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新型萘酰亚胺类化合物与DNA的作用初探
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番茄抗病基因Ty2的分子标记及其在辅助选择中的应用
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番茄抗病基因Ty2的分子标记及其在辅助选择中的应用
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||||| ||| | |第六章生物化学实验_甜梦文库
第六章生物化学实验
第六章 生物化学实验基本知识主编：齐锦生 编委： 孔德娟 齐锦生 许丽辉 杨崇辉 周秀霞 罗湘衡 君智炜 张晓玲 王芳 实验室要求 一、 实验课的目的 1、加深理解：加深对生物化学基本理论的理解。 2、掌握技术：掌握生物化学的基本实验方法和实验技术（四大基本技术：离心、电泳、层 析、比色）及分子生物学的一些基本技术和方法。 3、培养能力：培养学生的思维能力、动手能力和表达能力。 4、掌握精髓：科学的精髓是实事求是、敢于探索、善于创新的精神，要对实验中出现的一 切反常现象进行讨论，并大胆提出自己的看法。 生化实验室规则和要求 二、 生化实验室规则和要求 1、预习： 课前要预习实验教材，了解实验目的、原理，熟悉操作规程。 2、秩序： 自觉遵守纪律，维护教学秩序，不准迟到、早退，保持安静，严禁谈笑打闹， 听从教师指导，未经教师同意，不得随意离开实验室。 3、整洁： 搞好实验环境和仪器的卫生整洁，实验台面必须保持整洁，仪器药品要井然有 序，公用试剂用毕，应立即盖严放回原处，勿使药品试剂撒在实验台面和地面。实验完毕，需将 药品试剂排列整齐，仪器要洗净倒置放好。固体废物，如滤纸、棉花、血块不得倒入水池中，以 免堵塞下水道； 一般性废液可倒入水池中冲走， 但强酸强碱或有毒有害溶液必须用水高度稀释后， 方可倒入水池中，同时放水冲走，以免腐蚀水管。全体同学由班长安排轮流值日，负责当天实验 室卫生、安全和一些服务性工作，经教师验收合格后，方可离开实验室。 4、节约： 使用仪器、药品、试剂及各种物品必须厉行节约，并节约水电。应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂、乱用和污染。使用和洗涤仪器应小心仔细，防止损坏，贵重 仪器使用前应熟悉使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动，发现故障后应立即报告指导教 师，不要自己动手检修，如有损坏按学校规定赔偿。 5、安全： 注意人身和国家财产安全是至关重要的，要时刻注意防火、防水、防电、防危险品、防事故，以免发生意外。实验室内严禁吸烟。使用乙醚、苯、乙醇、丙酮等易燃品时， 不允许在电炉、酒精灯上直接加热。实验中须远离火源，如有危险发生，应首先关掉电源；有机 溶剂着火时，勿用水泼，以免扩大燃烧面积，可用沙土、灭火器具灭之。用火时必须严格做到： 火着人在，人走火灭。用毕电器后及时切断电源。加热试剂、液体时，管口不要对人，要十分小 心操作，避免灼伤人。实验室内一切物品未经本室负责教师批准，严禁携带出室外，有毒物品尤 其如此。借物必须办理登记手续。1生物化学实验技术概述一、 层析法 层析是利用混合物各组分物理化学性质（如：溶解度、吸附能力、电荷和分子量等）的差别， 使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。 层析系统分为两个相：固定相和流动相。由于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影响 不同，各组分移动速度也各异，从而使各组分得以分离。此法首先用于有色物质的分离，故又称 色层析法。 层析法是近代生物化学最常用的分析法之一，此法可以分离性质极为相似、而用一般化学方 法难以分离的各种化合物，如各种氨基酸、核苷酸、糖、蛋白质等。 层析法有多种类型， 根据所用两组分不同分为以下几类： 吸附层析、 分配层析、 离子交换层析、 凝胶层析和亲和层析等；根据操作方式不同分为：柱层析、薄层层析和纸层析等。吸附层析法： （一） 吸附层析法： 吸附层析法（absorption chromatography）是混合物随流动相通过吸附剂时，由于吸附剂对不 同物质有不同的吸附力而使混合物分离的方法。吸附层析根据操作方式的不同，分为柱层析与薄 层层析两种。 1、柱层析法：柱层析法是用一根玻璃管柱，下端铺垫棉花或玻璃棉，管内加吸附剂粉末，用 一种溶剂润湿后，即成为吸附柱，如图 1 中的（1） 。然后在柱顶部加入要分离的样品溶液，如图 1 中的 （2） 假如样品内含两种成分 A 和 B， 。 则二者被吸附在柱上端， 形成色圈， 如图 1 中的 （3） 。 样品溶液全部溶入吸附柱中之后，接着就加入合适的溶剂洗脱，如图 6-0-1 中的（4） 。A 与 B 就 随着溶剂的向下流动而移动。最后分离情况如图 1 中的（5）所示。图 6-0-1 二元混合物的柱层析示意图 在洗脱过程中，管内连续发生溶解、吸附、再溶解、再吸附的现象。例如，被吸附后的 A 粒 子被溶解（解吸作用）随溶剂下移，但遇到新的吸附剂，又将 A 粒子吸附，随后，新溶剂又使 A2粒子溶解下移。由于溶剂与吸附剂对 A 与 B 的溶解力与吸附力不完全相同，A 与 B 移动的速率 也不同，经一定时间，如此反复地溶解与吸附，而形成两个环带，每一环带是一种纯物质。如 A 与 B 有颜色可看到色层；如样品无色，可用其它方法使之显色，为进一步鉴定，可将吸附柱从管 中顶出来，用刀将各色层切开，然后分别洗脱，现在多采用溶剂洗脱法，即连续加入溶剂，连续 分段收集洗脱剂，直到各成分顺序全部从柱中洗出为止。 最常用的吸附剂是硅胶和氧化铝。硅胶的吸附能力和含水量关系极大，硅胶吸水后，吸附能 力下降，常用于分离非极性的和极性不强的有机物，如甘油脂、磷脂、胆固醇等。 2、薄层层析法：薄层层析法是吸附剂在玻璃板上均匀地铺成薄层，把要分析的样品点加到薄 层上，然后用适当的溶剂展开，而达到分离、鉴定的目的。其优点是：设备简单，操作容易；层 析展开时间短，分离时几乎不受温度的影响；可采用腐蚀性的显色剂，且可以在高温下显色；分 离效率高。 薄板的制备：所用玻璃板表面必须光滑、清洁。 根据制薄板的方法不同薄板可以分为软板和硬板两种。软板即不加粘合剂，将吸附剂干粉直 接均匀铺在玻板上；制作简单方便，但是易被吹散。硬板即用粘合剂如水或其他液体，将吸附剂 调成糊状再铺板，经干燥后才能使用；制备虽然较繁琐，但易于保存。具体制备方法如下： （1）软板：选用一根直径约为 1~1.2cm 的玻璃管，根据薄层的厚度在玻璃管两端缠几圈胶 布，胶布的厚度按需要的薄层厚度而定。常用的厚度约为 0.4~1mm 左右。把干的吸附剂倒到玻璃 板上，玻板的一端固定，防止推玻璃管时玻板移动，然后将玻璃管压在玻板上，把吸附剂由一端 推向另一端，即成薄板。要求：光滑、平整、厚度均匀。 （2）硬板：将适当调好的吸附剂倒在两块 3mm 玻板中间所夹的一块 2mm 厚度的玻板上， 然后用一块边缘光滑的玻片把吸附剂刮向一边，即成厚度一定的薄板。下面介绍氧化铝和硅胶硬 板的制备方法。 氧化铝硬板：称取氧化铝 G25g（G 表示石膏，这种氧化铝中含 5%锻石膏） ，加水 25ml，在 烧杯中调成糊状，铺层，先在空气中干燥，后置于 200~220℃烘箱中烤 4 小时即可使用。 硅胶硬板：称取硅胶 G30g，加水 60~90ml，在烧杯中调成均匀糊状，立即铺层，室温内干 燥后置烘箱中烘干。此外，也可用淀粉或羧甲基纤维素钠（CMC）作粘合剂制板。 薄层层析的操作步骤是：点样、展开、显色。（二）分配层析： 分配层析： 分配层析是利用混合物在二种或二种以上的不同溶剂中的分配系数不同而使物质分离的方 法。如用带水的材料（载体）作为液相（固定相） ，加入与水不相混合或仅部分混合的溶剂（流动 相） ，则混合物各组分在两相间发生不同的分配现象而逐渐分开，形成色层。3载体在分配层析中只起负担固定相的作用，它们是一些吸附力小、反应性弱的惰性物质，如 淀粉、纤维素粉、滤纸等。固定相除水外，还有稀硫酸、甲醇、仲酰胺等强极性溶液。流动相则 采用比固定相极性小或非极性的有机溶剂。纸层析是最广泛应用的一种分配层析。 纸层析法以滤纸为载体，滤纸上吸附着水（约含 20%―22%）是经常用的固定相，此类有机 溶剂如醇、酚等为常用的流动相。把欲分离的物质加在纸的一端，使流动溶剂经此移动，这样就 在两相间发生分配现象。由于物质分配系数的不同，就逐渐在纸上集中于不同的部位。在固定相 中分配趋势较大的成份，随流动相移动的速度就慢；反之，在流动相分配趋势较小的成分，移动 速度就快。物质在纸上移动的速度可以用 Rf 表示： 色斑中心至原点中心的距离 Rf = ────────────── 溶剂前缘至原点中心的距离 物质在一定溶剂中的分配系数是一定的，故移动速率（Rf 值）也恒定，因此，可以根据 Rf 值来鉴定被分离的物质。 纸层析法按操作方法分成两类，即：垂直型和水平 型。 垂直型是将滤纸条悬起， 使流动相向上或向下扩散； 水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩 散。 垂直型使用较广，按分配物质的多寡，将滤纸截成 长条，在某一端距边缘 2~4cm 处点样，待干后，将点样 端边缘与溶液接触，在密盖的玻璃缸内进行展开见图 6-0-1图 6-0-2 垂直纸层析 上述方法只用一种溶剂系统进行一次展开， 称为单向层析。如果样品成分较多，而且彼此的 Rf 值相近，单向层析分离效果不佳，可用双向层 析法，即在长方形或方形滤纸的一角点样，卷成 圆筒形，先用第一种溶剂系统展开，展开完毕吹 干后转 90?，再放于另一种溶剂系统中，向另一 方向进行第二次展开， 如此各成分分离较为清晰。 见图 6-0-3图 6-0-34（三）离子交换层析： 离子交换层析： 离子交换层析法（ion exchange chromatography IEC）是利用离子交换剂对需要分离的各种离子有不同的亲和力而达到分离的目的，这种柱层析称为离子交换层析。 离子交换剂是通过化学反应将带电荷基团引入惰性支持物上而形成。 离子交换作用是指一溶 剂中某一种离子与一固体中的另一种具有相同电荷的离子进行相互位置的调换。由于各种离子所 带电荷的多少不同，它们对交换剂的亲和力就有所差别。因此，在洗脱过程中，各种离子由固体 柱上先、后下来的顺序不同，从而可达到分离的目的。这种离子交换是定量完成的，因此测定溶 液中由固体上交换下来的离子量，可知样品中原有离子的含量，也可将吸附在交换剂上的样品的 成分用另一洗脱液洗脱下来，进行定量测定。 离子交换层析主要用于蛋白质、多肽的分离。核酸也是强极性分子，用离子交换层析也能得 到很好的分离效果。 