哪些技术可以实现细胞成像技术样品的三维成像

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-09-14 10:24 标签： 细胞毒性样品量要求
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三维全息显微镜快速鉴别细胞技术
三维全息显微镜快速鉴别细胞技术
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来源：美国《光学与光子新闻》日（月刊）封面主题新闻 由丁香园站友 photomedicine转载并编译， 导读：近几年三维计算全息显微镜的发展为生物成像研究开辟了新纪元。三维计算全息技术所包含的数据处理使研究者获得丰富的量化信息，这些信息包含着非介入实时条件下的细胞和微生物结构。
数字全息在很多方面类似经典全息照相，不同的地方在采用光电子感应器代替感光胶片。这样使得数字全息的数据处理可以应用于生物医学、公共医疗和环境监测等许多方面。这项技术已经结合显微镜被广泛应用到生物样品的三维可视化成像。 全息成像原理是相干光源通过半透明镜头时，光束的振幅和相位在光和物质相互作用时受到调制，这种调制信号使得输出波前带有物体全部三维结构信息。 使用数字全息显微镜（DHM），我们可以间接记录物体波前的相位和振幅信息。通过单个全息样本，数字重构生物样品不同深度层次的图像。因此，DHM一般被归类为三维光学计算显微镜。DHM的核心部件是光学干涉仪，用来形成来自细胞和微生物的菲涅尔衍射光和参考光的干涉场。光学干涉场的强度分布用光电成像感应器（如CCD或者CMOS相机）进行数字化成数字全息图，其中的编码包含着生物样品的三维结构信息。反向的菲涅尔变换将对全息图进行解码并重构样品特有的相位和振幅调制信息。这样DHM不需要对样品扫描就可以拥有激光扫描共聚焦显微镜进行三维成像的优点。 传统的明视场显微镜通过样品的光学吸收构建图像而丢失相位信息。由于细胞质和大部分细胞器的的光学吸收系数很小，结果二维的明视场的细胞图像通常对比度低很难观察到有用的细节部分。一个增加半透明细胞的典型实例就是利用高吸收系数的染料对细胞进行染色和固定。可惜这种介入过程经常终止细胞的生命周期。而细胞生物学家却需要监测活细胞，研究其行为和动力学过程。幸好光学相位对细胞质和周围介质之间的折射率变化很敏感。这个特性已经被用到传统的相衬和干涉场显微成像技术拍摄高对比度的图像。可惜这两个传统技术不能提供细胞的厚度信息。虽然相衬显微镜和微分干涉（DIC）显微镜在过去在细胞定性方面提供可重用应用，但无法进行定量分析也不能进行细胞和微生物的自动鉴别。再者，为了对生物样品不同层面聚集，相衬和DIC显微镜还必须进行机械扫描。这会增加成像时间并限制细胞实时检测和时间动态过程研究。 DHM是一种定量相位成像方法，直接和非介入地提供活体细胞的光学厚度和动态条件。光学厚度跟细胞厚度和通过细胞折射率的三维形态有关。这样结合计算机算法，DHM就成为非介入三维实时成像和鉴别细胞、微生物的实用技术。一张全息图只需要单次曝光就包含样品三维结构的丰富定量信息，用来鉴别细胞和辨认物体。为了这个目的，我们可以结合已经发展起来的自动鉴别物体并被应用于医学、军事、机器人等各种工业的模式鉴别技术。 最近，一些研究人员提出使用三维感应和成像系统作为基于细胞三维结构和态的非介入自动细胞鉴别技术。生物样品的实时、自动拍摄、分析和鉴别将有助于疾病诊断、环境监测、和流行性疾病的早期检测。而传统的生物表征方法则需要介入、劳动强度高和耗费时间多，要求染色的方法也对细胞造成危害，还不能有效进行大规模应用。另外，基于二维特性如样品的形状、大小和形态的分析并非总能令人信服。所以，集合了三维计算成像、信息光学和DHM非常有希望作为可靠、自动和低价的工具应用于细胞（如血液或干细胞）的快速感应、可视化和鉴定。 目前的DHM方法有单次曝光同轴伽柏全息显微镜，得益于简单、小型和低价的系统，作为三维细胞鉴别具有很好的工作性能。结合微流器件和光镊微操作等其他技术，DHM还可以可以进行更复杂的分析和细胞操作控制。
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完整细胞纳米分辨X射线三维成像研究
来源：科学与技术前沿论坛：中国科学院学部“活细胞大分子的定位和定量问题”科学与技术前沿论坛
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在细胞生物学中，研究完整非破坏细胞内的亚细胞结构来认识大分子复合物和细胞功能的内在联系和作用机理是至关重要的。纳米分辨三维结构与功能成像是目前国际上生命科学、物理、化学、材料等领域的交叉科学研究前沿，是解决人类健康与疾病等关键科学问题所迫切需要的技术和方法。目前，可见光显微镜被广泛用于观察活细胞的动态过程，但是其衍射受限空间分辨率不足以观察到细胞内部的细胞器结构；电子显微镜具有很高的空间分辨率，然而其穿透深度有限，只能通过真空冷冻和切片方式重建亚细胞结构三维图像，无法对完整含水细胞进行三维成像。近年来逐渐发展起来的X 射线显微镜，很好的弥补了可见光显微镜和电子显微镜在细胞成像方面的不足。与可见光相比，X 射线的波长减小三个数量级，其衍射受限分辨率能够达到纳米量级；与电子束相比，X 射线具有大得多的穿透能力，因而具有纳米分辨三维无损成像的巨大潜力。
在&水窗&软X 射线(能量在284 eV~530 eV 之间)波段，蛋白质等生物样品对的吸收吸收比水的吸收系数高一个数量级。&水窗&软X 射线的这种特别性质，为含水细胞成像提供了天然的衬度增强机制。然而，由于焦深和辐射剂量的限制，&水窗&软X 射线显微镜适用于对直径5 微米左右细胞，进行空间分辨率不低于60 纳米的三维成像。
真核细胞的典型直径大于10 微米，因此亟待发展一种可以对更大尺寸完整含水细胞进行高分辨和高衬度三维成像的方法。为此，我们提出中能(2~2.5 keV)泽尼克相位衬度显微镜研究。理论分析与计算表明，在中能泽尼克相衬显微镜中，图像衬度不低于&水窗&吸收衬度；中能X 射线的穿透能力足够强，能够对完整真核细胞进行三维成像；细胞等样品所受的辐射剂量更低；在30~40 纳米空间分辨率下，系统焦深能够达到20~40 微米，能够对完整真核细胞进行高分辨三维成像。
另一方面，现有基于波带片的X 射线显微镜的分辨率极限约为10~20 nm，其进一步的分辨率提升遇到了微纳加工技术的瓶颈。这种分辨率仍然不足以对生物、材料研究领域中的小尺度结构进行辨析。为了在保持X 射线显微术大焦深三维无损成像的优势下，研究超越分辨极限的微小结构，我们提出了散射X 射线显微术。散射显微术基于现有的波带片X 射线显微镜架构，并结合了小角散射(SAXS) 表征技术的思想，能够弥补现有X 射线显微镜在分辨率上的不足。而从SAXS 技术的角度来看，散射X 射线显微术将使传统微区SAXS 技术的映射分辨率从微米跃升至几十纳米，
并且能够同时采集所有样点的数据，无需对样品进行二维扫描。这也有望成为SAXS领域的一次重大革新。

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