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天麻微卫星DNA分子标记与天麻素含量的关系
摘　要:目的：探讨天麻遗传变异与其品质的关系，为优良种质的选育提供科学途径。方法：采用CTAB法提取天麻DNA，进行PCR扩增，用微卫星DNA分子技术（SSR）标记DNA；用高效液相色谱法检测不同种质天麻的天麻素含量，分析两者之间的关系。结果：出现A条带类型的样品天麻素含量较高，7EKYC、9EDF；24GBJ、22GZJ；1FDJ、2FLL；4VDF、6EKYW；18GWAC、8EWD，分别聚到一起，遗传距离较小。结论：特异引物扩增位点与天麻素含量有关，高天麻素含量与SSR高分子量条带有关，其关系有待进一步研究。
作者单位：(1.贵阳医学院 药用植物与生药学教研室， 贵州 贵阳 .贵州家诚药业， 贵州 遵义 563000)【摘要】&
目的： 探讨天麻遗传变异与其品质的关系，为优良种质的选育提供科学途径。方法： 采用ctab法提取天麻dna，进行pcr扩增，用微卫星 dna分子技术(ssr)标记用高效液相色谱法检测不同种质天麻的天麻素含量，分析两者之间的关系。结果： 出现a条带类型的样品天麻素含量较高，7ekyc、924gbj、221fdj、24vdf、618gwac、 8ewd，分别聚到一起，遗传距离较小。结论： 特异引物扩增位点与天麻素含量有关，高天麻素含量与ssr高分子量条带有关，其关系有待进一步研究。
【关键词】& 天麻; 天麻素; 生物学标记; ssr分子标记
　a primary study on the relationship between microsatellitedna of gastrodia elata blume and gastrodin content
　　zheng weiyao1, song juxian1 , wang xiaoli1, li baozhong2, he guodong1
　　(1.department of medical plant and pharmacognosy, school of pharmacology, guiyang medical college, guiyang 550004,
　　guizhou, 2. guizhou jiacheng pharmaceuticals company, zunyi 563000, guizhou, china)
　　[abstract] objective: to investigate the associativity between the genetics and variation of gastrodia elata blume and its quality, so as to provide scientific path for good species selection. methods: dna of gastrodia elata blume was extracted by ctab method, amplified by pcr and mar gastrodin content was detected by hplc. the relation between ssr fingerprinting and gastrodin contents was analyzed. results: gastrodin contents were relatively high in specimens with type a bands. genetic distances between 7ekyc and 9edf, 24gbj and 22gzj, 1fdj and 2fll, 4vdf and 6ekyw, 18gwac and 8ewd were small. conclusions: the sites for special primer amplification relate to gastrodin content, and gastrodin content relates to ssr fingerprinting, which needs further research.
　　[key words] ssr molecule marker
　　名贵中药天麻来源于兰科植物gastrodieae elata bl.的干燥块茎，是中国药典收载的天麻唯一入药品种。该品种性平、味甘;归肝经，能平肝息风、止痉。主治头痛眩晕、肢体麻木等症。药理研究表明，天麻具有镇静、安眠、抗惊厥、镇痛及扩张冠状动脉、降压作用。临床主要用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫抽搐症，亦用于健脑和老年性痴呆等症。传统的天麻品种选育主要以药材表型特征为基础，天麻经多代繁殖，外形、颜色、天麻素含量等均发生一定程度的变异，形成不同的类型，影响天麻的质量和育种。2005年3月～2006年5 月，采用ssr遗传标记技术与天麻指标性成分天麻素含量同时检测的方法，对来自贵州不同产区天麻进行分析，从而探讨中药天麻遗传变异与其品质的关系，为优良种质的选育提供科学途径[1,2]。
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　天麻由贵阳医学院生药研究室采集并鉴定。样品的编号、分类及产地等情况见表1。表1 样品编号、分类及产地注：黄、绿、红、乌天麻分别用f、v、e、g表示;w：野生，c：栽培，c(1)：无性繁殖
　　1.2 仪器与药品