离子交换剂种类很多，根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，可分为阳离子交换剂和阴离 子交换剂；根据惰性支持物不同，又有树脂、纤维素、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶及琼脂糖凝 胶等种类。目前大多采用的离子交换剂是合成离子交换剂，即离子交换树脂，其分为两大类：分 子中具有酸性基团，能交换阳离子的称为阳离子交换树脂；分子中具有碱性基团，能交换阴离子 的称为阴离子交换树脂。按其解离性的大小，又可分为强弱两种：磺酸基 （－SO3H） 强酸性 阳离子交换树脂 弱酸性 强碱性 阴离子交换树脂 弱碱性 酚羟基（－OH） 羧基 （－COOH） 季胺基 （－NR4） 伯胺基 （－NH2） 仲胺基 （－NHR） 叔胺基 （－NR2）交换反应举例如下： R-SO3 H+ + M+X－ － － ＋R-SO3 M＋ -+ X H+－ ＋ -R4≡N OH + H X＋ －＋ －R4≡N X+ H OH离子交换树脂的交换容量与其结构有关，这直接关系到合成过程。离子交换树脂主要是根据 有机化学反应（如硝化、磺化、氯甲基化和胺化等）及高分子合成反应（如聚合及缩合）的基本 原理进行合成的。离子交换剂的母体聚合物有苯乙烯、酚醛及丙烯酸等。常见的聚苯乙烯树脂由 苯乙烯聚合，再加入二乙稀交联：（方程式 1）插入附件 1 ）5在这个母体上引进功能基就得到各种离子交换树脂，如制备强酸性阳离子树脂 时，即将母体加以磺化：（方程式 2）插入附件 2 ） 制备强碱性阴离子交换树脂时，先将母体甲基化后，再加以胺化，即得： （方程式 3）插入附件 3 ）这里， 树脂中二乙烯苯的含量决定了树脂的交联度大小， 应尽量选用交联度高些， 而且有较高的交换容量的树脂。树脂交换容量的单位为毫克当量/克（干树脂）或者 毫克当量/毫升（湿树脂） 。测定树脂的交换容量方法：阳离子交换树脂：首先，用氢 氧 化 钠 溶 液 通 过 已 转 型 为 氢 型 的 树 脂 ， 将 H+ 替 换 出 来 ， 其 反 应 式 ： R－SO3H+NaCl R－SO3Na+HCl再用酸碱滴定法测定流出液中盐酸的当量数，即可计算交换容量，即： HCl+NaOH→NaCl+H2O 而测定阴离子交换树脂交换容量的反应则为： R4NOH+NaCl R4NCl+NaOHNaOH+HCl→NaCl+H2O 离子交换纤维素是 30 年来广泛用于分离纯化蛋白质的离子交换剂。目前常用的 离子交换纤维素列于下表：6（表 1）目前常用的离子交换纤维素 ）离子交换剂 游离基团 阴离子交换剂 强碱性 TEAE GE QAE-Sephadex 三乙基氨基乙基 胍基乙基 二乙基（2-羟丙基）季胺 -OCH2CH2N（C2H5）3 NH -OCH2CH2NHC---NH2 -C2H4N+ (C2H5) 2 CH2CHCH3 弱碱性 DEAE PAB 中等碱性 AE ECTEOLA DBD BND PEL OH - OCH2CH2N（C2H5）2 结构二乙基氨基乙基 对氨基苯甲基氨基乙基 三乙醇胺经甘油和多聚甘油链偶联于 纤维素的混合基团（混合胺类） 苯甲基化的 DEAE 纤维素 苯甲基化萘酰化的 DEAE 纤维素 聚乙烯亚胺吸附于纤维素或较弱磷酰 化的纤维素 阳离子交换剂 羧甲基-OCH2CH2N H2弱碱性 CM 中等酸性 P 强酸性-OCH2C OOH O -O--P―OH OH O磷酸SE磺酸乙基-OCH2CH2--S―OH O OSP- Sephadex磺酸丙基 -OC3H6--S―OH O常用离子交换树脂某些物理化学性质表 （表 2）插入附件 4 ---1、2、3 ） 、 、 各类常用离子交换树脂型号对照表7（表 3）插入附件 5 ） 离子交换介质在纯化步骤中的选择 （表 4）插入附件 6 ） 离子交换层析介质的技术数据 (表 5) 插入附件 7―1、2 表 、（四）凝胶层析（分子筛层析） 凝胶层析（分子筛层析） 凝胶层析（gel filtration）又称分子筛层析、排阻层析或凝胶渗透色谱，主要是根据混合物 中各种分子的分子量不同，通过固定相凝胶时，分子的扩散速度各异，使大小不同的分子得到分 离和纯化。它不仅用于大分子物质的分离，也可用于分子量测定以及蛋白质样品除盐等。 所谓凝胶是一类具有三维空间多孔性的网状结构物质。在洗脱过程中，分子量最大的物质由 于不能进入凝胶网孔而沿凝胶颗粒间的空隙而最先流出；分子量最小的物质因能钻入网孔而受阻 滞，流速缓慢，而最后流出；分子量介于最大和最小之间的物质，流出的顺序在最大分子量物质 之后，而在最小分子量物质之前。所以，各组分的洗脱顺序与其分子量成正比。 （图 6-0-4）插入附件 8 ） 凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，是含有大量液体的柔软而富于弹性的物质。吸水量 凝胶 大于 7.5g/g 的凝胶称软胶，吸水量小于 7.5g/g 的凝胶称为硬胶。根据凝胶物质的来源可分为天然 凝胶和人工合成凝胶两类。 １、天然凝胶：主要是一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。 淀粉凝胶应用较早，但因其理化性质不够稳定，洗脱时的阻力较大，洗脱时间长等缺点影响 了它的应用。 琼脂来源于一种海藻，是由 D-半乳糖和 L-半乳糖所组成的多聚糖。它能分离分子量较高的 物质。其缺点是带有大量的电荷（主要是磺酸基，其次为羧基） ，层析时常需用较高离子强度的洗 脱液，使洗脱物含有一定量盐分，而影响产品的纯度。 琼脂糖凝胶（sepharose）应用较多，它又称生物凝胶Ａ（biogel―A） ，由琼脂糖溶液冷却后， 通过分子间氢键， 自发凝集成束， 形成稳定的珠状凝胶。 稳定性较差， 工作 pH 值范围在 4~9 之间，40℃以上易老化，不能高压和冰冻，其机械强度取决于琼脂糖的含量。它有 2B、4B、6B 三个级别，含琼脂糖的浓度分别为 2%、4%、6%。Sepharose 结构开放，排阻极限比 Sephadex 大， 分离范围广泛，适用于 DNA 大片段分离。各种型号琼脂糖凝胶的的性质及生产厂商见下表。8（表 6）琼脂糖凝胶的技术数据 ） 凝胶内琼脂 含量 （ 糖%含量 W/ W） ） 10 8 6 4 210 8 6 4 2 1名称、 名称、型号 Sagavac Sagavac Sagavac Sagavac Sagavac 10 8 6 4 2排阻的下限 (Mr) 2.5×10 × 5 7×10 6 2×10 15× 6 15×10 6 150× 150×10 6 0.5× 0.5×10 6 1.5× 1.5×10 6 5×10 6 15× 15×10 6 50× 50×10 150× 6 150×105分级分离的范围 （Mr） ） 1×10 ∽ 2.5×10 × 2.5×104 ∽ 7×105 × 4 6 5×10 ∽ 2×10 5 15× 6 2×10 ∽ 15×10 5 7 15× 5×10 ∽ 15×10 4 6 &1×10 ∽ 2.5×10 × 4 6 &1×10 ∽ 7×10 4 6 1×10 ∽ 2×10 4 6 15× 4×10 ∽ 15×10 5 6 15× 1×10 ∽ 15×10 6 6 15× 1×10 ∽ 15×104 5生产厂商 Seravac Laborato ries ,Mai denhead, EnglandBio-Pad Laboratori es,Californ ia,U.S.ABio-GelA-0.5M Bio-GelA-1.5M Bio-GelA-5M Bio-GelA-15M Bio-GelA-50M Bio-GelA-150M2、人工合成的凝胶：常用的有葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。 葡聚糖凝胶又称交联葡聚糖凝胶，英文名称为 Dextrak，商品名称为 Sephadex，由许多右旋 葡萄糖单位通过 1,6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂 1-氯-2,3-环氧丙烷（CH2-CH-CH2CL， 又称氯醇）交联而形成多孔网状结构高分子化合物。其基本结构如图： （ 图 5)插入附件 9 插入附件在合成凝胶时，调节葡聚糖和交联剂的配比，可以获得具有不同大小网眼的葡聚糖凝胶。G 表示交联度，G 越大，网孔结构越紧密，吸水性差，膨胀也小，适用于分离小分子物质；G 越小， 网孔结构疏松，吸水量大，适用分离大分子物质。商品凝胶的型号采用“吸水量”的 10 倍数字表 示，例如，每 g 凝胶吸水量为 2.5g 即定为 G―25 型。各种型号葡聚糖凝胶的性质见下表。 （表 7）各种型号葡聚糖凝胶的性质 ）型号 分离范围（分子量） 分离范围（分子量） 蛋白质 G--10 G―15 G―25 G―50 G―75 G―100 G―150 G―200 &700 &∽
多糖 &700 &∽ 100∽∽ 500∽∽
吸水量 g/g 干凝胶 1.0±.01 ± 1.5± 1.5±0.2 2.5± 2.5±0.2 5.0± 5.0±0.3 7.5± 7.5±0.5 10± 10±1.0 15± 15±1.5 20± 20±2.0 膨胀体积 ml/g 干凝胶 2 ∽3 2.5∽ 2.5∽3.5 4 ∽6 9∽11 12∽ 12∽15 15∽ 15∽20 20∽ 20∽30 30∽ 30∽40 浸泡时间（小时） 浸泡时间（小时） 20--250 3 3 3 3 24 72 72 72 90-- 1 1 3 5 5 5由上表可见，Sephadex―G 值越大，吸水量越大，分离范围（分子量）越大 聚丙烯酰胺凝胶其商品名为生物凝胶 P（Bio-Gel P） ，是用丙稀酰胺（acrylamide，简称 Acr） 和交联剂亚甲基双丙烯酰胺（N，N@―methylene bisacrylamide，简称 Bis）在催化剂的作用下 聚合而成。其结构式如下：9（方程式 4） ） 张龙翔 P90聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种： （1）化学聚合：催化剂多采用过硫酸铵（ammonium persulfare，AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为 N，N，N@，N@―四甲基乙二胺（N，N， N @ ， N @ ― tetramethyl ethylenediamine ， TEMED ） 其 次 为 三 乙 醇 胺 及 二 甲 氨 基 丙 腈 ，（3-dimethylaminopropionitrile,DMPN） 。在叔胺的催化下，由过硫酸胺形成氧的自由基，后者 又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。因为叔胺要处于自由碱状态下才有效，所以在低 pH 时，常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用，一些金属也能抑制聚合。