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■ 热门推荐基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术.“基因敲除细胞 构建过程如下: 第一步:从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞(ES).在培养基中扩增.这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因 . 第二步:构建基因表达载体.取与靶基因序列同源的目的基因.在同源臂上接入neoR等.由于同源臂与靶基因的DNA正好配对.所以能像“准星 一样.
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（15分）基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。“基因敲除细胞”构建过程如下：第一步：从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞（ES），在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”。第二步：构建基因表达载体。取与靶基因序列同源的目的基因（同源臂），在同源臂上接入neoR（新霉素抵抗基因）等。由于同源臂与靶基因的DNA正好配对，所以能像“准星”一样， 将表达载体准确地带到靶基因的位置。第三步：将表达载体导入胚胎干细胞，并与其内靶基因同源重组，完成胚胎干细胞的基因改造。第四步：基因改造后的胚胎干细胞增殖、筛选。请根据上述资料，回答下列问题：（1）在把与靶基因序列同源的目的基因导入受体细胞前，应首先完成&&&&&&&&&&&&&&&&。（2）如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是&&&&&&&&&&&&；若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其处理为&&&&&&&&&&&&细胞。（3）上述资料中neoR基因的作用最可能是&&&&&&&&&&&&。（4）获得的小鼠，通过有性生殖产生的后代是否都含该目的基因&&&&&&&&&&&&。&
【答案】（1）表达载体的构建（2）受精卵&& 感受态（3）作为标志基因，便于筛选（4）否【解析】&
科目：高中生物
来源：学年吉林省吉林一中高二下学期第一次月考生物试卷
题型：综合题
基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA重组原理，用设计好的DNA片段替代动物细胞内的基因片段，从而达到基因敲除的目的。在后基因组时代，研究的重点是利用转基因动物或基因敲除的动物研究基因的功能，运用基因重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法，其基本原理如下图所示。请回答下列问题：（1）在把目的基因导入受体细胞前，应选择一个合适的　　　　　　与之结合，在这一过程中所需要的工具酶是限制性内切酶和　　　　　　&&&&&&　。（2）如果要获得一只含目的基因的小鼠，则一般是通过病毒感染或显微注射技术将目的基因导入受体细胞，选择的受体细胞应该是&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（3）在此类基因操作中，通常可以用水母的发光蛋白作为标记物。水母发光蛋白有发光环，能在一定条件下发出荧光，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是（&&&）A．促使目的基因导入受体细胞中B．促使目的基因在寄主细胞中复制C．使目的基因的转移容易被检测出来D．使目的基因容易表达成功（4）按上述操作获得的转基因小鼠是杂合子，如果想获得一个目的基因纯合的个体，以研究该种动物体内靶基因的功能，应该如何进行下一步实验？&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
科目：高中生物
来源：湖南省长郡中学学年下学期高二学业水平模拟考试（理综）生物部分
题型：综合题
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科目：高中生物
来源：学年湖北省高二下学期期中考试生物试卷
题型：综合题
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科目：高中生物
来源：学年吉林省高二下学期第一次月考生物试卷
题型：综合题
基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA重组原理，用设计好的DNA片段替代动物细胞内的基因片段，从而达到基因敲除的目的。在后基因组时代，研究的重点是利用转基因动物或基因敲除的动物研究基因的功能，运用基因重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法，其基本原理如下图所示。请回答下列问题：（1）在把目的基因导入受体细胞前，应选择一个合适的　　　　　　与之结合，在这一过程中所需要的工具酶是限制性内切酶和　　　　　　&&&&&& 　。（2）如果要获得一只含目的基因的小鼠，则一般是通过病毒感染或显微注射技术将目的基因导入受体细胞，选择的受体细胞应该是&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（3）在此类基因操作中，通常可以用水母的发光蛋白作为标记物。水母发光蛋白有发光环，能在一定条件下发出荧光，现已将这种蛋白质的基因作为生物转基因的标记，在转基因技术中，这种蛋白质的作用是（&&& ）A．促使目的基因导入受体细胞中&&&& B．促使目的基因在寄主细胞中复制C．使目的基因的转移容易被检测出来 D．使目的基因容易表达成功（4）按上述操作获得的转基因小鼠是杂合子，如果想获得一个目的基因纯合的个体，以研究该种动物体内靶基因的功能，应该如何进行下一步实验？&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