　　2倍ctab提取液，50 mmol edat，100 mmol nacl，2%&?巯基乙醇。pcr相关试剂均由上海生工提供，其余均为国产分析纯。高效液相色谱系统(美国beckman公司)。
　　1.3 方法
　　1.3.1 dna提取 采用ctab法[3～6]。处理过的天麻样品加入少量玻璃砂研磨至细粉，转入1.5 ml离心管后加2倍ctab提取液，65 ℃保温。1～2 h后加2倍ctab提取液的样品用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提2次, 每次抽提后于13 000 r/min离心10 min。抽提后的上清液加2倍体积的无水乙醇沉淀dna，4 ℃冰箱放置30 min后于5 000 r/min离心5 min，dna沉淀用70%乙醇洗涤2次，加入含10 mg/l rnase的te溶解后于37 ℃水浴保温1 h。
　　贵阳医学院学报 35卷 1期郑伟耀等 天麻微卫星dna分子标记与天麻素含量的关系1.3.2 pcr扩增 反应体系为25 &l：ddh2o 12.5 &l，10倍buffer 2.5 &l，dntps(2 mmol/l) 2.5 &l，mg2+(25 mmol/l)1.75 &l，taq 酶(2 u/&l)0.75 &l，模版dna 1 &l(20 ng)，上游引物(8 mmol/l)2 &l，下游引物(8 &mol/l)2 &l。pcr反应程序为： 94.0 ℃预变性5 94.0 ℃变性1 min，58.0 ℃退火1 min，72.0 ℃延伸1 min，35个循环;最后在72.0 ℃继续延伸5 min，4.0 ℃保存。反应结束后取8 &l扩增产物于2.5%的琼脂糖凝胶上电泳检测，电泳条件为1倍tae缓冲液，80v恒压，电泳时间约1.5 h，0.5 mg/l溴化乙锭染色30 min，在凝胶成像仪上观测结果，照相。ssr扩增条带经gel?pro analyzer version 4.5软件识别。
　　1.3.3 天麻素含量测定 按《中国药典》2005版天麻含量测定项下方法进行。
　　2 结果
　　2.1 ssr分子标记
　　ssr分子标记见图1。
　　2.2 天麻素的hplc含量测定
　　天麻素的hplc含量见表2。
　　2.3 特异引物扩增带型与天麻素含量
　　特异引物(暂不公布)扩增带型与天麻素含量的关系见表3。
　　2.4 扩增带型分子量与天麻素含量的关系
　　扩增带型分子量与天麻素含量的关系见图2。
　　2.5 扩增带型与天麻素含量关系的数据处理
　　基于被测样品间的ssr条带与天麻素两两比较，将天麻素含量&0.20%的条带记做&1&，天麻素含量<0.20%的条带记做&0&，采用ntsys?pc(ver1.8)计算软件，用非加权配对法(upgmam)进行sahn聚类分析，构建了24个品种的特异引物扩增带型与天麻素含量的关系图(图3)。图1 特异引物对扩增的ssr指纹图谱表2 hplc法测定天麻素的含量注：1.含量1 mg/g等于0.1%;2.对照品浓度为50 mg/l;3.供试材料为ssr试验平行样的干燥品;4.3vzy、5vrj、10ezy、11ewa、12ebj、15gky、16gwd、21glp、23gdj均未检出天麻素
　　3 讨论
　　3.1 本研究的材料均为鲜品，为研究方法规范起见，含量测定采用中国药典天麻标准。从图和表上看出，在所测定的样品中，出现a及ab条带的样品除gzyc外，天麻素含量均达到或超过药典标准，即：按干燥品计算，天麻素含量不得少于0.20%。而出现b条带的样品天麻素含量只有样品fdj，ekyw刚达到药典标准，其他样品天麻素表3 特异引物扩增带型与天麻素含量的关系注：a：高分子量的条带>320b：低分子量含量均不达标。由此结果可以推测特异引物扩增位点与天麻素含量有一定的联系，即出现a条带类型的样品天麻素含量较高。
　　3.2 从扩增结果还可看出，野生及无性繁殖的天麻的ssr位点基本都是纯合型，而杂交栽培的品种基本都是杂合型。分析原因，天麻为自花授粉植物，若本身基因为纯合型，则由于不与其他不同类型杂交而保持其纯合型，可稳定遗传。而直接由野生天麻通过无性繁殖产生的变型，由于没有经过授粉，基因型也将保持不变。ssr为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子。本实验所用的引物可有效地鉴别各扩增位点的纯合与杂合。目前，大部分栽培天麻为有性繁殖的杂交品种，如红天麻、乌天麻。杂交使得不同的基因型遗传到子代，从而变为杂合型。ssr分子标记对天麻的野生品种、无性繁殖品种及有性繁殖品种表现出很好的鉴别能力，为天麻的鉴别提供了分子依据[7～9]。
　　3.3 从图3可见，7ekyc、924gbj、221fdj、24vdf、618gwac、 8分别聚到一起，它们的遗传距离较小，依次为0.005、0.01、0.05、0.07、0.10，表明高天麻素含量与ssr高分子量条带有较大的相关性;21glp、17gzyc、23gdj、13gzyw、3vzy、20grj、14gwaw、5vrj、15gky、10ezy、11ewa、16gwd、12ebj、19gdf的遗传距离较大，均>0.10，虽均有相关性显示，但相关性较小，且由于天麻素含量不符合药典规定的标准，所以没有意义。
　　3.4 本研究将天麻dna分子标记与天麻素含量结合对育种具有意义，若经费和时间充足，可以再扩大检测的样品数量，进一步探讨天麻遗传变异与其次生代谢产物指标性成分天麻素关联的规律性，从分子水平探讨和制定天麻种内优良品种的鉴定和选择指标。
【参考文献】 ......(未完，请点击下方“在线阅读”)
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