冷却可 以使聚合速度变慢，通常控制这些因素使聚合在一小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。 （2）光聚合：通常用核黄素作催化剂，不一定加 TEMED 即能聚合，但加入则可加速聚合。 光聚合通常需要有痕量氧存在，核黄素经光解形成无色基，后者被氧再氧化形成自由基，从而引 发聚合作用，但过量的氧会阻止链长的增加，应该避免过量的氧存在。光聚合通常用日光灯或普 通钨丝灯泡作光源，直接日光或室内强散射光也可以。 用核黄素进行光聚合的优点是：①核黄素的用量很低（1mg/100ml） ；②通过光照可以预定聚 合时间，但光聚合的凝胶孔较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔凝 胶较适合。化学聚合的凝胶孔径较小，因而采用过硫酸胺―TEMED 催化系统制备小孔凝胶（分离 胶） ，而且各次制备的重复性好。 凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系：凝胶浓度与被分离物的分子量大小的关系，大至范围 如表： (表 8) Mr 范围与凝胶浓度的关系 表 Mr 的范围 蛋白质 4 &10 4 1 ∽4×10 4 5 4×10 ∽1×10 5 1 ∽5×10 &5× 5 &5×10 核酸 4 &10 4 5 10 ∽10 5 6 10 ∽2×10 适用的凝胶浓度% 适用的凝胶浓度 20∽30 ∽ 15∽ 15∽20 10∽ 10∽15 5∽10 2∽ 5 15∽20 ∽ 5∽10 ∽ 2∽2.6 ∽聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性、透明、相对的化学稳定，对 pH 和温度变化较稳定， 在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改10变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及 不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。（表 9）聚丙烯酰胺凝胶的技术数据 ）型号 Bio-gel-P-2 Bio-gel-P-4 Bio-gel-P-6 Bio-gel-P-10 Bio-gel-P-30 Bio-gel-P-60 Bio-gel-P-100 Bio-gel-P-150 Bio-gel-P-200 Bio-gel-P-300 排阻的下 限（Mr） 00
000 300000 分级分离的范围 （Mr） 200―------------------00---00---000---400000 膨胀后的床体积 ml/g 干凝胶 3.8 5.8 8.8 12.4 14.9 19.0 19.0 24.0 34.0 40.0 所需最少时间 室温，小时） （室温，小时） 2---4 2---4 2---4 2---4 10---12 10---12 24 24 48 48下面几张表列出凝胶层析介质的一些性能指标，供读者参考。 表 10 各种凝胶所允许的最大操作压 凝胶 Seohadex G-10 G-15 G-25 G-50 Seohadex G-75 Seohadex G-100 Seohadex G-150 Seohadex G-200 Bio-Gel P-2 P-4 P-6 P-10 P-30 P-60 Bio-Gel-P-100 Bio-Gel-P-150 Bio-Gel-P-200 Bio-Gel-P-300 Sepharose 2B 4B Bio-Gel A-0.5M A-1.5M A-5M Bio-Gel A-15M Bio-Gel A-50M Bio-Gel A-150M * 每 cm 凝胶浓度 **** 建议的最大静水压（ 建议的最大静水压（cmH2O） ）**100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 50(49.03 Pa) 35(34.32 Pa) 15(14.71 Pa) 10(9.806 Pa) 100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 60(58.83Pa) 30(29.42Pa) 20(19.61Pa) 15(14.71Pa) 1*(0.9806Pa) 1(0.9806Pa)*100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 100(98.06Pa) 90(88.25Pa) 50(49.03Pa) 30(29.42Pa)cmH O=0.9806Pa 1 cmH2O=0.9806Pa11）见附件 （表 11、 见附件 10 、 ） （表 12）见附件 11---1、2 ） 、下面介绍几种染料的性能及染色原理： 1、氨基黑 10B（amino black 10B） C22H13O12N6S3Na3, Mr=715, λmax=620~630nm。 氨基黑是酸性染料， 其磺酸基与蛋白质反应 构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染 SDS-蛋白质时效果不好。另外，氨基黑染不 同蛋白质时的着色度不等、色调不一（有蓝、黑、棕等） ，作同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要 对各种蛋白质作出本身的蛋白质染料量（吸收值）的标准曲线。（方程式 5） ） 插入分子式 张龙翔 P912、 考马斯亮蓝 G250， 又名 Xylene brilliant cyanin G。 比考马斯亮蓝 R250 多二个甲基。 Mr=854, λmax=590~610nm。染色灵敏度不如 R250，但比氨基黑高 3 倍。优点在于它在二氯乙酸中不溶 而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作 定量分析。 3 、 考 马 斯 亮 蓝 R250 （ Coomassive brilliant blue R250 ） C45H44O7N3S2Na, Mr=824, λ ， max=560~590nm。染色灵敏度比氨基黑 5 倍，但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染 色不合乎 Beer 定律，用作定量分析时，要注意这点。 （方程式 6） ） 插入分子式 张龙翔 P924、1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalene sulfonic acid，ANS）本身无荧光，但与蛋白 质结合后则产生荧光。将凝胶放在此染料溶液浸 1~3 分钟，用长波紫外灯照射时，产生黄色荧光， 可显示蛋白质 100μg，如果不明显，可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在 3mol/L 盐酸 中几秒至 2 分钟，使表面蛋白质稍变性，然后再用 ANS 染色，这样可显示蛋白质 20μg。 这样的染色优点是可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。可将该区带切下来进行酶活力测定； 也可直接把凝胶捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙稀酰胺不影响抗体的产生。（五）亲和层析法： 亲和层析法： 生物体中许多高分子化合物具有与某些对应的专一分子可逆结合的特性，例如，酶、蛋白与 辅酶，抗原与抗体、酶与酶抑制剂、激素与受体等体系，都具有这种特性。生物高分子与配体之 间形成可解离的专一络合物的能力称为亲和力。根据这种具有亲和力的生物高分子与配基间可逆12性结合和解离的原理而建立的层析技术称为亲和层析（affinity chromatography） 。 亲和层析的优点是：在温和条件下进行，操作简单，效率高。亲和层析在分离、纯化的效率 上可以说是最佳的方法。亲和层析是由吸附层析发展起来的，它相对于建立在物理化学原理（如 分子颗粒大小、分子带电荷状况等）的分离方法而言，可称为“生物专一吸附”的层析分离方法。 在亲和层析过程中，被分离的生物分子在一定条件下，有选择性地即高度特异性地被结合到共价 偶联的不溶性载体的配基亲和吸附剂上，然后改变原有条件，如选用竞争性抑制剂、底物、辅助 因子，或采用不同 pH 的缓冲液、高浓度盐，变性剂等，又可有选择性地从亲和吸附配基上把要 分离的物质洗脱下来。通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可提高几倍、十几倍甚至几 百倍，活化回收率也是非常高的。 亲和层析法的基本过程如下： 亲和层析法的基本过程如下： 1、偶联：将欲分离的高分子物质 X（如抗原）的配基 L（如抗体）在不影响其生物功能的 情况下与水不溶性的载体相结合（称为固相化或固定化） ，制成亲和吸咐剂或免疫吸附剂。 2、装柱：在层析柱内装入固相化的配基―亲和吸附剂（称为亲和柱） 。 3、亲和吸附：含有高分子物质 X 的混合液（如粗匀浆提取液或血清等） ，在有利于配基和 高分子之间形成复合物的条件下，进入亲和吸附剂的层析柱。混合液中只有能与配基形成复合物 的高分子 X 被吸附，而所有不能形成复合物的杂质则直接流出。亲和柱进一步用缓冲液洗涤，以 尽可能地除去非亲和吸附的物质。 4、洗脱：改变洗脱条件，促使亲和吸附剂―高分子复合物解离而释放出高分子的物质 X， 便得到欲纯化的活性物质。 5、再生：将欲分离、纯化的生物大分子从亲和吸附剂中洗脱的过程，就是再生的过程。再 生后的亲和吸附剂可直接用于又一周期的纯化工作。 用亲和层析法分离大分子化合物可用下图表示： （图 6、7） 、 ） 张龙翔 P372从理论上说，亲和层析可以用来纯化各种酶、抗原、抗体、维生素结合蛋白、传递蛋白、激 素和药物的受体、核酸、多酶系统以至完整的细胞。 固定化的配基也可用来探讨生物体内大分子和配基间的作用方式。 这种固相吸附剂还可作为 生物大分子的结构与功能研究的工具。 下面对亲和层析法中的几个需要注意的问题进行分析讨论： 下面对亲和层析法中的几个需要注意的问题进行分析讨论： 首先，载体的选择。 使亲和物一方固相化的水不溶性化合物称为载体。其应具备下述特性：1、高度亲水。使固 相吸附剂易与水溶液中的生物高分子接近。2、惰性载体。载体的非专一性吸附应尽可能小。3、 具有相当量的化学基团可供活化或化学改变。4、有较好的物理和化学的稳定性，能经得起配基固 定化和亲和柱层析时可能采用的各种条件（如 pH、离子强度、温度、变性剂和去污剂）的影响。 