不动杆菌耐药情况收集山西医科大学第二医院临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌测定对１２种抗菌药物的ＭＩＣ脉冲场凝胶电泳完成细菌同源性完成耐药表型分组和主要流行克隆分布研究图１：菌株收集、多重耐药菌株的筛选、…Ｃ值测定及脉冲场凝胶电泳分型流程Ｊ Ｐ内酰胺酶基因引物扩增上克隆、序列分析上Ｇｅｎｂａｎｋ查对图２：ｐ一内酰胺酶基因检测研究流程图４山西医科大学硕士学位论文第一部分：多重耐药鲍曼不动杆菌的筛选及耐药性研究鲍曼不动杆菌由于其强大的耐药性获得能力，目前使用的所有抗菌药物均可以产生耐药，包括Ｄ．内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类抗菌药物等。碳青霉烯类抗生素对鲍曼不动 杆菌有较好的抗菌活性，是治疗鲍曼不动杆菌重症感染的首选抗生素。近年来对碳青霉烯类抗生素的耐药率迅速上升。鲍曼不动杆菌一旦对碳青霉烯类抗生素耐药（即ＣＲＡＢ）就意味着对大多数临床常用抗菌药物耐药。对ＣＲＡＢ感染治疗时的抗菌药物选择非常困难，常常面临无药可用的情况。从我们以前的研究结果表明山西医科大学第二医院鲍曼不动杆菌分离率和耐药率都 呈明显上升趋势，并且多重耐药现象严重，因此有必要对临床分离的多重耐药的鲍曼不动 杆菌菌株进行进一步的研究，本研究筛选山医二院２００７年７月到２００８年５月临床分离的 多重耐药鲍曼不动杆菌菌株，并对其耐药情况进行分析，旨在为本地区临床合理用药提供有力的依据。１材料与方法１．１材料 １．１．１菌株来源：连续收集山西医科大学附属第二医院２００７年７月到２００８年５月临床分离 的多重耐药鲍曼不动杆菌菌株，菌株主要来自呼吸科、神经内科、血液科、ＩＣＵ、消化科、骨科等８个科室，所有菌株均经生物梅里埃公司ＶＩＴＥＫ－２重新鉴定。 １．１．２主要试剂１．１．２．１药敏制片、抗菌药物标准品：亚胺培南（ＩＰＭ）、美罗培南（ＭＥＭ）、哌拉西林（ＰＩＰ）、 头孢他啶（ＣＡＺ）、头孢吡肟（ＦＥＰ）、头孢哌酮／舒巴坦（ＣＰＳ）、哌拉西林／他唑巴坦（ＰＴＣ）、庆 大霉素（ＧＥＮ）、环丙沙星（ＣＩＰ）、氨曲南（ＡＴＭ）、米诺环素（ＭＣ）、多粘菌素Ｅ（ＣＯ）十二种抗 菌药物的药敏纸片购自Ｏｘｉｏｄ公司，标准品购自卫生部药品检定所。 １．１．２．２培养基：ＭＨ培养基、ＬＢ肉汤购自ＢｉｏＭ６ｒｉｅｕｘ公司；其余常用化学制剂购于杭州华东医药股份有限公司试剂分公司。 １．１．２．３主要试剂的配制ＬＢ液体培养基：称取胰蛋白胨１０９、酵母提取物５９、氯化钠１０９，溶于９００ｍｌ去离子 水中，用ＮａＯＨ（１０ｒａＭ）调ｐＨ至７．２～７．４，再加去离子水至总体积１０００ｍｌ，高压灭菌２０ｍｉｎ。５山两医科大学硕士学位论文１．１．３主要仪器： ＶＩＴＥＫ细菌全自动鉴定仪为生物梅里埃公司产品；恒温摇床华达利ＨＺ．８８１ １Ｋ江苏大仓市科技器材厂；多点接种器３ＧＮｌ２０Ｌ型，购自Ｓａｋｕｍａ公司；电热恒温培养箱ＤＮＰ一９１６２型为上海精宏实验设备有限公司产品； 华利达空气恒温振荡器（ＨＺ．８８１ ｌＫ）为江苏省太仓市科教器材厂产品；．８６℃冰箱为Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司产品。 １．２方法１．２．１Ｋ－Ｂ纸片法：在ＭＨ平板上涂布Ｏ．５麦氏单位的待检细菌后，将药敏纸片平整地放置ｃｏｌｄ在平板上，３５℃培养１８－－一２４ｈ。读取抑菌坏直径。以大肠埃希菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａＡＴＣＣ２５９２２、鲍曼不动杆菌ＡＴＣＣｌ９６０６为质控菌。药敏判断标准参照美国临床实验室标准委员会（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ，ＣＬＳＩ２００７）。筛选多重耐药鲍曼不动杆菌菌株，菌株入选标准为Ｋ．Ｂ法至少有六种抗菌药物药敏试验耐药。 １．２．２琼脂稀释法测定ＭＩＣ值：用琼脂稀释法测定的１２种抗菌药物的ＭＩＣ值。整个试验过程参照ＣＬＳＩ Ｍ７一Ａ４ ２００７年版本进行：（１）按照公式【ｗ（ｇ）＝母液的浓度ｘ２０ｍｌ（ＭＨ平皿的体积）×母液的体积ｘ１０―６／纯度】称药，制备待测抗菌药物的母液，然后在蒸馏水中对倍稀释；（２）将含１０５ ＣＦＵ／ｍｌ的细菌肉汤接种到含倍比稀释抗菌素浓度的ＭＨ琼脂平板上（含５％ＮａＣｌ），３５℃培养２４－、一－２８小时，观察结果； （３）判读结果：对照平皿上生长良好的分离株方可读取ＭＩＣ，以抑制细菌生长的最低药物浓度为这种抗菌药物的ＭＩＣ值（１上ｇ／ｍ１）。 结果判断：首先读质控平板的ＭＩＣ，然后读取被检菌株测定的ＭＩＣ值；在前后二个 不同梯度浓度的抗生素ＭＨ琼脂平板上，细菌生长数量有８０―９０％的突然减少为结果终 点，即ＭＩＣ值。以大肠埃希菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＡＴＣＣ２５９２２、鲍曼不动杆菌ＡＴＣＣｌ９６０６ 为质控菌。药敏判断标准参照ＣＬＳＩ ２００７。结果用ＷＨＯＮＥＴ５．３软件分析。２结果２．１多重耐药鲍曼不动杆菌的筛选根据ＣＬＳｌ２００７鲍曼不动杆菌纸片法耐药判断标准，筛选到６０株多重耐药鲍曼不动杆菌。２．２１２种抗菌药物对多重耐药的鲍曼不动杆菌的抗菌活性６见表１．１，筛选的６０株多重山两医科大学硕士学位论文耐药鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别为４５．２％、３３．９％，含酶抑制剂的复 合制剂头孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／他唑巴坦的耐药率分别为３３．３％、５９．０％，米诺环素和 多粘菌素Ｅ分别为１６．１％、９．７％，其它抗菌药物的耐药率均在７０％以上。表１－１：１２种抗菌药物对６０株多重耐药鲍曼不动杆菌体外抗菌活性（耻ｇ／ｍ１）：３讨论近年来非发酵菌在临床分离中呈增加趋势，其中最主要菌种为不动杆菌属细菌和铜绿 假单胞菌，而不动杆菌中又以鲍曼不动杆菌最为常见。