用quant-primer5引物设计教程设计的引物如何预测产物特意的呢

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-08-20 06:47 标签： primer blast验证引物
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【求助】如何应用primer bank设计融合基因的引物呢？
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这个帖子发布于3年零330天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位战友，我最近在进行引物设计，主要是用primer bank 设计。学会了设计单个基因的引物的方法了。但是我们做的实验中会设计到对融合基因的检测。想知道对于融合基因，比如bcr-abl、etv6-runx1、e2a-pbx1来说，应该怎样设计它的引物呢？谢谢各位前辈~~~
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关于丁香园Primer-BLAST:NCBI 的引物设计和特异性检验工具 | 分析技能
来源:联川生物技术公司
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还有10天就到圣诞节啦，有么有一丢丢期待小编的礼物呢~哈哈，把你们的袜子准备好就行了，小编今年要充当一回圣诞老人，给大家送去乃们最喜欢的礼物！然鹅，亲爱的小伙伴们喜欢什么呢？能不能偷偷告诉一下小编，好让小编准备准备，快去微信公众号说出你的心声吧！下面就来看看每周的技能分享吧，希望对你有帮助~一、Primer-BLAST 介绍Primer-BLAST，在线设计用于聚合酶链反应（ PCR）的特异性寡核苷酸引物。 Primer-Blast 可以直接从Blast 主页（ ）找到，或是直接用下面的链接进入http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/这个工具整合了目前流行的 Primer软件（一种引物设计软件），再加上NCBI的 Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用 Blast 进行引物特异性验证。并且，Primer-BLAST 能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。 Primer-BLAST 有许多改进的功能，这样在选择引物方面比单个的用Primer 和 NCBI BLAST 更加准确。二、Primer-BLAST 输入Primer-BLAST 界面包括了 Primer 和 BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分： target template（模板区） , the primers（引物区） , 和 specificity check（特异性验证区）。跟其它的 BLAST一样，点击底部的“ Advanced parameters”有更多的参数设置。1、模板（ Template）在“ PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列， FASTA 格式或直接用 Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。 Primer-BLAST 就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check 区选择）是唯一的。 2、引物（ Primers）如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters 区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check 区选择）。根据需要可设置产物的大小， Tm 值等。3、特异性（ Specificity）在 specificity check 区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了 4 种数据库： RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用 NCBI 的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时， Primer-BLAST 可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种： human, chimpanzee, mouse, rat, cow,dog, chicken,zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。 Nr 数据库覆盖 NCBI所有的物种。三、实例分析用人尿嘧啶 DNA 糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析。 UNG1 的序列长一点（ NM_003362）， UNG2 的序列短一点（ NM_080911，注：拿这两个基因的序列 ClustalW 一下就可以了）。这里用 UNG2 的序列设计引物，选择 RefSeq mRNA database，物种是 Human，其它默认。结果如下图 A-B 所示，设计的引物只能扩增出 UNG2。看上面的图，把“ Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上，出现的结果如下图C 所示，新的引物也可以扩增出 UNG1。
四、Tips1，在任何时候都要优先使用参考序列的 Gi 号或 Accession 号（尽量不要使用 Fasta 格式的序列）。另外，确保你的序列是最新版本的（在填 Accession Number 时后面不加版本号就会自动拿最新的序列）2，就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用Gi号或Accession号（Primer-BLAST 有参数可以设置设计引物的范围，” Form-To”，如上面的第一幅图所示）。因为用Gi号或Accession号， NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。3，尽量使用没有冗除的数据库（如 refseq_rna 或 genome database）， nr 数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。
4，请指定一个或几个 PCR 扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。好啦~今天的技能分享就到这里啦，更多技能分析内容请关注微信公众号查看。我们下期再见哦~记得来领你的圣诞礼物哦~欢迎转载，请注明出处：本文转载自联川生物公众号lncRNA报告全新升级，快来接招！微信公众号回复“报告升级”，即可查看哦~
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