5、具有多孔的网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过，从而增加配基的有效浓度。6、有13良好的机械性能，为使亲和柱有较好的流速，载体最好是均一的珠状颗粒。 常用的载体有纤维素，聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶。 （表 13）珠状凝胶分离范围 ） 珠状凝胶 琼脂糖: 琼脂糖 Sephaarose 2B Sephaarose 4B Sephaarose 6B 聚丙烯酰胺: 聚丙烯酰胺 Bio-gel-p-300 Bio-gel-p-150 分离范围（Mr） 4×107 × 3×107 × 4×106 × 5×105 × 1.5×105 ×其次，配基的选择。 作为理想的配基，它首先必须对欲纯化的大分子具有很高的亲和力。另外，小分子配基必须 具备可修饰的功能基团，通过这些基团与载体形成共价键。这些共价键的形成应不致严重地损害 配基与欲纯化蛋白质的亲合力，用于亲和层析的配基有酶的底物类似物、效应物、酶的辅助因子 及抗体（或抗原）等。 第三，几种类型的免疫吸附剂。 把抗原或抗体用共价键或其它方式连接在固相载体上， 用以分离和纯化相应的抗体或抗原的 方法称为免疫吸附法，固相化的抗原或抗体称为免疫吸附剂，根据载体的性质不同，配基和载体 的连接方式大体可分为三种类型。 1、使配基吸附在某些载体的表面。常用的载体有皂土、玻璃粉（或微球） 、石英粉、羟基磷 灰石、氧化铝、硬脂酸钡等。其优点：操作简单，条件温和。其缺点：吸附不稳定而影响被分离 物质的纯度。 2、使配基网络在某些载体化合物的网状结构中。常用的载体有聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、 交联葡聚糖凝胶等。此方法使用的条件也很温和；只要凝胶的交联度和配基分子大小选配合适， 就可得到效果很好的免疫吸附剂。 3、使配基通过共价键和载体结合。常用的载体有琼脂糖、纤维素交联葡聚糖、聚丙烯酰胺 及多孔玻璃等，此种方法适用于大分子化合物及小分子化合物。由于与载体化学的结合，因此增 强了配基对 pH、离子强度及温度耐受力。它也是目前亲和层析方法中最广泛采用的一种类型。 4、使用偶联剂直接把配基的许多分子彼此连接起来。这样的偶联剂有戊二醛、氯甲酸乙酯， 乙基丁烯二酸酐，环已基碳二亚胺等。但如果条件掌握不好，很易引起生物大分子的失活。 第四、亲和层析条件的选择 1、吸附：生物大分子的亲和纯化最好采用柱层析法。亲和柱所用的平衡缓冲液其组成、pH 和离子强度都应选择配基与生物大分子之间的作用最强、最有利于形成复合物的条件。上柱的样 品应该溶于亲和柱的平衡缓冲液中，并在上柱前对缓冲液透析平衡。 2、洗涤：样品通过亲和柱后，连续用大量缓冲液洗去无亲和力的生物大分子，且还常用不 同的缓冲液洗涤，这样可进一步除去非专一吸附的物质，而在亲和柱上只留下有专一作用的亲和 物。143、洗脱：洗脱正好与吸附相反，所选取的条件应该能减弱纯化对象与吸附柱之间的相互作 用，使得复合物完全解离。通过改变缓冲液的条件，如改变 pH、离子强度、有机溶剂的浓度等， 有选择性地从载体上把被分离物洗脱下来。 4、亲和柱的再生：当洗脱结束后，连续用大量洗脱剂彻底洗涤亲和柱，然后再用平衡缓冲 液使亲和柱充分平衡，经过这样处理，亲和柱可反复使用。 下面各表列出一些亲和层析介质的技术数据，供读者参阅。 （表 14） ） 张龙翔 P503―507（十三）亲和层析介质的技术数据 1―6。综上所述，五种层析技术在分离各种化合物时各有其优越之处，也有不足之处。因此，应根 据具体分离化合物的种类及要求，选择不同的层析方法及层析介质，以达到迅速、准确地分离目 的。现就如何选择层析介质，列表如下，供读者参阅。（表 15） ）张龙翔 P497（七）如何选择层析介质。 P498 按纯化步骤选择层析介质。16） （表 16）二、比色和分光分析法（孔德娟） 比色和分光分析法（孔德娟） （一）原理 光线的本质是电磁波的一种，有与电磁波和 X 线类同的性质。光线有不同的波长，肉眼可见 彩色光称为可见光，波长范围在 400~750nm，小于 400nm 的光线称为紫外线，大于 750nm 的光线 称为红外线，如表所示。17） （表 17）见书 P19当光线通过透明溶液介质时，其辐射能量一部分被吸收，一 部分被透过，所以光线射出溶液介质之后，光能减少。例如，可 见光通过有色溶液介质后，或红外线通过多种气体后均被吸收部 分光能。这种光能的吸收和透过可用于某些物质的定量分析。15分光分析所依据的定律是 Lambert 和 Beer 定律 1. Lambert 式定律：一束单色光通过透明溶液介质时，光能被吸收一部分，被吸收光能的 量与溶液介质厚度有一定比例关系。见图 6-0-811即：dI = IaldI - adl 将此式积分得： = 10adl∫10I∫I=I0e ……………………………………………(1)式式中 I0 为入射光强度 I 为通过溶液介质后的光强度 l 为溶液介质的厚度 е为自然对数的底 2.718 a 为溶液介质的吸收系数 （1）式可改写为:I0 Ln ― = al…………………………（2）式 I（2）式换算成常用对数式， 即：I0 Ln ―×0.3×al II0 10g ― =0.4343×al II0 则 10g ― = kl…………………………（3）式I 式中 K 为吸光系数。162. Beer 定律： 以溶液中溶质浓度的变化代替溶液厚度的改变，光能的吸收与浓度改变有 类同的关系。即一束单色光通过溶液介质时，光波被溶液介质吸收一部分，吸收多少与溶液中溶 液介质浓度有一定比例关系。依据 Lambert 氏定律中同样的推导，可得出下式：I0 10g ― ＝kc……………………………………(4)式 I式中 c 为溶液介质的浓度。 Lambert 定律与 Beer 定律合并， 即(3) 和(4) 式合并为：I0 10g ― = kcl…………………………………(5)式 II0 令 A=10g ― I ，I0 T= ― I则 A=kcl ……………………………………（6）式 A=-10T式中 A 为 光密度（又称吸光度） T 为透光度。 ， （6）式为 Lambert-Beer 定律的物理表示式，其含义为：一束单色光通过溶液后，光能被吸收一 部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。（二）光电比色法 利用溶液的颜色深浅来测定溶液中物质含量的方法，称为比色法。用光电池和检流计代替眼 睛进行比色分析，又称光电比色法。光电比色法测定的条件是在可见光范围，并要求测定为有色 物，或经过一定的化学处理使无色的测定物质变成有色化合物或者使其所处的溶液变成有色液， 与经同样处理的已知浓度的标准液在光电比色计上进行比色，求出各自的光密度（吸光度） ，经计 算即可求出被测物的含量。 比色分析较常见的仪器为光电比色计和分光光度计。（三）分光光度法 采用适当的光源、棱镜和适当的光源接受器。可使介质浓度测定范围不仅仅局限于可见光， 尚可扩大到紫外光区和红外光区。经单色器（棱镜）得到的光源虽说不是纯的单色光，但波长范 围更狭窄，也更符合 Lambert-Beer 定律，使灵敏度大为提高。 以不同波长的单色光作为入射光，测定某一介质溶液的光密度。然后以入射光的不同波长为17横轴，各相应的光密度为纵轴作图，可得到溶液介质的吸收光谱曲线。不同的物质，分子结构不 同，其吸收曲线也有其特殊形状，许多动、植物组织中所含组分用化学方法不易分离， ，此组分可 借助于分光光度法测定出不同的光谱曲线，用于确定几种组分的性质和含量，此法的优点是光电 比色法不可 比拟的。由于分光光度计波长范围较大（200~1000nm） ,故既可用于可见光，也可 用于紫外光或红外光的分光测定。 又由于分光光度法可利用物质特有的吸光谱曲线进行定性定量， 因此，测定物质既可为有色物，也可是无色物，从而使测定手续简化，标本用量也可减少。 目前，学生实验室多用 722 型或 UV-9100 型分光光度计，其基本结构如图 所示： （图 6-0-9）图 9 722 型分光光度计结构示意图 此仪器的最大特点为受光器不是光电池,而是光电管。光电管的阴极表面（光电面）有一层 对光灵敏的物质，当光射到光电管后，会发射出光电子，此光电子向阳极移动，形成光电流。光 电管灵敏度虽比光电池小，但经光电管出来的光电流可以放大，而经光电池出来的光电流不易放 大，并且光电池易疲乏，故较高级的分光光度计均采用光电管作为出射光线受光器。 722 型分光光度计的使用方法：接通电源, 打开比色箱盖，使检流计指针处于”0”位，预热 10 分钟，用波长调节器选用所需的波长。 将空白或对照液及测定液分别装入比色杯内，擦干后置于比色盒中，再放入比色箱内，放 妥盖好。此时空白溶液对在光路上，光电管感光。旋转光量调节器，使检流计指针正确地指在透 光度“100%”或光密度“0”上。 轻轻拉动比色槽滑杆，使其他比色杯依次处于光路上，同时光密度。 使用时可根据不同波长、光量分别选用放大器灵敏度挡，使空白液能很好地用光量调节器 使光密度调整到“0” 。其灵敏度范围是 第一挡×1 倍，第二挡×10 倍，第三挡×20 倍。 （四）计算181．利用标准管计算被测物含量：用已知浓度的标准物与测定管同样处理，读取光密度，再 根据（6）式计算： A1=k1c1l1 A2=k2c2l2 式中 A1、 A2 分别为已知浓度标准管和未知浓度测定管光密度。 C1 、c2 分别为已知浓度标准管和未知浓度测定管测定物浓度。 因盛标准液和测定液的比色皿内径相同（l1=l2）, 故上二式可写成： A1/k1c1=A2/k2c2 因标准液和测定液中介质为同一物，故 k 相同，即：K1=k2 2．利用标准曲线进行换算：先配制一系列已知不同浓度的测定物溶液，按测定管同样方法处 理显色，分别读取各管光密度，以各管光密度为纵轴，各管浓度为横轴，在方格坐标纸上作图得 标准曲线。以后进行测定时，就无需再作标准管，以测定管光密度从标准曲线上可求得测定物的 浓度。 一般认为，标准曲线范围在测定物浓度的 1/2 到 2 倍之间，并使光密度在 0.05～1.0 范围内 为宜，所作标准曲线仅供短期使用。标准曲线制作与测定管测定应在同一台仪器上进行，尽管型 号相同，操作条件完全一样，因不同一台仪器，其结果会有一定误差。 3．利用克分子吸光系数ε求取测定物浓度：(6)式中 k 为吸光系数，当浓度 c 为 mol/L，溶 液厚度 1 为 1cm 时，k 称为克分子吸光系数，以ε表示，此时ε与 A 相等。实际应用中测定物常 以 g/ml 作浓度单位。 已知ε情况下，读取测定液厚度为 1cm 时的光密度，根据下式可求出测定的物质浓度。 C=A/ε 此计算式常用于紫外吸收法，如蛋白质溶液含量测定，因蛋白质在波长 280nm 下具有最大吸 收峰，利用已知蛋白质在波长 280mm 时的克分子吸光系数，再读取待测蛋白溶液的光密度，即可 算出待测蛋白质的浓度。无需显色，操作简便。 二种以上待测物的混合液未被单独分离情况 下，也可利用ε不同，进行定量测定。