根据美国院内感染监测数据（ＮＮＩＳ） 以及中国院内感染病原菌调查显示【ｊＪ，不动杆菌属在医院内感染中占第４位，成为仅次于铜 绿假单胞菌的又一个重要的非发酵病原菌。在免疫力低下的患者中它可以引起严重的、甚 至致死性的感染，如呼吸机相关性肺炎、败血症、泌尿系统感染、脑膜炎等。２００３年３月 至２００４年４月在法国多家医院发生多重耐药鲍曼不动杆菌的克隆传播，波及２９０例患者，其中 ７３例（３３％）为感染，且大多数患者住过ＩＣＵ，３４例死亡，归因病死率高达５７％，而此克隆株仅对亚胺培南和黏菌素敏感【２６ｌ。在意大利某ＩＣＵ病房，多重耐药的鲍曼不动杆菌暴发流行后出现ＣＲＡＢ的暴发流行【２７１。而ＰＤＲＡ引起的感染，常常无药可用，病死率高。 对多重耐药的鲍曼不动杆菌只有少数抗菌药物可能有较高的敏感性：含酶抑制剂、多 粘菌素、米诺环素【２引。我院分离的多重耐药鲍曼不动杆菌对头孢哌酮／舒巴坦、哌拉西林／ 他唑巴坦两个含酶抑制剂耐药率分别为３２－３％、５９．０％，敏感率有２９．Ｏ％、４．９％。部分菌 株感染可以根据药敏结果选择敏感或中介的含酶抑制剂，单独或联合其它抗菌药物进行治７山西医科大学硕士学位论文疗。对米诺环素的耐药率为１６．１％，对多粘菌素Ｅ耐药率最低为９．７％。对于多重耐药的鲍曼不动杆菌引起的感染，尤其是严重感染一直是临床治疗的难题， 治疗失败率高，面对多重耐药鲍曼不动杆菌引起的重症感染的治疗有以下选择：选择含有 舒巴坦复合制剂或单独使用舒巴坦。因为舒巴坦是一种半合成的ｐ一内酰胺酶抑制剂，化学 结构、药代动力学特性与氨基青霉素相似。它能不可逆地结合脆弱类杆菌和鲍曼不动杆菌 中的ＰＢＰ２，对这些细菌有直接的杀菌活性【２９】。舒巴坦吸收后可分布在全身各个部位，也 可渗透到有炎症的脑脊液中，主要以原型经尿排出。本实验分离的６０株多重耐药的鲍曼不动杆菌对头孢哌酮／舒巴坦敏感率分别为２９．０％，而中介率达到３８．７％，部分菌株感染可以根据药敏结果选择敏感或中介的含舒巴坦制剂，单独或联合其它抗菌药物进行治疗。 多粘菌素主要作用于细菌细胞膜，使细胞内的重要物质外漏，为慢效杀菌剂【３们。很少 通过消化道吸收，主要通过肾脏排出，故肾功能不全者应减少剂量。多粘菌素类不良反应 明显，主要为肾毒性和神经毒性，但多粘菌素的抗菌作用强、不易产生耐药性，故当各种 革兰阴性杆菌对其他抗菌药物耐药或疗效不佳时，仍可作为选用药物。临床上仅选用多粘 菌素Ｂ和多粘菌素Ｅ。多粘菌素Ｅ在肾、肝、肺等组织中浓度比多粘菌素Ｂ高，不易通过无 炎症的血脑屏障【３¨。 本实验结果显示，多重耐药鲍曼不动杆菌而言，多粘菌素Ｅ耐药率最低为９．７％，对多重耐药菌株感染可以选用该药治疗，有治疗成功的报道，但该药肾毒性大，对重症患者特别是肾功能不全患者要在密切监测血肌酐、尿素氮水平。 同样四环素类也可用于治疗鲍曼不动杆菌耐药株引起的感染。Ｗｏｏｄ等报道用强力霉 素和米诺环素治疗多重耐药鲍曼不动杆菌引起的呼吸机相关性肺炎７例，结果有６例取得 了成功【３２】。本实验结果发现，我院多重耐药鲍曼不动杆菌对米诺环素耐药率为１６．２％，对 于肝功能正常的患者，多重耐药的不动杆菌引起的感染也可以单独选用此药或者与其他抗菌药物联合使用来进行治疗。８山西医科大学硕士学位论文第二部分：多重耐药鲍曼不动杆菌同源性研究在第二部分的研究中，２００７年７月．２００８年５月从我院临床分离的鲍曼不动杆菌中筛 选的６０株多重耐药的菌株占同期鲍曼不动杆菌分离率３４％，这提示可能有院内的克隆传 播。研究发现，２０００年的一家医院内流行一个多重耐药鲍曼鲍曼不动杆菌克隆２００４年已 经播散到４０家医院。且英国流行的ＣＲＡＢ菌株主要是３个克隆株在全国范围内的广泛播 散【３”。并且通过欧洲各国的共同研究已经证实有４个克隆的多重耐药鲍曼不动杆菌在欧洲大陆多个国家之间传播和流行【３４】。 脉冲场凝胶电泳分型（ｐｕｌｓｅｄ．ｆｉｅｌｄｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ＰＦＧＥ）是目前国际上公认的院内获得性感染病原菌同源性分析的金标准。ＰＦＧＥ建立在细菌染色体ＤＮＡ的酶切片断长度多态。｜生（ＲＦＬＰｓ）基础之上。通过脉冲场电泳技术把大的酶切ＤＮＡ片断分离，从而通过对ＤＮＡ 条带图谱的比较确定细菌的分型。Ｔｅｎｏｖｅｒ等【３５１人建立的标准目前被广泛的应用于世界各 地的同源性分析。这个标准将３条以下（包括３条）ＤＮＡ条带差异的菌株界定为同一个克 隆不同亚种的细菌，而超过３条则为不同克隆的菌株。一般认为菌株进化过程中一次突变 可能会产生３条酶切条带的差异，两次突变则可能带来４―６条酶切条带的差异，超过７ 条条带的差异则需要三次或以上的染色体ＤＮＡ变异。一系列的研究表明，在一次严格限 制范围和时间（１―３个月）的院内流行当中，发生一次不能预知的进而影响酶切图谱的突变是常见的。本研究利用脉冲场凝胶电泳对我院多重耐药鲍曼不动杆菌流行情况、克隆分型进行了研究，旨在为多重耐药的鲍曼不动杆菌的流行控制提供基础。１材料与方法１．１材料１．１．１菌株来源：连续收集山西医科大学附属第二医院２００７年７月到２００８年５月临床分 离的多重耐药鲍曼不动杆菌６０株。１．１．２．２培基养：ＭＨ培养基、ＭＨ肉汤、ＢＨＩ肉汤购于ＢｉｏＭ６ｒｉｅｕｘ公司；其余常用化学 试剂购于杭州华东医药股份有限公司试剂分公司。 １．１．２．３分子生物学制剂： 蛋白酶Ｋ购于ＭＥＲＫ公司产品； 限制性内切酶ＡｐａＩ购自Ｔａｋａｒａ大连公司； 脉冲场凝胶电泳ｋＬａｄｄｅｒ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ购于Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司；低熔点琼脂糖、高密度琼脂糖（ＰＦＧＥ级）、苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）购于Ｓａｎｇｏｎ公司； 琼脂糖、无水氯化钙、氨苄西林、溴乙啶、溴酚蓝等常用分子生物学试剂购于上海Ｓａｎｇｏｎ公司；９山西医科大学硕士学位论文其余常用化学试剂购于杭州华东医药股份有限公司试剂分公司。１．１．４主要试剂的配制ＬＢ液体培养基：称取胰蛋白胨１０９、酵母提取物５９、氯化钠１０９，溶于９００ｍｌ去离子 水中，用ＮａＯＨ（１０ｍＭ）调ｐＨ至７．