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专题一 基因工程练习
一 选择题（每题只有一个正确答案）
1.（2011浙江）将 ada（腺苷酸脱氨酶基因）通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。下列叙 述错误的是（&& ）
A.每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒
B.每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点
C.每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada
D.每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子
2.（2009浙江）下列关于基因工程的叙述，错误的是（&& ）
A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
3.下图为DNA分子的某一片段，其中①、②、③分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是(&&& )
A.DNA连接酶、限制性内切酶、解旋酶
B.限制性内切酶、解旋酶、DNA连接酶
C.解旋酶、限制性内切酶、DNA连接酶
D.限制性内切酶、DNA连接酶、解旋酶
4.有关PCR技术的说法，不正确的是（&& ）
A．PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B．PCR技术的原理是DNA双链复制
C．利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
D．PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA
5．下列关于蛋白质工程的说法，正确的是 (&&& )&
A.蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作
B.蛋白质工程能产生出自然界中不曾存在过的新型蛋白质分子
C.对蛋白质的改造是通过直接改造相应的mRNA来实现的
D.蛋白质工程的流程和天然蛋白质合成的过程是相同的
二 非选择题
6.（2010海南）⑴利用基因工程可以获得转基因牛，从而改良奶牛的某些性状。基因工程的四个基本操作步骤是&&&&&&&&& &&&&&&&&、基因表达载体的构建、&&&&&&&&&&&&&
和&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&。
⑵若要获得的转基因牛分泌的乳汁中含有人干扰素，则所构建的基因表达载体必须包括：某种牛乳腺分泌蛋白基因及其启动子、&&&&&&&& 、&&&&&&&&&& 、&&&&&&&&& 和复制原点等。将该基因表达载体导入受体细胞所采用的方法是&&&& &&&&&&&&&（显微注射法、农杆菌转化法），为获得能大量产生人干扰素的转基因牛，该基因表达载体应导入的受体细胞是
&&&&& &&&&&（受精卵、乳腺细胞）。
7. (2011山东)人类疾病的转基因动物模型常用于致病机理的探讨及治疗药物的筛选。利用正常大鼠制备遗传性高血压转基因模型大鼠的流程如图所示。
⑴图中的高血压相关基因作为____&&&&& ______，质粒作为_____&&& ____,二者需用____& ____切割后连接成重组载体，该过程与质粒上含有___&&& _____有关。&
⑵代大鼠如果________和__________，即可分别在分子水平和个体水平上说明高血压相关基因已成功表达，然后可用其建立高血压转基因动物模型。
8.基因敲除是应用DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。“基因敲除细胞”的构建过程如下：
第一步：从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞（ES），在培养基中扩增。这些细胞中需要改造的基因称为“靶基因”。
第二步：构建基因表达载体。取与靶基因序列同源的目的基因（同源臂），在同源臂上接入新霉素抵抗基因等。由于同源臂与靶基因的DNA正好配对，所以能像“准星”一样， 将表达载体准确地带到靶基因的位置。
第三步：将表达载体导入胚胎干细胞，并与其内靶基因同源重组，完成胚胎干细胞的基因改造。
第四步：基因改造后的胚胎干细胞增殖、筛选。
基本原理如下图所示。
请根据上述资料，回答下列问题：
⑴在把与靶基因序列同源的目的基因导入受体细胞前，应首先完成&&&&&&&&&&&&&& ，在这过程中所需要的工具酶是&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
⑵启动子的化学成分是&&&& &&&&&&，它位于基因的首端，是&&&& &&&&&&识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出 mRNA 。
⑶如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常是&&&&&&&&&&&&&& ，原因是&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。一般可采用&&&&& &&&&&&&&技术将目的基因导入受体细胞。若用大肠杆菌储存目的基因，则需先将其处理为&&&&&&&&&&& 细胞。
⑷上述资料中新霉素抵抗基因的作用最可能是&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
⑸⑶中获得的小鼠，通过有性生殖产生的后代是否都含该目的基因？为什么?