例如，有 a 和 b 两种混合液，需分别测定其含量。 设 a 和 b 在波长λ时，克分子吸光系数为ε 和 1 a1 ε ，在波长λ时，克分子吸光系数为ε 和ε ，a 和 b1 2 a2 b2 b 混合液在λ 时光密度为 A1，在λ时的光密度为 A2 1 2 10） （见图 6-0-10）图 10 a.b 二成分混合液的吸光谱19a、b 各自浓度分别为 Ca 和 Cb，根据(6)式可列出下式： A1=εa1Ca+εb1Cb………………………………………(1)式 A2=εa1Ca+εb2Cb………………………………………(2)式 根据(1)和(2)式组成的联立方程式，求解得 a 和 b 两物的浓度（Ca 和 Cb） ： Ca=(εb2A1-εb1A2)/(εa1εb2-εa2εb1) Cb=(εa1 A2-εa2A1)/(εa1εb2-εa2εb1) 如有三种以上成分的混合液，也可通过 3 种不同波长情况下的光密度，以各自特有的ε值， 依据三元一次方程，同样可求出未分离的 3 种混合物的各自浓度。三、离心法 利用物质的沉降系统、质量、浮力等不同因素，应用强大的离心力使物质分离的方法称离心 法。 （一） 基本原理 离心法是利用离心机产生的强大离心力来分离具有不同沉降系数的物质。离心机所产生的离 心力，通常用下列方程式计算：2 2F=4π v r/g 式中 F 为离心力， 单位以地心引力的倍数 g （或×g） 来表示。 为重力加速度， G 等于 980.6cm/2秒 ，r 通常指自离心管中轴底部内壁到离心转轴中心之间的距离（cm） V 为转速，即离心机 。2每秒的转数，若以目前惯用的每分钟转数（即 rpm）表示，需乘以(1/60) ，上式应改为：2 2 2F=(4π v r/g)×(1/60)2 2 -2V(rpm)=(Fg?60 /4π r) 60×31.28 -2 = ――――― ×(Fr) 2×3.14由上式可见，离心机每分钟转数（rpm）可以和离心力 F（g 或×g）相互换算。一般情况下， 低速离心机常用 rpm 表示，超速及高速离心机则用 g（或×g）表示。值得注意的是，式中 r 定义 为离心管底内壁转轴中心作旋转运动时的半径，这种提法对转速在 5000rpm 以内的低速离心来说 进行粗略的计算是容许的，但对超速离心来说这种概念就不明确了。例如，离心管距转轴中心是 4.7cm，管底内壁距转轴中心为 9.8cm，设该机转速为 50000rpm，用上式分别计算管口和管底的离 心力为： 4×(50000/60) ×3.1416 ×4.7 F(管口)= ―――――――――――――― 980.62 2= 131370g204×(50000/60) ×3.1416 ×9.8 F(管底)= ――――――――――――――― 980.62 2= 273910g 即管口的离心力为地心引力 131370 倍， 管底的离心力为地心引力 273910 倍， 二者相差一倍以上。 这就是说明了超速离心时人们用地心引力的倍数（g）代替每分钟转数（rpm）的原因，也说明了 r 应指离心转轴中心到某被分离物粒子在离心管中所处位置的距离，该粒子所受离心力随其在管 中的移动而变化。明确这一点是很重要的，它如实地反映了离心时被分离物的运动特性。 超速离心时，颗粒的沉降速度常用沉降系数表示。沉降系数用 Svedberg 表示，简称 S，1S-13单位等于 1×10秒。近代生物化学文献中经常出现沉降系数这一概念，用以描述某些生物高分子或亚细胞器的大小，如 16SRNA、23SRNA、70S 核蛋白体等。沉降系数与物质点的大小、形态、 密度以及介质的密度和粘度等因素有关，当我们对某些生物高分子或亚细胞器组分的化学结构、 分子量等还不了解时，可以用沉降系数对它们的物理特性进行初步描述，将它们区别开来。(二) 离心机的类型 根据离心机每分钟的转速不同而将离心机分为普通离心机、高速离心机和超速离心机。 根据离心时离心管与轴的角度不同而分为水平式及斜角式二种。水平式乃旋转时离心管与轴 成直角，而斜角式在旋转时离心管与轴成 45°～50°的角（图 6-0-11） 。图 6-0-11 两种离心类型示意图 斜角式离心机， 由于微粒在溶液内走的距离较短， 微粒沿离心管壁沉降的阻力比在溶液中小， 故沉降较快。但对有粘性的物质则不易分离。水平式离心机的优点是可以从刻度离心管得出沉淀 物的容积，但微粒在溶液内走的距离较长，沉淀较慢。 高速和超速离心机，为了防止旋转时发热，而带致冷装置。超速离心机由于转数极高而需精21密度很高的速度及温度控制系统，分析型超速离心机还有能自动摄影的光学系统。离心机的使用方法和注意事项 (三) 离心机的使用方法和注意事项 离心机特别是高速和超速离心机，属大型贵重仪器，使用前应了解其性能，掌握其操作规程， 以防在离心过程中发生意外，使用时应注意下面几点： 1．使用前，应先检查离心机的放置是否水平与稳定、离心轴上的支架是否牢固等。 2．对称位置的离心管及内容物与套管必需用天秤平衡。离心套管中如有碎玻璃等硬物，应予 清除。套管底部应用橡皮垫上，以免离心时管子破裂。 3．离心时先检查转速器是否在起点，打开电门起动，起动后应缓慢加速。离心完毕，将转速 开关缓慢退回到起点，关电门任其自停，切勿用手助停。 4．离心机转动时，如机身不稳，声音不均匀，或离心管破裂，应停止离心，重新平衡后再开 机。 总之，应注意平衡、对称、平稳、牢固、缓慢。以上几点一般是指普通离心机而言，而高速 和超速离心机的使用要求更高，需严格按各自的操作规程进行操作。 电泳(杨学辉) 四 电泳(杨学辉) 电泳（Electrophoresis）是指带电荷的粒子或分子在电场中移动的现象称为电泳。大分子的 蛋白质、多肽、病毒粒子，甚至细胞或小分子的氨基酸、核苷等在电场中都可作定向泳动。1937 年 Tiselius 成功地研制了界面电泳仪进行血清蛋白电泳，它是在一 U 型管的自由溶液中进行的， 电泳后用光学系统使各种蛋白所形成折光率差别成为曲线图象，将血清蛋白分为白蛋白、α1-球 蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白五种，随后，Wielamd 和 Kanig 等于 1948 年采用滤 纸条做载体，成功地进行了纸上电泳。从那时起，电泳技术逐渐被人们所接受并予以重视，继而 发展以滤纸、各种纤维素粉、淀粉凝胶、琼脂和琼脂糖凝胶、醋酸纤维素薄膜、聚丙烯酰胺凝胶 等为载体，结合增染试剂如银氨染色、考马斯亮蓝等大大提高和促进生物样品着色与分辨能力， 此外电泳分离和免疫反应相结合，使分辨率不断朝着微量和超微量（1ng～0.001ng）水平发展， 从而使电泳技术获得迅速推广和应用。在此主要介绍常用电泳的一般原理及其应用。 （一）电泳的基本原理 生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等大多都有阳离子和阴离子基团，称为两性离子。常以颗+粒分散在溶液中，它们的静电荷取决于介质的 H 浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带 电颗粒向阴极或阳极迁移，迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即所谓电泳。 如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中， 使颗粒具有恒定迁移速率的驱动 力来自于颗粒上的有效电荷 Q 和电位梯度 E。它们与介质的摩擦阻力 f 抗衡。在自由溶液中这种 抗衡服从 Stokes 定律。 F=6πrvη 这里 v 是在介质粘度为η中半径为 r 的颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种抗衡并不完全符合 Stokes 定律。F 取决于介质中的其他因子，如凝胶厚度、颗粒大小、甚至介质的内渗等。 电泳迁移率（mbility）m 规定为在电位梯度 E 的影响下，颗粒在时间 t 中的迁移距离 d。 d22m= -----------t?E或m=V / E迁移率的不同提供了从混合物中分离物质的基础，迁移距离正比于迁移率。（二）影响电泳的因素 1. 电泳介质的 pH 值 溶液的 pH 值决定带电物质的解离程度，也决定物质所带净电荷的多少。对蛋白质、氨基酸等 类似两性电解质，pH 值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢。因此，当 分离某一种混合物时， 应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的 pH 值， 以利于各种蛋白质 的有效分离。为了保证电泳过程中溶液的 pH 值恒定，必须采用缓冲溶液。 2. 缓冲液的离子强度 溶液的离子强度（Ion intensity）是指溶液中各离子的摩尔浓度与离子价数平方的积的总和 的 1/2。带电颗粒的迁移率与离子强度的平方根成反比。低离子强度时，迁移率快，但离子强度 过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持 pH 恒定。高离子强度时，迁移率慢，但电泳谱带要比低离 子强度时细窄。通常溶液的离子强度在 0.02～0.2 之间。2I=1/2∑CiZi 例1（I：离子强度；Ci：离子的摩尔浓度；Zi：离子价数。 ）0.154M NaCl 溶液的离子强度为：2 2I= 1/2（0.154×1 +0.154×1 ）=0.154 例2 0.015M Na2SO4 溶液的离子强度为：2 2I= 1/2（0.015×2×1 +0.015×2 ）=0.045 3. 电场强度 电场强度 （电势梯度 Electric field intensity） 是指每厘米的电位降 （电位差或电位梯度） 。 电场强度对电泳速度起着正比作用，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据实验的需要， 电泳可分为两种： 一种是高压电泳， 所用电压在 500～1000V 或更高。 由于电压高， 电泳时间短 （有 的样品需数分钟） ，适用于低分子化合物的分离，如氨基酸、无机离子，包括部分聚焦电泳分离及 序列电泳的分离等。因电压高、产热量大，必须装有冷却装置，否则热量可引起蛋白质等物质的 变性而不能分离，还因发热引起缓冲液中水分蒸发过多，使支持物（滤纸、薄膜或凝胶等）上离 子强度增加，以及引起虹吸现象（电泳槽内液被吸到支持物上）等，都会影响物质的分离。另一 种为常压电泳，产热量小，室温在 10～25℃分离蛋白质标本是不被破坏的，无需冷却装置，一般 分离时间长。 4. 电渗现象 在电场中液体对于一个固体的固定相相对移动称为电渗。在有载体的电泳中，影响电泳移动 的一个重要因素是电渗。最常遇到的情况是γ-球蛋白，由原点向负极移动，这就是电渗作用所引 起的倒移现象。产生电渗现象的原因是载体中常含有可电离的基团，如滤纸中含有羟基而带负电 荷，与滤纸相接触的水溶液带正电荷，液体便向负极移动。