第28卷　第4期
2010年8月石河子大学学报(自然科学版)JournalofShiheziUniversity(NaturalScience)Vol.28　No.4
文章编号:10)
新疆杏品种自交不亲和
S2RNase基因PCR扩增体系的优化
姜新,冯建荣,姜俊卿,王大江,刘月霞
(石河子大学农学院,石河子832003)
摘要:以3个新疆杏品种的叶片为试材,以其叶片基因组DNA,×Buffer(含Mg2+)、dNTP、上下游引物、TaqDNA聚合酶和退火温度6,S2RNase基因PCR扩增条件,:94℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45℃,3510min,25μL反应体系10×Buffer(含Mg2+)
2.5μL,dN0.mol/L,DNA80ng,DNA聚合酶1μL,此为最优的反应体系。
关键词:杏;;S2基因;体系优化
中图分类号2　　　　文献标识码:A　　　　
OptimizationofSelf2IncompatibilityS2RNaseGene
PCRAmpilificationSysteminXinjiangApricots
JIANGXin1,FENGJianrong1,JIANGJunqing1,WANGDajiang1,LIUYuexia1
(CollegeofAgriculture,ShiheziUniversity,Shihezi832003,China)
Abstract:Inthisexperiment,theleavesofthreeXinjiangapricotcultivaswereusedastestmaterials,andtheirDNAswereusedastemplates,6levelsof10×buffer,primer,dNTPmixture,DNApolymeraseandannealingtemperatureweresetinthisexperimentationtostudythePCRamplificationconditionsofself2in2compatibilityS2RNasegeneinXinjiangapricostandestablishoptimalPCRampilificationsystem.There2sultsshowedthattheamplificationprogramwas94℃predegradationfor5min,94℃degradationfor45s,52℃annealfor45s,72℃extensionfor2min,after35cycles72℃extensionfor10the25μLre2actionmixturecontained10×Buffer(includeMg2+)2.5μL,dNTPmixture0.08mmol/L,eachprimer0.16μmol/L,DNA80ng,TaqDNApolymerase1μL,whichistheoptimumsystem.
Keywords:self2S2RNPCRoptimization
　　新疆是世界杏的起源中心之一,具有丰富的杏
品种资源[1]。2005年新疆杏的栽培面积达到1.5×
105hm2,鲜杏产量70万t,已经成为新疆仅次于葡
萄、苹果的第三大果品。新疆杏加工和鲜食特性优
　收稿日期:良,具有良好的产业化前景。自治区“十一五”园艺发展规划,在2010年末新疆杏栽培面积要达到2×105hm2,届时杏将成为新疆首要的特色果品之一。新疆杏品种都属于自交不亲和的品种,其自交
基金项目:国家自然科学基金项目(),国家高技术研究发展计划项目(),国家科技支撑计划项目
(2007BAD36B06)
作者简介:姜新(19832),男,硕士生,专业方向为杏树种质资源与遗传育种;e2mail:。
通讯作者:冯建荣(19692),女,教授,从事果树种质资源与分子辅助育种研究;e2mail:。
　第4期　　　　　　　　姜新,等:新疆杏品种自交不亲和S2RNase基因PCR扩增体系的优化419
亲和性普遍被认为属于S2RNase体系的配子体自交不亲和体系,受1个具有复等位基因的S2位点控制,S2位点至少包括2个基因,1个在花柱中特异表达,称花柱S2RNase基因,另1个在花粉中特异表达,称花粉SFB基因。当雌雄性器官具有相同的S2等位基因时,交配不亲和,花粉管在花柱中生长受到抑制,不能延伸生长进入子房;当雌雄双方的S2基因不同时,交配能亲和,花粉能顺利生长进入子房,完成受精[2]。研究建立优化的S2RNase基因PCR扩增体系有利于快速、准确的鉴定自交不亲和的S2RNase基因型,为科学的配置杏授粉品种,提高杏的产量提供有利的技术支撑。
目前,关于利用特异引物PCR方法检测杏的自交不亲和S2RNase基因的报道有:Sut3利用PCR技术对“因进行了扩增[4]方(aremeniacaL.cv.Ba2danshui)、红玉杏(P.aremeniacaL.cv.Hongyu)及凯特杏(P.aremeniacaL.cv.Katy)3个品种的S2RNase基因;冯建荣等[5]利用特异PCR技术成功地在凯特(P.aremeniacaL.cv.Katy)和新世纪杏(P.aremeniacaL.cv.Xinshiji)上鉴定出了3个新的S2RNase基因;张立杰等[6]利用PCR方法比较分析了5对蔷薇科李属通用的引物组合对30个中国杏品
TE溶解DNA产物,紫外分光光度计检测DNA的
浓度,-20℃保存备用。1.2.1　PCR体系、程序及检测
本实验采用冯建荣等[5]报道的P系为参考体系,组分分别为:10×Buffer(含Mg2+)2.5μL、dNTP0.2mmol/L、上下游引物:0.2μmol/L(上游引物:5′2GGCCAAGTAATTATTCAAACC23′,下游引物:5′2)、TaqCATAACAAARTACCACTTCATGTAAC23′DNA聚合酶0.25μL、DNA50～100扩增程序