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&。
⑹该项技术具有广阔的应用前景，请试举一例：
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
9.(2008广东)天然酿酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶类，用作发酵原料的淀粉需经一系列复杂的转化过程才能被利用。研究者从某丝状真菌中获取淀粉酶基因并转入酿酒酵母菌，获得的酿酒酵母工程菌可直接利用淀粉产生酒精。请回答下列问题：
⑴将淀粉酶基因切割下来所用的工具是&&&&&&&&&&&& ，用&&&&&&&& 将淀粉酶基因与载体拼接成新的DNA分子，下一步将该DNA分子&&&&&&&&& ，以完成工程菌的构建。
⑵若要鉴定淀粉酶基因是否插入酿酒酵母菌，可采用的检测方法是&&&&&&&&&&&& ，若要鉴定淀粉酶基因是否翻译成淀粉酶，可采用&&&&&&&&&&& 检测或将该工程菌接种在含淀粉的固体平板培养基上，培养一段时间后，加入碘液，工程菌周围出现透明圈，请解释该现象发生的原因。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
10.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：
⑴A过程需要的酶有__________________。
⑵要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必须用&&&&&&&& 处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为&&&&&&&&&&& 态，然后将&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 在缓冲液中混合培养完成转化过程。
⑶含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培养成再生植株要经过[C]&&&&&&&&&& 和[E]&&&&&&&&&&&& 。如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培养基中加入&&&&&&&&&&&&& 。
⑷如想利用分子杂交技术检测再生植株中的抗虫基因是否转录，应该用放射性同位素标记的目的基因作为探针与__________杂交。
11.基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:①目的基因的获取，&&&&&&&&&&&& ，将目的基因导入受体细胞，&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
①通常在第一步和第二步的操作中需要相同的工具酶是&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
②利用PCR技术扩增目的基因的过程中，目的基因受热形成单链并与引物结合，在&&
&&&& 酶的作用下延伸形成DNA。
③采用农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞后，培养该细胞再生成植株的过程中，往往需要使用植物激素，人为地控制细胞的&&&&&&&&&&&&& 和&&&&&&&&&& 。
④如果转基因植物的花粉中含有毒蛋白，将引起的安全性问题包括& &&&&&&&&。
A．生物安全&&& B．环境安全&&& C．食品安全&&& D．伦理道德问题
⑤蛋白质工程的基本原理是：预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的
&&&&&&& 序列→找到相对应的&&&&&&&&&&&&&&&& 序列。
12.科学家通过基因工程，将苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因转入到普通棉株细胞内，并成功的实现了表达，从而培育出了能抗棉铃虫的棉花植株——抗虫棉。其过程大致如下图所示：
(1)基因工程的操作程序主要包括四个步骤，其核心步骤是&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
(2)获取Bt毒蛋白基因的方法有&&&&&& &&&&&&&&&、&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&&等。