由于电渗现象往往与电泳同时存在， 所以带电粒子的移动距离也受电渗影响；如电泳方向与电渗相反，则实际电泳的距离等于电泳距23离加上电渗的距离。琼脂中含有琼脂果胶， ，其中含有较多的硫酸根，所以在琼脂电泳时电渗现象 很明显，许多球蛋白均向负极移动。除去了琼脂果胶后的琼脂糖用作凝胶电泳时，电渗大为减弱。 电渗所造成的移动距离可用不带电的有色染料或有色葡聚糖点在支持物的中心，以观察电渗的方 向和距离。（三）电泳的分类 目前所采用的电泳方法，大致可分为 3 类：显微电泳、自由界面电泳和区带电泳。区带电泳应 用广泛，区带电泳可分为以下几种类型： 1. 按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为： （1）滤纸为支持物的纸电泳； （2）粉末电泳： 如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳； （3）凝胶电泳：如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳； （4）缘线电泳：如尼龙丝、人造丝电泳 2. 按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为： （1）平板式电泳：支持物水平放置，是最常用的电泳方式； （2）垂直板电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳。 （3）柱状（管状）电泳：聚丙烯酰胺凝胶可灌入适当的电泳管中做成管状电泳。 3．按 pH 的连续性不同，区带电泳可分为： （1）连续 pH 电泳：如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳； （2）非连续 pH 电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳； （四）电泳所需的仪器 电泳所需的仪器有：电泳槽和电源。 1. 电泳槽 电泳槽是电泳系统的核心部分，根据电泳的原理，电泳支持物都是放在两个缓冲液之间，电 场通过电泳支持物连接两个缓冲液，不同电泳采用不同的电泳槽。常用的电泳槽有： （1）圆盘电泳槽：有上、下两个电泳槽和带有铂金电极的盖。上槽中具有若干孔，孔不用时，用 硅橡皮塞塞住。要用的孔配以可插电泳管（玻璃管）的硅橡皮塞。电泳管的内径早期为 5～７mm， 为保证冷却和微量化，现在则越来越细。 （2）垂直板电泳槽：垂直板电泳槽的基本原理和结构与圆盘电泳槽基本相同。差别只在于制胶和 电泳不在电泳管中，而是在块垂直放置的平行玻璃板中间。 （3）水平电泳槽：水平电泳槽的形状各异，但结构大致相同。一般包括电泳槽基座、冷却板和电 极。 2. 电源 要使荷电的生物大分子在电场中泳动，必须加电场，且电泳的分辨率和电泳速度与电泳时的 电参数密切相关。不同的电泳技术需要不同的电压，电流和功率范围，所以选择电源主要根据电 泳技术的需要。如聚丙烯酰胺凝胶电泳和 SDS 电泳需要 200～600V 电压。24（五）电泳技术的应用 1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用做蛋白质纯度的鉴定。聚丙烯酰胺凝胶电泳同时具有电荷效应和 分子筛效应，可以将分子大小相同而带不同数量电荷的物质分离开，并且还可以将带相同数量电-9荷而分子大小不同的物质分离开。其分辨率远远高于一般层析方法和电泳方法，可以检出 10 ～-1210 g 的样品，且重复性好，没有电渗作用。 2. SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳可测定蛋白质分子量。其原理是带大量电荷的 SDS 结合到蛋白质 分子上克服了蛋白质分子原有电荷的影响而得到恒定的荷/质比。 聚丙烯酰胺凝胶电泳测蛋白 SDS 质分子量已经比较成功，此法测定时间短，分辨率高，所需样品量极少（1～100μg） ，但只适用 于球形或基本上呈球形的蛋白质，某些蛋白质不易与 SDS 结合如木瓜蛋白酶、核糖核酸酶等，此 时测定结果就不准确。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于蛋白质定量。电泳后的凝胶经凝胶扫描仪扫描，从而给出定量 的结果。凝胶扫描仪主要用于对样品单向电泳后的区带和双向电泳后的斑点进行扫描。 4． 琼脂或琼脂糖凝胶免疫电泳可用于①检查蛋白质制剂的纯度； ②分析蛋白质混合物的组分； ③研究抗血清制剂中是否具有抗某种已知抗原的抗体；④检验两种抗原是否相同。（六）电泳后结果检测 对于不同的目的，应采用不同的检测方法。用染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电 泳后检测最常用的方法。（七）聚丙烯酰胺凝胶电泳结果不正常现象和对策 1. 指示剂前沿呈现两边向上或向下的现象。向上的“微笑”现象说明凝胶的不均匀冷却，中 间部分冷却不好，所以导致凝胶中分子有不同的迁移率所致。这种情况在用较厚的凝胶以及垂直 电泳中时常发生。向下的“皱眉”现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别 是当凝胶和玻璃板组成的 “三明治” 底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。 2.“拖尾”现象是电泳中最常见的现象。这常常是由于样品溶解不佳引起的，克服的办法是 在加样前离心，选用合适的样品缓冲液和凝胶缓冲液，加增溶辅助试剂。另一方法是降低凝胶浓 度。 3.“纹理”现象常常是由于样品中不溶颗粒引起的，克服办法是增加溶解度和离心除去不溶 性颗粒。 4. 蛋白带偏斜常常是由于滤纸条或电极放置不平行所引起的， 或由于加样位置偏斜而引起。 5. 蛋白带过宽，与邻近蛋白泳道的蛋白带相连，这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的。 6. 蛋白带模糊不清和分辨不佳是由于多种原因引起的。虽然梯度凝胶可以提高分辨率，但 与其他方法相比，常规聚丙烯酰胺凝胶电泳是分辨率较低的方法。为了提高分辨率，不要加过多 的样品，小体积样品可给出窄带。加样后应立即电泳，以防止扩散。选择合适的凝胶浓度，使组 分得以充分的分离。通常靠近前沿的蛋白带分辨率不佳，所以应根据分子量与凝胶孔径的关系，25灌制足够长度的凝胶， 以使样品不会走出前沿。 样品的蛋白水解作用也引起扩散而使分辨率降低。 水解作用通常发生在样品准备的时候，系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白，如果在缓冲液中 加蛋白酶抑制剂可以减少这种情况的发生。常用生物化学技术一、蛋白质含量测定（周秀霞） 蛋白质含量测定（周秀霞） 蛋白质含量测定 蛋白质的定量，通常是指测定溶液中的蛋白质浓度。测定蛋白质含量的方法，主要分为两类： 一是通过测定含氮量，推算出蛋白质的含量，如凯氏定氮法等。 再根据蛋白质含该基团的量推算出蛋白质的含量， 或根 二是通过测定蛋白质中的某些基团， 据已知蛋白质一系列不同含量的标准溶液进行该反应的情况制成标准溶液，来推算出样品中蛋白 质的含量。应用较为广泛的方法有福林―酚法（测蛋白质中的色氨酸、酪氨酸及胱氨酸含量） 、双 缩脲法（测定蛋白质中肽键的反应）和紫外分光光度法（测定肽键对 280nm 紫外线的吸收能力） 。 近年来，很多人用考马斯亮蓝法。究竟采用那一种方法，一般考虑的是准确、操作方便，影响因 素少等方面。以下介绍几种常用的测定方法。 项目编号： 项目编号：060001 项目名称：微量凯氏（Kjeldahl） 项目名称：微量凯氏（Kjeldahl）定氮法 项目性质： 项目性质：验证性 实验学时： 实验学时：4 分组人数： 分组人数：2 人 [实验原理]： 实验原理] 各种天然有机物的总氮量通常用微量凯式定氮法（Micro-kjeldahl Methcd）来测定。 当被测的含氮有机物与浓硫酸共热时，被氮化为二氧化碳和水，而氮转变为氨，氨与硫酸结 合生成硫酸铵。为了加速有机物质的分解反应，在消化时常加入促进剂，硫酸酮可用作催化剂， 硫酸钾或硫酸钠可提高消化液的沸点，氧化剂如过氧化氢也能加速反应。 消化完成后，在凯氏定氮仪中，加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解，放出氨。借水蒸汽蒸 馏法，将氨蒸入过量标准无机酸溶液中，然后用标准碱溶液进行滴定。根据所测得的氨量，计算 样品中的含氮量。 1. 消化： 消化剂 有机含氮物＋H2SO4 Δ 2NH3 ＋H2SO4 2. 蒸馏 (NH4)2SO4＋2NaOH 3NH3＋H3BO3 3. 滴定26CO2＋SO2＋NH3＋ H2O(NH4)2SO42H2O＋Na2SO4＋2NH3↑ (NH4)3BO3(NH4)3BO3＋3HCl3NH4Cl＋H3BO3+将天然含氮有机物中的 N 转变为(NH4)2SO4 中的 NH4 离子（无机氮）分解进行缓慢时，应加入2+；K ；H CuSO4（Cu 为催化剂） 2SO4／Na2SO4（提高消化液沸点） 2O2（氧化剂）以加速反应。 将 NH3 蒸入标准过量无机酸溶液中，可以进行滴定来测 N 的含量。 在硼酸一指示剂混合液中， 氨已与溶液中氢离子结合生成铅离子， 溶液中的氢离子浓度降低， 指示剂颜色改变，在这步中用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来氢离子的浓度，即指示剂变 回原来的颜色为止。 强酸的当量数＝样品中氨的当量数 说明：在本实验中，由于样品为蛋白质，而每一种蛋白质都有其恒定的含氮量，大约在 14%～ 18%，平均为 16%。由凯氏定氮法测定出样品的含氮量，再乘以系数 6.25 即得到样品含蛋白质量。 若测定的蛋白质样品中尚含有其他含氮物质（称非蛋白氮） ，为了测得蛋白质的真实含量，应 当向样品溶液中加入三氯乙酸，使其最终浓度为 5%，将蛋白质沉淀出来，再取样进行消化，测定 蛋白氮，便可得到所测样品中的蛋白质含量。在本实验中为了排除其它因素的干扰，确保测定准 确，样品测定前要做空白对照。 微量凯氏定氮法的适用范围是 0.2～1.0mg 氮，相对误差应小于±2%。 [操作步骤]： 操作步骤] 1．消化：准确吸取用生理盐水稀释 5 倍的血清 2.0ml 放入凯氏烧瓶中，加固体 K2SO4 与 CuSO4 （3:1）0.3g，浓 H2SO4 5ml，玻璃珠 2 只，混匀。 将凯式烧瓶固定在铁架上，置电炉或酒精灯加热（火力不用太旺） ，消化架放在通风橱中或用 酸雾收集器收集酸雾，开始有水汽发出。冒出浓白烟（SO3）时，调节热源使 SO3 不至溢出过多。 溶液逐渐变成棕色直至黑色，继续加热至瓶中消化液为澄清的蓝绿色时，消化即完成。 冷却至接近室温时， 小心沿管壁加水约 10ml 稀释消化液， 以免冷却冻结。 