２－－一７．４，再加去离子水至总体积１０００ｍｌ，高压灭菌２０ｒａｉｎ。５ｘＴＢＥ缓冲液：称取Ｔｒｉｓ ５４９、硼酸２７．５９，加入Ｏ．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．Ｏ）２０ｍｌ，定容 至１０００ｍｌ。１０ｘＴＥ缓冲液：称取１２．１９佻‘Ｃｌ、１８．６９ ＥＤＴＡ后，加入双蒸水至１０００ｍｌ，调ｐＨ至８．４，高压灭菌。ＥＣ缓冲液：称取０．７３９５９Ｔｒｉｓ?Ｃｌ、２９．２９ ＮａＣＩ、３７．２９ ＥＤＴＡ、５９Ｂｒｉｊ－５８、２９去氧胆酸盐、Ｓａｒｋｏｓｙｌ后，加入双蒸水至１０００ｍｌ，调ｐＨ至８．４，高压灭菌。 蛋白酶Ｋ裂解液：含１００ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ＰＨ８．Ｏ）、１０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ?ＣＩ（ＰＨ８．Ｏ）和１％十二烷基肌氨酸钠盐（Ｓａｒｋｏｓｙｌ），高压灭菌。ＰＭＳＦ：每ｌｍｇ溶解于４００１ａｌ异丙醇，临用时用ｌｘＴＥｂｕｆｆｅｒ稀释成１ ７４９９／ｍｌ； １．１．５主要仪器： 脉冲场电泳仪为Ｂｉｏ―Ｒａｄ公司ＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ 台式冷冻高速离心机为Ｓｏｒｖａｌｌ公司产品； ．８６℃冰箱为Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司产品。ＸＡＳｙｓｔｅｍ型产品；１．２方法多重耐药鲍曼不动杆菌同源性分析采用脉冲场凝胶电泳（ＰＦＧＥ），流程示意图见图２．１：１．２．１细菌的包埋（１）将细菌接种在２ｍｌ ＬＢ液体培养基中，３５。Ｃ振荡过夜。（２）８０００ｒｐｍ离心２ｒａｉｎ，沉淀用４００Ｉ＿ｔｌ ＥＣ缓冲液混匀，使细菌浊度约为４ ＭａｃＦａｒｒａｎｄ。（３）取３００ｋｔｌ菌液加入已融化的等体积的２％低熔点胶，混匀后迅速倒入模具，每一样 本制作４￣５块胶块，每块的体积大约是１００｝ｔｌ，４０Ｃ冰箱中凝固约３０ｍｉｎ。１．２．３．２蛋白酶Ｋ消化（１）将胶块放入ｌｍｌ蛋白酶Ｋ裂解液，加入蛋白酶Ｋ，使其终浓度为０．８ｍｇ／ｍＬ，５００Ｃ水浴４８ｈ。（２）弃去液体，以Ｉ＊ＴＥ缓冲液清洗３０分钟。（３）弃去Ｉ＊ＴＥ缓冲液，加入８００１ａｌ ＰＭＳＦ溶液，室温下处理３０ｒａｉｎ。 （４）弃去ＰＭＳＦ，再以ｌ牛ＴＥ缓冲液清洗至少３次，每次３０分钟。１０山两医科大学硕士学位论文１．２．３．３内切酶对细菌ＤＮＡ的消化 （１）为洗去上述反应液中成分，用１×酶切缓冲液冲洗４＂Ｃ，３０ｍｉｎ。（２）配置酶切体系：１０ｘＳｍａＩ内切酶缓冲液１２｝ｔＬ，牛血清白蛋白（ＢＳＡ）１２此，Ａｐａ／内切酶４ｐ，Ｌ，加入去离子水至１２０１ａＬ后，３７。Ｃ酶切过夜。１．２．３．４加样及电泳（１）用０．５ｘＴＢＥ缓冲液配制ｌ％的琼脂糖胶（ＰＦＧＥ级），把消化好的包埋有细菌的胶 块小心放入梳孔中，在空隙中加入融化的琼脂糖凝胶密封； （２）ＰＦＧＥ电泳：６Ｖ／ｃｍ，脉冲时间５ｓ至２０ｓ，１４０Ｃ，Ｏ．５ｘＴＢＥ，电场角度１２００，总时间为２２ｈ： （３）电泳结束后用０．２５ｍｇ／Ｌ ＥＢ液染色３０ｍｉｎ，蒸馏水清洗３０ｍｉｎ。然后紫外线透射仪 下观察结果。１．２．３．５结果判定ＰＦＧＥ条带的解释：通过目测判定其带型之间的关系，按照以下原则：①大多数流 行病学相关带型大小和数量相近的菌株被认为是同一菌株（主流型），称为Ａ型；②由 于突变、插入、缺失或倒置的遗传改变在电泳带型上与主要表型有３个或３个以下差 别的菌株被认为是主要型中的亚型，分别称为Ａ１、Ａ２和Ａ３；⑧带型中有４或４个以 上不同之处不能用１次或２次遗传变化解释的，被认为是不同的菌株，分别称为Ｂ、Ｃ和Ｄ等【３６１。将培养过夜的细菌用低熔点胶灌模』上 蛋白酶Ｋ消化４８ｈ七ｊ７ｌ Ｉ限制性内切酶Ａｐａｌ ３７℃酶切１２ｈｎ使用ＣＨＥＦ ＭＡＰＰＥＲＴＭ脉冲电泳仪，１４℃，１２０。，６Ｖ／ｃｍ，５～２０ｓ梯度电泳２２ｈ』土ＥＢ染色过夜，拍照图２－１．多重耐药鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳实验流程示意图ｍ西医科大学酿±学位沧文２结果６０株菌株可分为５个克隆株，其中Ａ、Ｂ为主要克隆株。Ａ克隆有３个亚型共２８株，Ｂ克隆有１个亚型共９株，Ｃ克隆有２个亚型韭４株，Ｄ、Ｅ各有３和２株，另外还有 １４株散发茁株。见图２－２。图２―２：多重耐药鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳示意图４９．６０．２ｌ为Ａ克隆：５．８，９为Ｂ兜席，４３，“为Ｃ克陆２３为艘艘茁株：Ｍ为ＤＮＡｍａｒｋｅｒ．）３讨论近几年来．多重耐药鲍曼不动杆菌已经在全球各地出现流行甚至造成了爆发性的流行．并且伴随着耐药性的不断增强。世界各地相继报道了多重耐药鲍曼不动杆蔺的流行： 欧洲、北美、阿根廷、巴西、中国大陆、中国台湾、中国香港、日本、韩国，甚至偏远的西太平洋太西地岛等㈣ｐ７１．Ｉ＇ｔ３１这些多重耐药鲍曼不动杆菌常可引起整个城市、整个国家的流行，甚至在欧洲不同国家『日Ｊ广泛传播１３７】?［４４Ｆ［“１。 本研究首次利用脉冲场凝胶电泳技术对我院多重耐药鲍曼不动杆菌分子流行病学研 究。６０株蔺株可分为５个克隆株，其中Ａ、Ｂ为主要克隆株。克隆株在病房内、病房『自Ｊ传 播成为我院鲍曼４；动丰Ｔ菌苗株不断增加，分离率和耐曲率上升的主要原因。因此，控制院 内感染至关重要。医护人员勤沈手、做好无茼操作、冰染或者定植病人的及时发现和隔离山西医科大学硕士学位论文等对控制流行十分必要。目前多重耐药鲍曼不动杆菌尤其是ＣＲＡＢ在我国各地的广泛流行，给临床抗感染治疗 带来了严峻的问题。在当前没有特效抗菌药物可供临床选择的情况下，通过合理的流行病 学干预控制已成为我国迫切需要解决的实际问题。我们通过分子生物学的方法对我院多重 耐药的鲍曼不动杆菌进行系统全面的同源性研究，阐明其流行现状，为科学制定流行病学措施提供依据。