为:94℃预变性5min,94℃变性45s,52℃退火45s,72℃延伸2min,35℃延伸10min。
,V,,。2对体系中的4个组分和退火温度均设6个梯度,如表1所示。
在进行PCR扩增体系的优化过程当中,只调整单个试验因素的梯度水平,其他条件均按1.2.1中进行设置。
表1　体系中4种组分和退火温度梯度设计
Tab.1Thegradientdesignof4compositionsandannealing
temperatureofthesystem
梯度1梯度2梯度3梯度4梯度5梯度6
1.50.080.08150
2.00.160.12252
2.50.200.16354
3.00.240.2456
3.50.320.24558
10×Buffer(含
Mg2+)/μLdNTP/(mol/L)
0.040.040.548
种S2基因特异PCR的扩增效果。
本研究以新疆杏品种为试材,在前人的研究基础上进一步调整和优化PCR体系的各组份和扩增程序,旨在建立优化的新疆杏品种S2RNase基因的PCR扩增体系,为深入系统的研究新疆杏品种S2RNase基因型的鉴定提供可靠的理论依据。
上下引物/(μmol/L)
TaqDNA聚合酶/U
1　材料与方法
1.1.1　试材
退火温度/℃
2　结果与分析
2.1　10×Buffer(含Mg2+)浓度对PCR结果
本实验材料均采于新疆农业科学院轮台国家果树资源圃,品种名分别为:苏陆克、贝新纳尔、辣椒杏,五月底采集刚成熟的嫩叶洗净晾干后硅胶干燥保存备用。1.1.2　试剂
10×Buffer(含Mg2+)和TaqDNA聚合酶购自
结果见图1。
图1显示:梯度1～梯度4对3个新疆杏品种的PCR扩增效果呈明显的梯度差异,随浓度的增加扩增效果越来越好,但梯度4～梯度6的扩增效果却无明显的变化。从最佳的扩增效果和节省成本二方面判断,10×Buffer(含Mg2+)在梯度4时的浓度为最佳选择,为2.5μL。
广东东盛公司;dNTP购买自加拿大BioBasicInc公司。引物均由上海生工合成。
利用CTAB法提取杏叶片基因组DNA,50μL
　　　　　　　　　　　　　石河子大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　第28卷　
2.4　TaqDNA聚合酶浓度梯度对PCR结果
结果见图4。
图4显示,6种TaqDNA聚合酶浓度对3个新疆杏品种的扩增效果无明显的梯度差异,只是在梯
1:苏陆克;2:贝新纳尔;3:辣椒杏
图1　不同10×Buffer(含Mg2+)浓度时3个杏品种
PCR扩增结果
Fig.1TheamplificationofPCRwithdifferentgradsof10×Buffer(Mg2+)for3apricotcultivars
度1时扩增效果稍差,其它5个梯度对3个品种的
扩增效果基本相同,因此,以节约成本为原则,选择梯度2时的浓度最好,此时,加入25μL体系中的TaqDNA聚合酶的用量为0.
2.2　dNTP浓度梯度对PCR结果的影响
结果见图2。
图2显示,6种dNTP浓度对3的扩增效果没有明显的差异,果稍差,2L,此时dNTP0.08mmol/L
1:苏陆克;2:贝新纳尔;3:辣椒杏
图4　不同TaqDNA聚合酶浓度时3个杏品种
PCR扩增结果
Fig.4TheamplificationofPCRwith6different
gradsofconcentrationofTaqDNApolymarsefor3apricotcultivars
2.5　退火温度对PCR结果的影响
结果见图5。
1:苏陆克2:贝新纳尔3:辣椒杏
图2　不同dNTP浓度时3个杏品种的PCR扩增结果
Fig.2TheamplificationofPCRwithdifferent
gradsofdNTPfor3apricotcultivars
2.3　引物浓度梯度对PCR结果的影响
结果见图3。
图3显示,6种引物浓度对3个新疆杏品种的扩增效果具有一定的梯度差异,从梯度1到梯度4扩增效果越来越好,从梯度4到梯度6扩增效果没有明显的变化,说明梯度4时引物的浓度已经可以满足25μLPCR扩增体系的需要,此时上下引物的浓度为0.16μmol/L。
图5显示,不同的退火温度对新疆杏品种的PCR扩增结果差异较大。当退火温度较低时,如梯度1和梯度2,3个新疆杏品种的PCR扩增结果中均出现了非特异性条带;当退火温度较高时,如梯度4、梯度5和梯度6,3个新疆杏品种的PCR扩增结果中的条带较暗甚至消失;而退火温度在梯度3时,3个新疆杏品种均扩出了清晰的2个条带。由此可见,梯度3时的退火温度为扩增新疆杏品种的最优
退火温度,此时的退火温度为52℃。
1:苏陆克;2:贝新纳尔;3:辣椒杏
图5　6种退火温度时3个杏品种PCR扩增结果
Fig.5TheamplificationofPCRwith6different
1:苏陆克;2:贝新纳尔;3:辣椒杏
gradsofconcentrationofTaqDNApolymerase
for3apricotcultivars
图3　不同引物浓度时3个杏品种PCR扩增结果
Fig.3TheamplificationofPCRwithdifferentgradsof
concentrationofprimersfor3apricotcultivars
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山东省肠道病毒71型分离株SDLY 01的基因组扩增和特征分析
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山东省肠道病毒71型分离株SDLY 01的基因组扩增和特征分析01
山东省肠道病毒71型分离株SDLY 01的基因组扩增和特征分析
袁晓晶,温红玲,高峰,许洪芝,司鲁莹,王东旭,赵丽,王志玉. 山东省肠道病毒71型分离株SDLY 01的基因组扩增和特征分析[EB/OL].北京：中国科技论文在线
[].http://www./releasepaper/content/.