将消化液倾入 100ml 容量瓶中，以少量蒸馏水冲洗消化瓶数次，全部倾入容量瓶内，然后用蒸馏水稀释至刻度，反复 颠倒混匀。 2．蒸馏：微量凯式定氮法中的氨蒸馏装置有几种不同的结构类型，但原理相同。仅举 1 例如 下： (1) 将蒸馏器装置妥当，并检查各接头处是否漏气。 (2) 打开冷凝管的水源，使水缓缓流过。 (3) 蒸气发生器中装蒸馏水，加几滴硫酸、甲基红和数块碎瓷片，塞紧橡皮塞后，加热，使 产生蒸气。 (4) 通过蒸气冲洗整套蒸馏装置，于冷凝管下端置小烧杯接水。蒸气冲洗 20 分钟后，停止加 热蒸气发生器，并冷却之，使反应室外壳产生负压，将反应室的积水回吸收到反应室外壳，并用 蒸馏水冲洗棒状玻塞和小玻杯，使水冲入反应室中并再吸收到反应室外壳，打开夹子，放出废液， 继续将夹子开放。 (5) 用 50ml 锥形瓶放 10ml，120g/L 硼酸溶液和 2 滴混合指示剂（溶液应呈紫灰色） ，置于冷 凝管下端为接受瓶，使冷凝管下口完全浸入硼酸溶液中。27(6) 加样：吸入消化液 5ml（加样前夹子要开放） ，将棒状玻璃塞取出，小心将溶液通过小玻 杯流入反应室中，并用少量水冲洗小玻杯，然后将玻璃塞塞好。 (7) 加碱：取 500g/L NaOH 6ml 加入小玻杯（加碱时棒状玻璃塞不必提起） ，加完后，慢慢提 起玻璃塞（提起后，立刻夹夹子，且接受瓶已放好） ，NaOH 慢慢流入反应室，见有棕色或蓝色出 现，停止加碱（一般超过 6ml） 。 (8) 碱液加入后，开始计时，3 分钟，将接受瓶取出，排出废液，用蒸馏水冲洗 3 次，空蒸 1 分钟，滴定接受瓶中的 NH3 含量。 (9) 开始测量第 2 个样品。 3．滴定：用装入微量滴定管中的 HCl（0.01mol/L）滴定接受瓶中的硼酸铵，使溶液由蓝色 突然变成紫灰色时为终点（硼酸加指示剂时的颜色） ，记录所用的 HCl 的毫升数。 4．空白测定：应放在样品测定前：以 5.0ml，9g/L NaCl 溶液代替样品（1.0ml 稀释血清） ； 从第(6)步加样开始，其操作同样品操作完全相同。12）微量凯氏蒸馏装置 （图 12）微量凯氏 计算： 计算：
最终血清蛋白质（g/L）=[(A-B)×0.14mgN/ml× ――― -NPN]× ――― 0.4 1000 ―― × 5 10028A：滴定样品用去的 0.01mol/L 的 HCl 的毫升数 B：滴定空白用去的 0.01mol/L 的 HCl 的毫升数 1ml0.01mol/L HCl 相当于 0.14mgN NPN：血清中非蛋白含氮化合物的氮含量 mgN/L（350mgN/L） 6.25：蛋白系数 （人体内血清蛋白的正常含量应为 60～80g/L） [仪器及试剂]： 仪器及试剂] (一) 仪器： 1．100ml 凯氏烧瓶 2．玻璃珠（3mm） 3．5ml 酸式微量滴定管 4．凯氏定氮蒸馏仪 5．25ml 容量瓶 6．电炉 (二) 试剂： ，研细混匀。 1．硫酸钾及硫酸酮混合物（K2SO4:CuSO4?5H2O4＝3:1） 2．浓硫酸 3．500g/L NaOH 4．20g/L 硼酸（加混合指示剂应为紫灰色） 5．0.01mol/L HCl 溶液（要滴定） 6．混合指示剂（取 1g/Ll 甲基红乙醇液 2ml 与 1g/L 溴甲酚绿乙醇液 10ml 混合） 。 7．标准硫酸铵（1mgN/ml） （取适量硫酸铵（AR）置于 110°烘箱中半小时，使其干燥，继置 干燥器内冷却。准确称取此干燥的硫酸铵 0.4716g，溶于蒸馏水中，将溶液全部转移入 100ml 容 量瓶中，加浓硫酸 1 滴，并用蒸馏水稀释至刻度） 。 8．9g/L NaCl 溶液（用无 NH3 蒸馏水配制） 。项目编号： 项目编号：060002 项目名称：福林―酚试剂法(Lowry 项目名称：福林―酚试剂法(Lowry 法) 项目性质： 项目性质：研究性 实验学时：4 实验学时： 分组人数： 分组人数：2 人 [实验原理]: 实验原理 蛋白质中的酪氨酸等与酚试剂之磷钼酸、磷钨酸作用产生蓝色化合物，最大吸收峰波长为29745～750nm 其颜色深浅与蛋白质含量成正比。 福林―酚法测定蛋白质可分为两个步骤： 1． 在碱性溶液中，蛋白质与铜离子发生反应：++Cu+ 蛋白质→ Cu-蛋白质2. Cu-蛋白质使试剂中的磷钨酸―磷钼酸还原成为蓝色化合物， 测定光吸收值就可以推算出 蛋白质的含量。试剂中的碳酸钠有缓冲作用，使溶液的 pH 值保持在 10 左右，显色最深。福林― 酚法的灵敏度高、蛋白质浓度测定范围是 25～250μg。但此法实际上是蛋白质中酪氨酸和色氨酸 等与试剂的反应，因此它受蛋白质氨基酸组成的影响，即不同蛋白质中氨基酸组成的不同会使显 色强度有所差别； 此外， 样品中酚类及柠檬酸的干扰而使结果偏高。 低浓度的尿素 （约 0.5%左右） 、 胍（0.5%左右） 、硫酸钠（1%） 、硝酸钠（1%） 、三氯醋酸（0.5%） 、乙醇（5%） 、丙酮（0.5%）对显 色无影响，上述物质浓度高时必须做校正曲线。 [操作步骤]： 操作步骤] 1． 制作标准曲线（1） 标准蛋白的选择： 最好选择与待测样品相同或组成类似的蛋白质作为标准蛋白溶 液。 （2） 标准蛋白溶液的配制：将标准蛋白经凯氏定氮法准确测定其蛋白质含量，再用无离 子水配制成 1.0 mg/ml 的储存液。 （3） 按照下表配成不同浓度的标准蛋白组，编上号码，以第一管为空白管，在分光光度 计上测定 650nm 处的光密度值。 1 标准蛋白溶液 （1mg/ml） 生理盐水（ml） 试剂 A（ml） 0 1.0 0.9 0.2 0.8 0.9 0.4 0.6 0.9 0.6 0.4 0.9 0.8 0.2 0.9 1.0 0 0.9 2 3 4 5 6混匀后置于 50℃水浴 10 分钟，冷却 试剂 B(ml) 室温放置 10 分钟 试剂 C(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1立即混匀，置 50℃水浴保温 10 分钟，冷却后比色。（4） 以各标准溶液浓度为横坐标， 各管的光密度值为纵坐标作图， 得标准曲线。 标准曲线必须从零点出发，最好能成一直线，画好后，注明所用仪器的型号 及编号，所用波长及测定方法，名称及制做日期。 2． 样品蛋白的测定（1） 取试管 2 只，按下表操作。30测定管 稀释的待测样品（ml） 生理盐水（ml） 试剂 A (ml) 1.0 ― 0.9空白管 ― 1.0 0.9混匀后在 50℃ 水浴保温 10 分钟，冷却 试剂 B (ml) 试剂 C (ml) 0.1 3.0 0.1 3.0立即混匀，置 50℃水浴中保温 10 分钟，冷却后测定 650nm 波长处的光密度值。查标准曲线计算待测样品的蛋白含量，以 g/L 为单位。 注意：各管加酚试剂必须快速，并立即摇匀，不应出现浑浊；测定蛋白质的浓度最好在 15～ 110μg 范围。 [实验材料] 实验材料] 试剂： 试剂： 1． 1000ml。 2． 试剂 B：2g 酒石酸钾钠及 1g CuSO4.5H2O 分别溶于少量水中,混合后加水至 90ml 再 试剂 A：2g 酒石酸钾钠及 100g Na2CO3 溶于 500ml 1.0mol/L NaOH 中，用水稀释至加 1mol/L NaOH 10ml 即成。 3． 定)。 称取 Na2WO4.2H2O 及 Na2MoO4.2H2O 各 25g 溶于蒸馏水 700ml 中，加入 85% H3PO4 50ml、浓 HCl 100ml， 混匀后， 置圆底烧瓶中加热回流 10 小时， 加入 Li2SO4.H2O 150g、 蒸馏水 50ml 及溴水 （Br2） 数滴，溶液变为红黄色，置通风橱内加热沸腾 15 分钟蒸发 Br2，溶液呈透明的金黄色，冷却后加 蒸馏水定容至 1000ml，过滤，置棕色瓶中保存，用标准 NaOH 标定其浓度，应用时用蒸馏水稀释 至浓度为 0.15～0.18mol/L。 溶液中的硫酸锂能防止磷钼酸沉淀，溴可以氧化试剂中的还原物质，使其不致干扰显色。 4． 标准蛋白溶液：称量干燥的人血清白蛋白（BSA）或丙种球蛋白 10mg，用生理盐水 试剂 C：市售的酚试剂按 1：15 稀释，最后浓度为 0.15-0.18mol/L(用标准 NaOH 滴配制成 1mg/ml 的标准蛋白溶液。 5． 生理盐水。项目编号：060003 项目编号： 项目名称：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量――蛋白质项目名称：考马斯亮蓝法测定蛋白质含量――蛋白质-染料结合法 ――蛋白质 项目性质： 项目性质：研究性 实验学时： 实验学时：4 分组人数：2 人 分组人数：31[实验原理]: 实验原理] 考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue，CBB）G-250 即二甲花青亮蓝（xylene cyanine brilliant blue） ，是一种甲基取代的三苯基甲烷。每个分子含有一个 SO3H 基团，偏酸性，可以 结合在蛋白质的碱性基团上。 G-250 与蛋白质结合时， 使染料的最大吸收峰从 465nm 移动到 595nm。 染料和蛋白质的结合量在一定浓度下与 595nm 的吸收值线性相关，其蛋白结合反应在 2 分钟内即 可完成，而反应生成的复合物可在 1 小时内比较稳定地存在于溶液中，因此，用标准浓度的蛋白 （如牛血清白蛋白）与 CBB G-250 反应，测得 OD595 做标准曲线，即可求得待测溶液的蛋白浓度。 此方法试剂简单、经济、测定简便快速，只加一次试剂，整个测定过程 10min 左右即可完成，可 测范围广 （100～1300μg） 具有与 Lowry 法相当的灵敏度， 。 受碳水化合物 （如蔗糖） 的干扰很小， 对少量去污剂如 SDS、Triton X-100 以及强碱性缓冲试剂如 Tris 等造成的干扰，可采用对照来消 除。但是： （1）DNA 的存在可干扰测定； （2）背景较深； （3）显色剂的稳定性差，都应重做标准 曲线。 [测定方法]: 测定方法]: 1． 标准曲线的制备：取 6 支试管，按下表加入 BSA 及蛋白试剂混匀，测定 OD595 的光密度值。 管号 1 2 3 4 5 6 SA(1mg/ml) (ul) TH2O(ul) CBB G-250(ml) OD595 2． 0 100 5.0 20 80 5.0 40 60 5.0 60 40 5.0 80 20 5.0 100 0 5.0待测样品视浓度不同，取 10～100ul，按上述方法反应，测定 OD595nm，从标准曲线查出待测样品的蛋白浓度。 [实验材料] 实验材料] 试剂: 试剂: 1． CBBG-250 配制：100mg 溶于 50ml 95%乙醇中，再加入 100ml 85%(W/V)的磷酸，最后加入蒸馏水定容至 1000ml。 2． 标准蛋白溶液：准确称取 BSA 3mg，用蒸馏水配成浓度为 1mg/ml 的 BSA 标准溶液。此蛋白标准溶液可用小管分装于-20℃保存，可供多次使用。 3． 