山西医科大学硕十学位论文第三部分：多重耐药鲍曼不动杆菌主要１３一内酰胺酶基因型及同源性 研究不动杆菌属强大的环境生存能力和广泛的耐药性决定了其成为越来越重要的院内获得性感染的病原菌。随着多重耐药鲍曼不动杆菌在全球出现的流行，其耐药性也在不断增 强。不动杆菌属的耐药机制复杂，包括产生灭活酶，使抗生素失活；改变作用靶部位，从 而逃避抗菌药物的作用：质粒介导的种问传递和染色体介导的垂直传递产生的耐药；代谢途 径的改变等。介导鲍曼不动杆菌对ｐ．内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制包括【１】：产生能分 解药物的ｐ．内酰胺酶；青霉素结合蛋白的改变；外膜孔蛋白结构和数量的改变，降低了细 菌外膜药物的通透性；外排泵的激活，进一步降低了细菌胞内抗生素的浓度。 人们从多重耐药的不动杆菌中发现的多种ｐ内酰胺酶，包括Ａｍｂｌｅｒ分子分类的Ａ、Ｂ、 Ｃ和Ｄ类。其中Ａ、Ｃ、Ｄ类为丝氨酸酶，Ｂ类为金属酶。鲍曼不动杆菌中最常见的ｐ．内 酰胺酶为ＴＥＭ．１。而Ａ类超广谱酶（ＥＳＢＬｓ）最近也在鲍曼不动杆菌中发现。ＰＥＲ－１型超 广谱酶在鲍曼不动杆菌中最常见，已经有报道在土耳其和韩国出现流行，在法国、比利时、 玻利维亚、美国和我国也有报道【４】－【８１。由于鲍曼不动杆菌中ＥＳＢＬｓ的检测并没有标准化的 方法，并且常常可能受到染色体介导头孢菌素酶的影响，ＥＳＢＬｓ在鲍曼不动杆菌中真实的 分布情况较难确定。金属酶在鲍曼不动杆菌中的出现和增加是一个危险的信号。金属酶能 够水解包括碳青霉烯类抗生素在内的ｐ一内酰胺类抗生素，仅对氨曲南没有水解能力【１３】。由 于质粒介导耐药基因可以在同种或不同种属细菌间广泛播散，给临床抗菌治疗带来困难，己引起广泛重视。本研究分析了山医大二院多重耐药的鲍曼不动杆菌Ｄ一内酰胺酶的表型和基因型，并对基因型进行定位研究，并分析了各基因型在各克隆株之间的分布情况。１材料与方法１．１材料１．１．１菌株来源：连续收集山西医科大学附属第二医院２００７年７月到２００８年５月临床分 离的多重耐药鲍曼不动杆菌６０株，详见第二部分相应内容。 １．１．２主要试剂：１．１．２．１培基养：ＭＨ培养基、ＭＩ－Ｉ肉汤、ＢＨＩ肉汤、药敏制片购于ＢｉｏＭ６ｒｉｅｕｘ公司；其余常用化学试剂购于杭州华东医药股份有限公司试剂分公司。１４山西医科大学硕士学位论文１．１．２．２分子生物学制剂： Ｔａｑ酶、高保真Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ、限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＤＮＡ分子量标记物购于Ｔａｋａｒａ 公司；ｐＧＥＭ―Ｔｅａｓｙ载体连接试剂盒、限制性内切酶ＳｍａＩ购于Ｐｒｏｍｅｇａ公司； ＰＣＲ产物纯化及切胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购于上海申能博彩生物科技有限公司；琼脂糖、无水氯化钙、氨苄西林、溴乙啶、溴酚蓝等常用分子生物学试剂购予上海Ｓａｒｇｏｎ公司；Ｐｒｉｍｅ－ａ－Ｇｅｎｅ ＬａｂｅｌｉｎｇＳｙｓｔｅｍ为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品，【Ⅱ．３３Ｐ］一ｄＣＴＰ购白美国杜邦公司，尼龙膜购自ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ公司：其余常用化学试剂购于杭州华东医药股份有限公司试剂分公司。 １．１．２．３药物亚胺培南、美罗培南、头孢他啶、利福平９种抗菌药物为浙江省药品检定所 购买的标准品。ＥＤＴＡ、２．巯基丙酸购于浙江省药品检定所。 １．１．３主要试剂的配制 ＬＢ液体培养基：称取胰蛋白胨１０９、酵母提取物５９、氯化钠１０９，溶于９００ｍｌ去离子水中，用ＮａＯＨ（１０ｍＭ）调ｐＨ至７．２－－－，７．４，再加去离子水至总体积１０００ｍｌ，高压灭菌２０ｍｉｎ。５ｘＴＢＥ缓冲液：称取Ｔｒｉｓ ５４９、硼酸２７．５９，加入Ｏ．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．Ｏ）２０ｍｌ，定容至１０００ｍｌ。６×上样缓冲液：０．２５％溴酚蓝，４０％（ｗ／ｖ）蔗糖水溶液。溴化乙啶（ＥＢ）贮存液：配成终浓度１０ｍｇ／ｍＬ 氨苄西林（Ａｍｐ）贮存液：配成１０ｍｇ／ｍＬ水溶液，－２０＂Ｃ保存备用。 含Ａｍｐ的麦康凯培养基：称取麦凯康（不含结晶紫）琼脂粉１０．２９，加入去离子水至２００ｍｌ，高压灭菌后冷却至６０＂Ｃ左右，加入ｌ ００１ａｌＡｍｐ贮存液，使终浓度为５０Ｈ∥Ｍ１；０．０５ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２溶液：称取０．２８９ＣａＣｌ２（无水，分析纯），溶于５０ｍｌ重蒸水中，定容至１００ｍｌ，高压灭菌：含１５％甘油的Ｏ．０５ｍｏｌ／ＬＣａＣｈ溶液：称取０．２８９ＣａＣｈ（无水，分析纯），溶于５０ｍｌ重蒸水中，加入１５ｍｌ甘油，定容至ｌＯＯｍｌ，高压灭菌。１．１．４主要仪器： 电热恒温培养箱ＤＮＰ．９１６２型为上海精宏实验设备有限公司产品；１５山西医科大学硕士学位论文华利达空气恒温振荡器（ＨＺ．８８１１Ｋ）为江苏省太仓市科教器材厂产品；台式冷冻高速离心机为Ｓｏｒｖａｌｌ公司产品； ．８６℃冰箱为Ｆｏｒｍａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司产品； 核酸电泳仪为Ｂｉｏｒａｄ公司产品；Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ电泳仪为Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司产品；脉冲场电泳仪为Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司ＣＨＥＦ Ｍａｐｐｅｒ ＰＣＲ扩增仪由ＰＥ公司生产；ＸＡ Ｓｙｓｔｅｍ型产品；水平电泳仪、紫外线透射仪和ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ电泳仪为瑞典Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司产品； 自动制冰机购于意大利的ＳＣＯＴＳＭＡＮ公司；ＴＹＰＯＯＮ８６００扫描仪，ＵＶ交联仪均为瑞典Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ公司产品；１．