导出参考文献
袁晓晶（1986-），女，硕士研究生，研究方向：分子病毒学和传染性疾病流行病学。
温红玲（1977-），女，副教授，研究方向：分子病毒学和传染性疾病流行病学
山东大学公共卫生学院病毒学研究室，山东 济南 250012
实验畸形学教育部重点实验室，山东 济南 250012
山东临沂市人民医院，山东 临沂 276000
摘要：目的 扩增EV71 SDLY01株全基因组序列，了解EV71分离株SDLY 01的基因组特征，为构建感染性cDNA克隆提供基础。方法 采集手足口病患者的粪便标本，将其接种于RD细胞中分离病毒。运用一步法RT-PCR技术分三段对病毒基因组进行全序列扩增，经拼接后运用DNAstar 和MEGA 4软件对序列进行分析。结果 SDLY 01基因组全长7408nt，具有EV71的基因组特征，5′UTR为 745nt，3′UTR为81nt，编码区为6582nt，编码一个2194aa的多聚蛋白。SDLY 01全基因组序列与C4亚型安徽阜阳株（EU703814）具有最高的核苷酸同源性为97.2%。在5′UTR区及结构蛋白P1区，SDLY 01与EV71各亚型的同源性均高于组外对照株。而在非结构蛋白P2、P3区及3′UTR区，SDLY 01与组外对照株G10的同源性高于EV71各亚型（除C4亚型）。对VP1区及3D区构建的系统进化树显示，SDLY 01均位于C4亚型的分支中。经序列比对，在3Dpol第263位出现了氨基酸的突变（I263V）。结论 该分离株为C4亚型，3Dpol第263位氨基酸的突变（I263V）可能与EV71的神经毒力有关。非结构基因在EV71的进化过程中产生了重要的作用。
Research on genome amplification and characteristics of enterovirus 71 strain SDLY 01 isolated in Shandong Province
YUAN Xiaojing
WEN Hongling
XU Hongzhi
WANG Dongxu
WANG Zhiyu
Department of Virology, School of Public Health, Shandong University, Jinan 250012,Shandong,China
The Key Laboratory of Experimental Teratology, Ministry of Education, Jinan 250012, Shandong,China
Linyi People’s Hospital, Linyi 276000, Shandong, China
Abstract： Objective To amplify the genome sequences of an EV71 strain and understand the genome characteristics of SDLY 01, it will provide a basis for constructing an infectious cDNA clone. Methods Stool specimens were collected from a patient with hand, foot and mouth disease. The virus was isolated in RD cells. The full length genome was amplified in three sessions by one step RT-PCR, and the sequences were analyzed by using DNAstar and MEGA 4 software. Results The full length of SDLY 01 was 7408nt, contained 5′UTR 745nt, 3′UTR 81nt, and the coding region 6582nt, encoding a 2194aa polyprotein。The sequence aligements showed that SDLY 01 had the highest nucleotide homology with the Fuyang strain EU703814. It is 97.2%. In regions of 5′UTR and P1, the nucleotide identities between SDLY 01 and EV71 strains were higher than the control strain G10. However, the SDLY 01 nucleotide sequences exhibited the higher homology to G10 than EV71 strains except C4 subtypes in P2, P3 and 3′UTR regions. The phylogenetic analysis based on VP1 and 3D regions showed that SDLY 01 was located in the branch of C4 subtypes. There was an mutation I263V in 3Dpol by amino acid sequence analysis. Conclusion SDLY 01 belongs to C4 subtype. The mutation I263V in 3Dpol may be related to neurovirulence of EV71. The non-structural genes play an important role in the evolution of EV71.
Keywords：
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编号：BTN70804
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品牌：百奥莱博
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3.一步式裂解细菌,不使用强碱溶液,对DNA损伤小。
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5.适用于高拷贝、中拷贝和低拷贝质粒。
使用及效果:
将1个直经为2-5 mm的菌落转移到100 μL溶液A中,充分吹打混匀,转移到离心吸附柱中,用100 μL的通用预洗液和100 μL通用洗柱液各洗一次,最后用20 μLDNA洗脱液将质粒DNA洗脱后待用。
运输及保存:
常温(溶液A需要4℃保存),有效期一年。
关键词：One-Step Single colony Plasmid DNAOUT,一步法单菌落质粒 DNA提取试剂盒,BTN70804
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细菌RNAOUT
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