(3)Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是利用了T-DNA的&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&&&&&&&&&特点。Bt毒蛋白基因转入普通棉株细胞内并成功实现表达的过程，在基因工程中称为&&&&&&&& &&&&&&&&&&。
(4)将目的基因导入受体细胞的方法很多，在该题中涉及到的方法是&&&&&&&&&&&&& 。
(5)一个基因表达载体的组成必须有&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 等。
(6)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是&&&&&&&&&&&&&&&& 。这需要通过检测才能知道，检测采用的方法是&&&&&&&&&&&&&&&&& &&&。若从个体水平来任何检测？&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
1.C 2.D 3.C 4.D 5.B& 6. ⑴获取目的基因　　将目的基因导入受体细胞& 目的基因的检测与鉴定⑵人的干扰素基因（或目的基因）终止子　标记基因　显微注射法　受精卵
7．⑴目的基因& 运载体& 同一种限制酶& 限制酶识别位点⑵检测到相应蛋白质& 出现高血压
8.⑴基因表达载体的构建& 限制酶和DNA连接酶&& ⑵一段有特殊结构的 DNA 片段　　RNA 聚合酶 ⑶受精卵&& 动物受精卵具有全能性（动物不能象植物那样，利用一个除受精卵以外的独立的体细胞直接培养成完整的个体）显微注射技术&&& 感受态⑷作为标记基因，便于筛选& ⑸否&& 在形成生殖细胞时等位基因（目的基因和靶基因）会发生分离⑹基因治疗、动植物改良、利用动植物生产药物等
9.⑴限制酶（限制性内切酶）&& DNA连接酶& 导入受体细胞⑵DNA分子杂交技术&& 抗原-抗体杂交
该工程菌产生的淀粉酶可分泌到培养基中，水解淀粉后的区域，遇到碘液不变蓝，从而产生透明圈。
10.⑴ (同一种)限制酶、DNA连接酶& ⑵Ca2+& 感受& 将重组质粒和感受态细胞（2分） ⑶脱分化& 再分化 卡那霉素 ⑷mRNA
11.基因表达载体的构建& 目的基因的检测与鉴定 ①限制性核酸内切酶(或限制酶)& ②DNA聚合 ③脱分化& 再分化 ④ABC ⑤氨基酸& 脱氧核苷酸
12.(1)基因表达载体的构建 (2) 从基因文库中获取目的基因、利用PCR技术扩增目的基因 、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成等（任意两个均可）& ⑶可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA分子上转化 (4)农杆菌转化法 (5)启动子、终止子、目的基因和标记基因 （四者缺一不可） (6)目的基因是否插入了受体细胞的染色体DNA分子上& DNA分子杂交技术& 抗虫的接种实验
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&&酿酒酵母基因敲除遇到了问题，求高手指点！
酿酒酵母基因敲除遇到了问题，求高手指点！
如题，最近在做酿酒酵母的基因敲除，目的基因是一段~150bp的nc RNA，利用同源重组原理从pMY17上PCR获得一段两端同源的DNA片段对酵母进行了醋酸锂转化，鉴定时，质粒上的片段是重组上去了，但同时要敲除的目的基因A依然存在，如图所示，是什么情况？如何解决？新手求指导！！金币不多，略表谢意！
未命名.JPG
是双交换的 酵母是单倍体 所以比较迷茫。。。
考虑了这个 所以准备把产物送去测序看看扩出来的序列是不是在设定的位置 不知道是否可行？ 但这个敲除方法包括引物设计都是照着一篇文献上的方法做的 方法较为成熟 同源臂其实挺短的 就是酵母基因组上目的基因前后各约50bp左右，另外各自加上了casette上的约20bp的保守序列构成了扩增转化用的DNA片段的上下游引物。不知我表述是否清楚，
嗯 我是直接转的DNA片段，DNA片段两端分别为目的基因上下游的同源臂，中间替换目的基因的包含抗性基因 NAT，转化后涂的是NAT平板，也是在加了NAT的YPA里摇的。。。
那百分之九十不是这个问题了，我下一步也要做这个，lz加油！分子生物这东西玩的就是不断遇到困难，不断解决困难呀，等待你成功的消息！
我要敲的目的基因位于酵母一染色体端粒区，共不到200bp,经过比对分析，在同一染色体上其下游就有120bp的片段跟它完全一致，所以这个敲除打击了我，让我迷茫不知所措了。。都想放弃了~ 谢谢你，祝成功哈 ~
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