２方法 １．２．１金属酶筛选试验：挑２４小时ＭＨ琼脂平皿上的纯菌落制备菌悬液，比浊至０．５个麦氏单位；无菌拭子 浸入菌悬液中，在管壁上挤干，均匀涂布整个Ｍｕｅｌｌｅｒ－Ｈｉｎｔｏｎ平皿表面；在ＭＨ琼脂平板 中间贴头孢他啶（ＣＡＺ）药敏纸片，距纸片３ｃｍ贴一空白纸片，加２ｐｌ ２．巯基丙酸原液， ３５℃培养过夜，若靠近２．巯基丙酸侧ＣＡＺ抑菌环有扩大者，为产金属酶株。 １．２．２三维实验： 参照Ｃｏｕｄｏｍｌ４７】推荐及吴伟元等【４８１改良的三维实验方法并作了部分改进，进｛ｙＥＳＢＬ和ＡｍｐＣ酶的检测。（１）酶粗提物制备。反复冻融法制备酶粗提物。挑取ＭＨ琼脂平皿过夜培养的疑产ｐ．内酰胺酶菌株数个菌落加入１５ｍ１胰酶消化大豆肉汤中，３５＂Ｃ恒温摇床２００ｒｐｍ孵育１２．１６ｈ，４０００ｒｐｍ，４＝Ｃ离一Ｌ，３０ｍｉｎ，弃上清液，沉淀ｑｊＤｎＡ．０．０６ｍ０１／Ｌ ＰＢＳ（ｐＨ ７．０）１．５ｍｌ，旋涡混匀后于．８０＂（２和３７＂Ｃ各３０ｍｉｎ反复冻融６次，１００００ｒｐｍ，４＝Ｃ离一Ｉ）３０ｍｉｎ，将上清液经细菌过滤器（孔径为０．２２ｐｍ）过滤，滤液经Ｍ．Ｈ琼脂平板常规细菌培养阴性者，即为酶粗提物，置．２０℃冻存备用。（２）三维试验 将Ｏ．５麦氏单位大肠埃希菌ＡＴＣＣ２５９２２菌液均匀涂布于ＭＨ琼脂平皿，取一３０嵋ＣＲＯ 纸片贴于平皿中心，用无菌的自制打孔器，直径５ｍｍ，在距离ＣＲＯ纸片边缘５ｍｍ左右处对 称打两孔，用微量加样器在一孔加入酶粗提物６０ ｐｌ，另孔加入酶粗提物５０ｐｌ＋２０ｍｍｏｌ／ＬＳＵＢｌ０ｐ１，避免加入的酶液溢出孔。３５。Ｃ温箱培养过夜。结果如酶粗提物中含有ＥＳＢＬ酶，１６山两医科大学硕士学位论文则在加酶粗提物的孔与抑菌圈交接处由于ＥＳＢＬ酶水解ＣＲＯ，故出现扩大的长菌区，又由于ＥＳＢＬ酶活性可被ＳＵＢ抑制，所以在加酶粗提物＋ＳＵＢ混合液的孔与抑菌圈交接处不出现扩大的长菌区，为三维试验阳性。以产ＥＳＢＬｓ标准株Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｍａｅ ＣＦｌ０４（产ＴＥＭ．３）作为阳性 对照。。操作方法基本同上用ＦＯＸ纸片代替ＣＲＯ纸片，并在距离ＦＯＸ纸片边缘５ｍｍ左右处对 称打两孔，用微量加样器在一孔加入酶粗提物６０乩另孔加入酶粗提物５０ｐｌ＋２０ｍｍｏｌ／ＬＣＬ０１０ｐｌ，避免加入的酶液溢出孔。结果如酶粗提物中含有ＡｍｐＣ酶，则在加酶粗提物的孔与抑菌圈交接处由于ＡｍｐＣ酶水解ＦＯＸ．故出现扩大的长菌区，又由于ＡｍｐＣ酶活性可被ＣＬＯ抑制，所以在加酶粗提物＋ＣＬＯ混合液的孔与抑菌圈交接处不出现扩大的长菌区，为ＦＯＸ－－－＂维试验阳性。如果酶粗提物中无ＡｍｐＣ酶，则两个孔与抑菌圈交接处均未出现扩大的细菌生长区，为ＦＯＸ三维试验阴性。对同产ＥＳＢＬｓ和ＡｍｐＣ酶的菌株，操作方法基本同上，对产ＥＳＢＬｓ菌株的酶粗提物 进行ＦＯＸ三维试验，挖出三个孔，分别加入酶粗提物６０ｐｌ，酶粗提物５０ｐｌ＋２０ｍｍｏＦＬ １０ｐｌ，酶粗提物５０｝ｔｌ＋２０ｍｍ０１／ＬＣＬＯ １０ｐｌ＋２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＳＵＢ ＣＬＯ１０Ｉ．ｔｌ。如果酶粗提物中除含ＥＳＢＬｓ外还含有ＡｍｐＣ酶，则在加入酶粗提物、酶粗提物＋ＣＬＯ的两个孔与抑菌圈交接处 均出现扩大的长菌区，而在加入酶粗提物十ＣＬＯ十ＳＵＢ孔与抑菌圈交接处不出现扩大的 长菌区，这是由于ＡｍｐＣ酶被ＣＬＯ抑制、ＥＳＢＬｓ被ＳＵＢ抑制，为ＦＯＸ三维试验阳性。１．２．３ＰＣＲ法扩增主要ｐ一内酰胺酶编码基因：采用ＰＣＲ法扩增主要的ｐ．内酰胺酶编码基因．包括：（｛）ＥＳＢＬｓ基因：ＴＥＭ型、ＳＨＶ型、ＰＥＲ型、ＣＴＸ．Ｍ．１型、ＣＴＸ．Ｍ．９型、ＧＥＳ 型、ＶＥＢ型；②染色体携带的ＡｒｎｐＣ酶基因：ＡＤＣ：③碳青霉烯酶基因：ＯＸＡ．２３型、ＯＸＡ－２４型、ＯＸＡ．５８型、ＩＭＰ型、ＶＩＭ型、ＳＩＭ―ｌ。 １．２．３．１采用煮沸法提取细菌ＤＮＡ：细菌悬浮于双蒸水中煮沸１０分钟，３，８００转／分钟离心１０分钟，吸取上清。１．２．３．２ １．２．４．３ＰＣＲ引物的设计：引物合成序列见表３．１。ＰＣＲ产物的连接：根据Ｐｒｏｍｅｇａ公司ｐＧＥＭ―Ｔｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ试剂盒说明书进行。连接反应体系为５１．ｔｌ ２ｘ连接缓冲液；３ｐｌ纯化ＰＣＲ产物；ｌｐｌ ｐＧＥＭ―Ｔｅａｓｙ载体；ｌｐｌ Ｔ４连接酶，反应总体积为ｌＯｐｌ，４０Ｃ连接过夜。 １．２．４．４转化： （１）从一７０。Ｃ冰箱中取２００ｐｌ感受态细胞悬液，冰上溶解； （２）加入５ｐｌ连接反应产物，轻轻摇匀，冰上放置ｌｈ；１７山西医科大学硕士学位论文（３）４２℃水浴热击９０ｓ，热击后迅速放置在冰上冷却５ｍｉｎ； （４）向管中加入ｌｍｌ ＬＢ液体培养基，混匀后３７。Ｃ振荡培养１ｈ；（５）菌液３８００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，倒去上清，将细菌沉淀在剩余的液体（约１００Ｉ＿ｔ１）中轻轻 混匀，用灭菌的Ｌ型玻棒均匀涂布于含氨苄西林的麦康凯平板上，３５℃培养过夜。表４―１：ＰＣＲ引物序列Ｈ帕酬１刀：Ｐｒｉｍｅｒｓ ＰＥＲＰｌ ＰＥＲＰ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ５’．ＡＡ Ｔ，兀’ＧＧＧＣＴＴＡＧＧＧＣＡＧＡＡ．３’ ５ ７．ＡＴＧＡＡＴＧＴＣＡＴＩ＇ＡＴＡＡＡＡＧＣ．３’ ５’．ＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＧ．３７ＴＥＭ Ｐｌ ＴＥＭＰ２ＳＨＶＰｌ ＳＨＶＰ２５’一ＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣ．３’ ５ ７．ＧＣＣＴｒＴＡＴＣＧＧＣＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＧ．３’ ５’．ＴｒＡＧＣＧＴＴＧＣＣＡＧＴＧＣＴＣＧＡＴＣＡ．３’ ５０－ＣＡＧＣＧＣＴｒＴＩ＇ＧＣＣＧＴＣＴＡＡＧ一３０ＣＴＸ．Ｍ．１ Ｐｌ ＣＴＸ．Ｍ．１ Ｐ２ＧＥＳ Ｐｌ ＧＥＳ Ｐ２ ＶＥＢ Ｐ１ ＶＥＢ Ｐ２ ＯＸＡ一２３ Ｐ１ ＯＸＡ．２３ Ｐ２ ＡＤＣｌ．７ ＰｌＧＧＣＣＣＡＴＧＧＴＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＣ－３０（５０ＡＴＧＣＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＣＧＣＡＣ Ｃ１＝ＡＴＴＩ＇ＧＴＣＣＧＴＧＣＴＣＡＧＧ ＧＣＧＧＴＡ久ｒｒｒ＇ＡＡＣＣＡＧＡ ＧＣＣＴＡＴＧＡＧＣＣＡＧＴＧＴＴ ＧＡＴＧＴＧＴＣＡＴＡＧＴＡＴＴＣＧＴＣＧＴ ＴＣＡＣＡＡＣＡＡＣＴＡＡＡＡＧＣＡＣＴＧＴ ＴＣＴＣＴＴＴＴＧＡＣＧＡＴＡＣＧＣＣＴＩＧＧ ＧＴＧＧＡＴＴｒＧＡＣＧＣＣＧＴＡＴＧＣＴ ＣＴＧＡＧＴＧＧＴＩｖｒ－ＧＴＡＴＧＧＣＣｒｒＴＣＧ ＧＧＴＧＧＴｒｒＴＣＣＧＣＴＡＣＡＧ Ｔ．ｒＴＣＣＴｐｌｕｓＧＧ）ＡＤＣｌ．７ Ｐ２ ＡＤＣ８ ＰｌＡＤＣ８ Ｐ２ＩＭＰＰｌＩＭＰＰ２ ＶＩＭＰｌ ＶＩＭＰ２ ＳＩＭ－１ Ｐｌ ＳＩＭ．１ Ｐ２Ｃ１’ＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴ℃Ｔ兀’ＧＡＡＣＣＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＴ．ＡＣＣＡＴ ＡＴＴＧＧＴＣＴＡＴＴＩ．ＧＡＣＣＧＣＧＴＣ ＴＧＣｌ’ＡＣＴＣＡＡＣＧＡＣＴＧＡＧＣＧＴＡＡＴＧＧＣＣＴＧＴＴＣＣＣＡｒＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＧＡＴＴＣＧＧＣＡＴＣＧ１．２．４．５酶切鉴定：（１）在含氨苄西林的麦康凯平板上挑取白色菌落，分别接种在５ｍｌ含氨苄西林的ＬＢ液体培养基中，３５℃培养过夜； （２）用质粒抽提试剂盒提取细菌质粒；１８山西医科大学硕十学位论文（３）将质粒用ＥｃｏＲ Ｉ酶切鉴定。酶切体系为５ｐｌ质粒ＤＮＡ；２ｐｌ １０ｘ缓冲液；１ｐ１ １２１ａｌ双蒸水。总体积为２０｝ｔｌ，３７０Ｃ水浴２ｈ：ＥｃｏＲ Ｉ；（４）１％琼脂糖电泳后紫外线透射仪下观察结果，分析鉴定插入片段。１．２．５核苷酸序列测定：将鉴定后确定含重组质粒的克隆菌接种在含氨苄西林的麦康凯平板上，送至上海博亚公司进行双链测序，序列结果经ＤＮＡｓｉｓｔ软件处理后在ＧｅｎＢａｎｋ网上 查询。ＰＣＲ产物的纯化、克隆和测序ＰＣＲ扩增产物用ＰＣＲ产物纯化试剂盒纯化目的ＤＮＡ， 取３９ｌ与ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体连接。连接产物转化至大肠埃希菌ＤＨ５ａ感受态细胞，用含 ５０ｐｇ／ｍｌ的氨苄西林麦康凯平板筛选。挑取白色菌落，ＰＣＲ鉴定后采用Ｓａｎｇｅｒ末端终止法，用ＡＢＩ ３７７型自动测序仪进行双向测序。结果在ＧｅｎＢａｎｋ网上查询。１．２．６接合试验： １．２．６．１预试验： （１）制备含不同抗生素的ＭＨ培养基，包括阿米卡星（ＡＭＫ，１２８｝ｔｇ／ｍ１）、利福平（Ｒｉｆ，５１２Ｉ，ｔｇ／ｍ１）、』ＷＫｌ２８＋Ｒｉｆ５１２的ＭＨ平皿；（２）供体菌和受体菌（利福平耐药ＥＣ６００）的单个菌落分别传种至ＡＭＫｌ２８、Ｒｉｆ５１２、ＡＭＫｌ２８＋Ｒｉｆ５１２的ＭＨ平皿，３５℃，孵育过夜；（３）供体菌、受体菌只有选择符合下列生长特性时，才能进行接合试验（具体见表３．２）。 表３．２： 接合实验预试验结果１．２．６．２接合试验（肉汤法）（１）将供体菌和受体菌分别传种于含叠氮钠５１２ｐｇ／ｍｌ、利福平５１２ｐｇ／ｍｌ的血平皿上， ３５℃孵育过夜；（２）挑取单个纯菌落转种至２０ｍｌ ＬＢ液体培养基中，３５。Ｃ，振荡（２００ｒｐｍ）孵育过夜；（３）分别将供体菌和受体菌在ＬＢ液体培养基中１：１００稀释，３５。Ｃ，振荡（２００ｒｐｍ）孵育，３．４ｈ至生长对数期；（４）将５ｍｌ供体菌和５ｍｌ受体菌菌液等量混合，３５℃继续孵育２ｈ（避免摇动）。原供体菌和受体菌办同时孵育以作对照。（５）取１００Ｉ．ｔｌ混合菌液（原液及适当稀释液１：１０）均匀涂布于含抗生素利福平（Ｒｉｆ５１２）１９山西医科大学硕士学位论文的筛选ＭＨ平皿中，每份菌液每个浓度分别接种２块平皿。３５℃孵育过夜；（６）同时，取１００Ｉｔｌ供体菌和受体菌菌液分别涂布在含单药利福平的筛选ＭＨ平皿上 （Ｒｉｆ５１２），作为对照，３５℃孵育过夜。 （７）读取结果。生长对照合格者，方能在含利福平平皿中挑选接合子。只有在含利福 平的ＭＨ平皿上生长、不发酵乳糖，经鉴定为大肠埃希菌的才是接合子。１．２．７质粒ＤＮＡ的提取：采用ＱｉａｇｅｎＰｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉｋｉｔ（德国Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ）提取质粒。（１）试验前先将Ｐ３置于冰上，ＱＦ ５０＂Ｃ预热；（２）将单个菌落接种于５０ｍｌ含２１．ｔｇ／ｍｌ亚胺培南的ＬＢ肉汤中，３５＂Ｃ，２００ｒｐｍ振荡，孵育过夜；（３）４。Ｃ，６０００ｇ离心１５ｍｉｎ收集菌体细胞；（４）加入４ｍ｜Ｂｕｆｆｅｒ Ｐ１重悬细胞沉淀，振荡混匀；（５）加４ｍｌ的Ｂｕｆｆｅｒ Ｐ２，颠倒４－６次轻柔混匀后，室温孵育５ ｍｉｎ。在孵育期间，按 说明书准备ＱＩＡｆｉｌｔｅｒＣａｒｔｒｉｄｇｅ； Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，（６）加４ｍｌ的Ｂｕｆｆｅｒ Ｐ３，颠倒４－６次轻柔混匀后，将裂解物倒入ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ 室温孵育１０ ｍｉｎ； （７）用４ｍｌ ＱＢＴ平衡ＱＩＡＧＥＮ．ｔｉｐ，重力作用下使其漏过柱子；（８）移去ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ的盖子，将活塞插入Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，将细胞裂解液过滤至已平衡好的ＱＩＡＧＥＮ．ｔｉｐ，重力作用下使清亮的裂解物自然通过ＱＩＡＧＥＮ－ｔｉｐ的树脂；（９）用２ｘ１０ｍｌ的Ｂｕｆｆｅｒ ＱＣ洗涤ＱＩＡＯＥＮ―ｔｉｐ， （１０）采用５ｍｌ ＱＦ洗脱树脂上的ＤＮＡ，并收集至１个新的５０ｍｌ的离心管中； （１１）加３．５ｍｌ异丙醇沉淀ＤＮＡ，混合后，１５０００９，４。Ｃ，离心３０ｍｉｎ。小心倒出上清液； （１２）采用７０％的乙醇洗ＤＮＡ沉淀，１５０００９，４０ｃ，离心１０ｍｉｒａ （１３）空气中干燥１０ｍｉｎ，加８０Ｉ．ｔｌ Ｔｒｉｓ―Ｃｌ（ｐｎ ８．５）溶解ＤＮＡ，一２０ ｏＣ保存；（１４）取５ｕｌ质粒提取物在Ｏ．５ＸＴＢＥ缓冲液，Ｏ．７％的琼脂糖中电泳６０ｍｉｎ（１１０Ｖ），然后在０．５Ｉ，ｔｇ／ｍｌ的ＥＢ中染色３０分钟，于紫外灯下检查质粒携带情况及大小，结果照相保存。 １．２．８电转化 （１）电转化感受态细胞制备：大肠埃希菌ＤＨＳｏｔ３７。Ｃ孵化过夜，１：１００振荡培养至ＯＤ为０．５一Ｏ．６。冰上放置５―１０ｍｉｎ，４＂０离心５０００９ｘ１０ ｍｉｎ弃上清，加５ｍｌ ０＿４。Ｃ无菌去离２ｎ■西医科丈学硕士学位论文子冰水，洗涤细胞离心５０００９ｘ１０ ｍｉｎ，加３０ｍｌ ０－４＂Ｃ无菌去离子冰水．离心５０００９ｘ２０ｍｉｎ弃卜清．将悬浮液混匀装入２ｍｌＢＦ管，两管合成一管．菌去离子冰水４００ｕｌ：５０００９离心×１０ ｒａｉｎ．每管加入无（２）电转化ｌｕｌ质粒加入２０ｕｌ电转化感受态细胞，吸取１００ｕｌ加入转化杯。１ｉｎｔｏ转 化，电转条件：ｌ２５ＫＶ，２５Ｕｆ，８５ｍｓ．吸出、加入ｌｍｌＬＢ液中摇匀１９０转份ｘｌ小时，离心３８００ｒｐｍ×２ ｍｉｎ，涂板。２结果２ｌ金属酶的筛选所有菌株使用头孢他啶＋２．巯基丙酸双纸片金属酶检测实验未检测到金属酶表型。见图３―１。２ ２三维试验：见图３．２至图３－６。妻｜么２＼一巯基丙酸／■３＿１－疆最片藩螂“一赛■■暴ｉ半部升由ｖＩＭ田３＿６同产嘟ｈ＋＾啊奠■棒鞠胍糟三堆试蚴果扎Ａ：酶租提取物；扎８：酶粗提取物＋氟唑西林 孔ｃ：酶耦提取钧＋氯唑两＃＋舒Ｂ坦ｍ性铜绿假坼胞苗的ｍ性对照，ｉ＊头斑他啶纸片靠蚯２冀蕈丙瞍侧抑菌嘲增太：Ｔ圈☆特制的鲍曼 小动杆苗．２磕基丙酸与头孢他啶无协同作用，结果阴性．▲Ｉ罗晃｝气勰嬲孳靠％怒等黑熊曼芝３嚣慧罄嘴黯稔嬲警熊ｍ＾医科大学硬十学位奄立―■■：Ｆ黑嬲黑氍嚣徽善嚣。慧篇㈣蔫瓣瓣乱图３－２显示实验菌株产生的酶能水解头孢曲松．并且能被舒巴坦抑制：图３．３显示实 验菌株产生的酶能水解头孢曲松．并且不能被舒巴坦抑制：图３＿４显示实验菌株产生的酶 能水解头孢西丁并且能被氯唑甄林抑制：图３．５显示实验菌株产生的酶能水解头孢西丁． 并且不能被氯唑西林抑制：图３－６为产ＥＳＢＬｓ＋ＡｍｐＣ酶菌株的阳性对照，提示菌株产生的 酶能够水解头孢西丁，但是能够被氯唑西林＋舒巴坦抑制。２．３ ２３ ｌ主要Ｂ－内酰胺酶编码基因的检铡ＥＳＢＬｓ编码基因ＰＣＲ扩增结果：６０株多重耐药鲍曼不动轩菌ＰＣＲ扩增后．ｂｌｏＴＥＭ基因阳性的有４２株．ＰＣＲ产物经克隆测序与ＧｅｎｅＢａｎｋ上ｂ／ｏｒＥＭＩ的序列完全一致 （ＧｃｎｅＢａｎｋ登录号：筮堕§Ｑ！丝。ｂ／ａｐＥＲ有２０株阳性，ＰＣＲ产物经克隆测序与ＧｅｎｅＢａｎｋ上６插盹Ｒ Ｉ的序列完全一致（ＧｅｎｃＢａｎｋ登录号｝ＥＵＱ２２３鲤），其中同时含ｂｌａｐＥＲ．１基因型和ｂｌａｘⅢ．Ｉ摹因型的菌株有１３株。２株菌株携带ｓｈｙ基因阳性．序列分析证实为ｂ／ａｓＨｕ２：１株菌株ｃｔｘ－ｍ－１组引物扩增得到阳性产物．序列分析证实为６，口ｍ¨（ＧｃｎｅＢａｎｋ登录号：￡￡５２Ｑ世２）．而且这三抹苗的６『舯ＥＭｌ阳性。ＧＥＳ、ＶＥＢ型引物扩增６０抹菌株均阴性。见图３．７、３－８。图３－７ｂｌａｓ．妣、ｂｌａ呲、ｂｌａｒＦＭ基因ＰＣＲ电泳图左罔为６抽Ⅲｕ，基因；中图为ｂｌａ ＰＥＲ基因ＰＣＲ ｆＵ泳结果：右圈为ｂｌａＴＥＭ基因ＰＣＲ电２２山西医科大学哽±学位论文诛结果；ＭｔｒｎⅢｔ目．Ｐ：为阳性对照，Ｎ：阴性对照．心‰㈦枷蚰蛳。蛐。枷龇执。龇丛渊 心 …删 舭Ｉ棚＿｜心 姒姗僦腻ｌ圈３－８ｂ／ｍ抖．２、ｂｌａｎｈ６ｈｔ＊，基因ＰＣＲ部分峰圈。上图为ｂ／ａｓｎ＊ｚ基因；中国为６，口唧基因：下图为ｂｈｍ…基因。２．３．２染色体携带ＡｍｐＣ酶基因ＰＣＲ扩增结果：６０株多重耐药鲍曼不动杆菌ＰＣＲ扩增后，６ｈ州基因阳性的有５７株．ＰＣＲ产物经克隆测序与Ｇｅ眦Ｂａｎｋ上ｂｌａＡｎ讲的序判完全一致（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号：ＥＵ９７７５７１）。６ｈ呻基因阳性的有２株．ＰＣＲ产物经克隆铡序与ＧｅｎｅＢａｎｋ上ｂｌａＡⅨｗ的序列完全一致（ＧｅａｅＢａｎｋ登录号：ＡＭ２９３３３２）。见图３－９、３－１０。山日Ｅ科大学硕士学位论文ＰＮＭＮＰｈ图３－９６括㈣ｂｌａ｛，基因ＰＣＲ电泳图左图为６抽一ｗ基因；右图为６抽ｏｘ¨，基因ＰＣＲ电泳结果；Ｍ：ｍａｒｋｅｒ．Ｐ：为阳性对照．Ｎ：阴性对照。』姒搬址出姒燃如盎“帅㈨；｛２ ３图３―１０ ６ｋ＾０ｃ、６肠㈨∞基因ＰＣＲ部分蜂图。上图为６抽＾Ｄｃ基因：下图为ｂｌａｏｘ＾．：，基因。蛐妣麟搬础２４３碳青霉烯酶基因ＰＣＲ扩增结果：６０株多重耐药鲍曼不动杆菌ＰＣＲ扩增后，ｂｌａｏｘＡ。３基因阳性的有１５株，ＰＣＲ产物经克隆测序与ＧｅｎｃＢａｎｋ上６如嗍ｔ，的序列完全一致（ＧｅｎｅＢａｎｋ登录号：ＥＵ８２７５２６）。ＯＸＡ一２４型、ＯＸＡ．５８型、ＩＭＰ型、ＶＩＭ型、ＳＩＭ一１型引物扩增６０株菌株均阴性。见图３－９、３－１０。山两医科大学硕十学位论文２．３．４各基因型同时阳性的菌株数及其种类．６０株多重耐药鲍曼不动杆菌ＰＣＲ扩增后，ｂｌａｒ－ＥＭ基因阳性的有４２株，ｂｌａＰＥＲ有２０株阳性，其中同时含ｐｅｒ－１基因型和ｔｅｍ－１基因型的菌株有１３株。２株菌株携带ｓｈｖ基因阳 性和１株菌株ｃｔｘ．ｍ．１组基因阳性的这三株菌的ｂｌａｒＥ川阳性。而ＯＸＡ．２３基因阳性的１５ 株菌株全部为碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌即ＣＡＲＢ。具体见表３．３。表３－３各基因型同时阳性的菌株数引物基因型 ＴＥＭ一１ＰＥＲ．１阳性数（株）铊 加Ｂ２ ●ＴＥＭ．１＋ＰＥＲ．１ＳＨＶ二２＋ＴＥＭ一１ＣＴＸ．Ｍ一３＋ＴＥＭ一１ＯＸＡ．２３＂７ ● ３ ３ＯＸＡ一２３＋ＴＥＭ．１ ＯＸＡ一２３＋ＣＴＸ．Ｍ．３ＯＸＡ．２３＋ＰＥＲ―ｌＯＸＡ．２３＋ＰＥＲ．１＋ＴＥＭ．１２．３．５接合试验、质粒抽提和电转化实验：随机挑选Ａ、Ｂ克隆中ＰＥＲ基因阳性的菌株各 一株，ＴＥＭ基因阳性菌株各一株，ＯＸＡ．２３基因阳性菌株，及散发菌株中ｂｌａＳＨＶ基因阳 性和ｂｌａＣＴＸ．Ｍ．３阳性的三株菌株进行接合试验，碱裂解法反复抽提质粒。除ｂｌａＣＴＸ．Ｍ．３ 基因阳性菌株的接合试验成功，质粒抽提成功，以及ｂｌａＳＨＶ－２基因阳性的菌株质粒抽提 成功以外，其它菌株反复多次接合试验、抽提质粒以及电转化均未成功。见图３．１１、图３．１２。山西医科大学硕士学位论文２３Ｉ ３０ｂｐ ｑ４１６ｂｐ ６５５７ｂｐ图３．ＵｂｌａＣＴＸ．Ｍ－３阳性菌株质粒电泳图谱＿为ｘ－４１ｉｎｄ Ｈｉｄｉｇｅｓｔ．５５为原始菌，５５―１为接台茴）２３１ ３０ｂｐ ９４１６ｂｐ ６５５７ｂｐ３１３０ｂｐ ９４１６ｂｐ５５７ｂｐ图３－１２ ｂｌａＳＩｔＶ－２基因阳性的菌株质粒电泳图谱 （Ｍ为Ｌ－Ｈｉｎｄｌｌｉｄｌｇｅｓｌ，１４、１６分别为菌株号）２．３５各基因型在各克隆抹的分布情况 ６０株菌株可分为５个克隆株，其中Ａ、Ｂ为主要克隆株。ＰＥＲ、ＴＥＭ以及ＯＸＡ－２３基因阳性的菌株主要分布在Ａ、Ｂ两个克隆，ＳＨＶ基因阳性和ＣＴＸ－Ｍ．３阳性的苗株均为 散发菌株．见表４－４。山西医科大学硕士学位论文３讨论不动杆菌的耐药机制比较复杂。细菌产生ｐ．内酰胺酶是细菌对ｐ．内酰胺酶类抗生素耐 药的主要机制。近年来，有关多重耐药鲍曼不动杆菌的报道日益增多，其耐药机制包括外膜孔蛋白的丢失、外排泵的激活、青霉素结合蛋白的改变等，产生ｐ内酰胺酶是其对ｐ内酰胺 类药物产生耐药的重要原因。ＥＳＢＬｓ一般由质粒介导，各个国家、地区、医院流行的ＥＳＢＬ基因型各不相同，存在于鲍曼不动杆菌的一类Ａｍｂｌｅｒ Ａ类超光谱Ｂ内酰胺酶主要有ＴＥＭ、ＳＨＶ、ＰＥＲ型等。如美国以ＴＥＭ．１０、１２、２６型ＥＳＢＬ为主；欧洲国家如英国以ＴＥＭ．１０、１２为主，法国以ＳＨＶ．３、４和ＴＥＭ．３为主；我国以ＣＴＸ．Ｍ型为主【５１１。本研究采用双纸片法和三维试验检澳，０１３一内酰胺酶。双纸片法检测金属酶表型方便、快 捷，但对于头孢他啶本身可诱导产生耐药的情况可能导致假阳性的结果。对于ＥＳＢＬｓ的检 测，ＣＬＳＩ推荐的表型筛选和确证试验己为临床实验室所广泛采用，但仅限于大肠埃希菌、 肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌，而未推荐用于其它肠杆菌科和非肠杆菌科革兰阴性杆菌。 对于ＡｍｐＣ酶的检测则较为困难，目前较为公认的方法是Ｃｏｕｄｒｏｎ等【４７】推荐的酶提取物头孢 西丁三维试验。虽然三维试验操作繁琐、费时，但由于此方法通过酶提取物来检测，没有 活菌，排除了头孢西丁诱导细菌产ＡｍｐＣ酶的干扰，结果准确可靠。在Ｃｏｕｄｒｏｎ＿三维试验的 基础上，国内也有人做了进一步的改进。吴伟元【４８】介绍了一种可以同时检ＮＡｍｐＣ酶和 ＥＳＢＬｓ的三维试验，在此基础上，我们将参考文献【５２】挖槽改为打孔，试验结果更明显。 ６０株多重耐药的鲍曼不动杆菌中，产ＴＥＭ．１型ｐ．内酰胺酶的有４２株，ＴＥＭ．１内酰胺酶 属于质粒介导的具有代表性的ｐ．内酰胺酶之一【５３】，本实验中ＴＥＭ．１基因型阳性的菌株的分 离率要高于国内的相关报道。山西医科大学硕十学位论文我国学者蒋晓飞等【５４１２００１年首次在鲍曼不动杆菌中发现产ＰＥＲ－１阳性的菌株。我院分 离的多重耐药的鲍曼不动杆菌产ＰＥＲ－１阳性的菌株有２０株，检出率为３３．３％，比国内相关报道【５０】高很多，但｝ＬＶａｈａｂｏｇｌｕ Ｈ等‘５５１要低一些。尽管其在肠杆菌科细菌中检出率较低，但由于一型由质粒编码，具有较强的扩散能力。可在不同菌株、不同菌种问传递耐药性，因此， 它具有引起医院感染的潜在危险性。ＰＥＲ型ＥＳＢＬｓ随着头孢菌素的应用尤其是三代头孢菌素广泛应用而产生，多由铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌细菌产生。它能介导对大多数ｐ．内酞胺类抗生素耐药，包括头孢三代、氨曲南等，可被克拉维酸抑制，对氨基糖苷类、喹诺 酮类耐药。 同产ＰＥＲ．１型和ＴＥＭ．１型Ｂ．内酰胺酶的有１４株，即发生了产ＴＥＭ．１和ＰＥＲ－１酶的多重耐 药的鲍曼不动杆菌的暴发流行．这两个基因型主要属于Ａ、Ｂ两个克隆。 根据我院以往的调查，我院２００６年之前ＥＳＢＬｓ的基因型主要为ＣＴＸ型即头孢噻肟型， 所以我们放宽了头孢他啶的使用，２００６年达到了高峰（见第一部分讨论），而此次研究中 我们也发现了两株产ＳＨＶ型的ＥＳＢＬｓ且Ｐ对头孢他啶耐药型，这也提示我们应该对头孢他啶 的使用进行限制性保护。 产ＯＸＡ一２３型碳青霉烯酶主要水解碳青霉烯类抗生素，而我们实验中检测的１５株产 ＯＸＡ．２３型碳青霉烯酶菌株均为碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌即ＣＡＲＢ，碳青霉烯类抗 菌药物是目前治疗是治疗不动杆菌重症感染的首选抗生素。鲍曼不动杆菌一旦对碳青霉烯 类抗生素耐药（即ＣＲＡＢ）就意味着对大多数临床常用抗菌药物耐药。对ＣＲＡＢ感染治疗 时的抗菌药物选择非常困难，常常无药可用的情况。因此我们在加强合理使用碳青霉烯类 抗生素的同时，也可以使用其它抗菌药物替代其使用，加强其限制性保护。 产ＣＴＸ．Ｍ．３型ＥＳＢＬｓ的菌株成功完成接合试验，国内未见相关报道，同时并抽提了原 始菌和接合菌的质粒，而质粒介导的不动杆菌的耐药性可以在不同种属间广泛传递、导致 耐药性播散的可能，造成医院感染的流行，给临床抗感染治疗构成很大威胁。产ＳＨＶ型的 两株菌株虽然成功抽提了质粒，但接合实验虽进行多次仍未成功，转化实验也未成功。 产生Ｂ．内酰