待测蛋白样品液：要求蛋白浓度范围为 0.1～10mg/ml。若浓度过高时需适量稀释。项目编号： 项目编号：060004 项目名称： 项目名称：双缩脲法测定蛋白质含量 项目性质： 项目性质：研究性 实验学时： 实验学时：4 分组人数： 分组人数：2 人 [实验原理]: 实验原理] 凡具有两个以上肽键（-CO-NH-）的物质，在碱性溶液中与硫酸铜作用，形成紫红色的络合32物，此紫红色化合物在 540nm 处有最大吸收峰，这个反应称双缩脲反应。蛋白质是由许多氨基酸 通过肽键连接起来的，因而一切蛋白质均可与双缩脲试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质 浓度成正比，与同样操作的已知浓度蛋白质溶液相比较可求得其含量。 双缩脲试剂也可与―CSNH2, ―C(NH)NH2 或―CH2NH2 等基团反应。但在生物体内除蛋白质外不 存在其它能与此试剂显色的物质。 本法的测定蛋白质浓度的范围是 0.5～10mg/ml，最好在 1～5mg/ml 范围。本法操作简单、 显色稳定，对大部分蛋白质显色程度相同，特别是各种血清蛋白显色程度一致。在 20～40℃范围 内，反应后 30 分钟的显色程度基本相同，从 30 分钟到 4 小时颜色深度不变。如室温过低，可置 37℃水浴中 20 分钟后测定光密度。 铵盐对测定有干扰，硫酸铵盐析的蛋白质粗品必须先行脱盐。含血脂多的血清，可用乙醚 抽提一次后再行测定。 [操作步骤]： 操作步骤] 1． 标准曲线的制备 取 7 个试管按下表配成不同浓度的标准蛋白液。 试管号 标准蛋白溶液 （10mg/ml） 0 0.1 0.9 4.0 0.3 0.8 4.0 0.5 0.6 4.0 0.7 0.4 4.0 0.9 0.2 4.0 0.009 1 2 3 4 5 6生理盐水（ml） 1.0 双缩脲试剂(ml） 4.0 蛋白浓度(mg/ml） 00.001 0.0030.005 0.007混匀后，于 37℃水浴中保温 15 分钟，在 520nm 波长下比色，以第一管调零，测得各标 准管的光密度。以各管的光密度值为纵坐标，以蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。 2． 样品测定取待测蛋白样品 0.1ml，加生理盐水 0.9ml，再加双缩脲试剂 4.0ml，于 37℃水浴中保温 15 分钟，测其光密度，查标准曲线即可得出样品中的蛋白质含量。 标准蛋白光密度值 蛋白质含量(g%)= ×标准蛋白浓度 样品光密度值 [实验材料]： 实验材料] 1． 标准蛋白溶液紫外分光光度法对大多数蛋白质的显色程度一致，故仅需用一种标准蛋白，常用牛血清白 蛋白（BSA）作为标准蛋白。准确称取干燥之 BSA 100mg，用生理盐水溶解定容至 10ml，其蛋白浓 度为 10mg/ml。 2. 双缩脲试剂 取硫酸铜 1.5g，酒石酸钾钠 6g，分放两烧杯中，各加水 200ml，使之溶解后，将两溶液全 部转移至 1000ml 容量瓶中。混合后加入 10% NaOH 300ml，定容至刻度，混匀。置于暗处保存， 有红色沉淀时不能用。33项目编号： 项目编号：060005 项目名称： 项目名称：紫外分光光度法测定蛋白质含量 项目性质： 项目性质：研究性 实验学时： 实验学时：4 分组人数： 分组人数：2 人 [实验原理]： 实验原理] 蛋白质溶液都具有吸收一定波长紫外线的能力，其光密度和蛋白质的浓度呈线性关系。 蛋白质在 280nm 处的特征性吸收峰，是由于其中所含有的芳香族氨基酸：酪氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸所引起的，其光密度和蛋白质的浓度呈线性关系，可用于蛋白质的定量。对于同样浓度 的不同蛋白质，如果酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸含量不同，其光密度值也不同，选用标准蛋白质 时必须注意。若样品中含有其它具有紫外吸收的杂质，如核酸、核苷酸等，可产生较大的误差， 故应作适当的校正。 蛋白质样品中含有核酸时，混杂的核酸在 280nm 处也有吸收，对此法有一定的影响。因此， 一般情况下在测定 A280 的同时，测定 A260，计算 A280/A260 的比值。如果 A280/A260≥1.5，可忽略不计 核酸的影响，A280/A260&1.5 时，需按下列公式计算蛋白质的浓度： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.55A280-0.75A260 由于蛋白质变性因素的影响，蛋白质溶液呈浑浊状态时，样品用 0.1N 以上的 NaOH 溶液溶 解后测定，但是 A280 因溶液 pH 值变化而有变化，准确度有一定影响。此法测定蛋白质的浓度范 围是 0.1～0.5mg/ml，优点是简便、快速、不损失样品，尤其是样品中含有蛋白质显色影响因素 时，紫外分光光度法是常用的蛋白定量方法。甚至有的蛋白质如胶原蛋白，因不含上述氨基酸， 在 280nm 处无吸收，不能用此法测定蛋白含量。 此外，NaCl、(NH4)2SO4 以及 0.1N H3PO4、H3BO3、Tris 等缓冲液都无明显干扰作用。0.1M 醋 酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、巴比妥等缓冲液在 215nm 处吸收较大，不能应用。防腐剂甲苯、苯基 汞、叠氮钠也有干扰。 [操作步骤]： 操作步骤] 1． 标准曲线的制备 取试管 6 只，按下表加入试剂： 管号 标准蛋白（ml） 1 0 2 0.5 3.5 0.125 3 1.0 3.0 0.25 4 1.5 2.5 0.375 5 2.0 2.0 0.5 6 2.5 1.5 0.625生理盐水（ml） 4.0 蛋白浓度（mg/ml）0混匀，盛于石英杯中，用紫外分光光度计，以第 1 管调零点，在 280nm 波长下测定各 管光密度值。以各管的光密度值为纵坐标，标准蛋白浓度为横坐标绘制标准曲线。 2． 标本的测定 用生理盐水将待测标本的蛋白浓度稀释成大约 1mg/ml，取 1.0ml，加生理盐水 3.0ml， 混匀，按上述方法测定 A280，查标准曲线，得出标本的蛋白浓度。34关于蛋白质含量测定还有其它新方法，主要的方法有 BCA 法和 Bio-Rad 蛋白分析法，这些 方法主要特点是简便、快速、灵敏和抗干扰作用强，有望替代传统的 Lowry 法，但试剂较贵。2+ +BCA 比色法：其原理是在碱性溶液中，蛋白质将 Cu 还原为 Cu 再与 BCA 试剂（4, 4’-二羧酸 -2，2’-二喹啉钠）生成紫色复合物，于 562nm 处有最大吸收，其强度与蛋白质浓度成正比。此法 的最大特点是 TritonX-100、SDS 等表面活性剂无干扰作用。 Bio-Rad 蛋白分析法：其原理是利用特有色素与蛋白质分子侧链基团结合，引起光吸收性质 改变，并在一定范围内服从 Beer 定律。此法特点是：简便快速、只加一次试剂，10 分钟左右即 可完成；灵敏度高，可测 1ug 量蛋白质；氨基酸、肽、EDTA、Tris 、糖等无干扰项目编号： 项目编号：060006 项目名称：蛋白质分子量测定――SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 齐锦生） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ 齐锦生） 项目名称：蛋白质分子量测定―― ―― 项目性质： 项目性质：研究性 实验学时： 实验学时：4 分组人数： 分组人数：2 人 [实验原理 ： 实验原理]： 实验原理 基本原理：SDS 聚丙烯酰胺凝胶电脉法是在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二 烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate 简称 SDS） ，则蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于它的 相对分子量（Mr） ，而与所带电荷和形状无关。在一定条件下，蛋白质的相对分子量（Mr）与电 泳迁移率间的关系，可用下式表示： Mr=K（10-6m） （ lgMr=lgk-bm=k1-bm 式中：Mr 为蛋白质的相对分子量；k，k1 为常数，b 为斜率；m 为迁移率。因此，要测定 某个蛋白质的 Mr，只需比较它和一系列已知 Mr 的蛋白质在 SDS-凝胶电泳时的迁移率就可以了。 相关知识 ： 1、在蛋白质溶液中加入 SDS 和β-巯基乙醇后，β-巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还 原，SDS 所使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。 在一定条件下， SDS 与大多数蛋白质的结合比为 1.4gSDS/1g 蛋白质。 由于十二烷基硫酸根带负电， 使各种蛋白质的 SDS 复合物都带上相同密度的负电荷， 它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷 量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。 SDS 与蛋白质结合后，还引起蛋白质构象的改变。使蛋白质 SDS 复合物成为近似于雪茄烟 形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为 1.8nm，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。 这样的蛋白质-SDS 复合物， 在凝胶电泳中的迁移率， 不再受蛋白质原有电荷和形状的影响， 而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质 Mr 的函数。 2、凝胶的聚合35聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）聚合而成。聚合过程中，四 甲基乙二胺 （N， N′， N， N′-tertramethylendiamine， TEMED） 和过硫酸铵 （ammounium persulfate， AP）激发。过硫酸铵在水溶液中形成一个过硫酸自由基，然后此自由基再激活 TEMED，激活的 TEMED 作为一个电子载体提供一个未配对电子将丙烯酰胺单体转化成自由基，得到激活，被激 活的单体和未被激活的单体反应，开始了多聚链的延伸。同时，Bis 也与多聚链进行交叉，互联 成为网状结构。分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。所以凝胶液需排气，在水或水饱和异丁醇 隔绝空气的条件下反应。核黄素也可作为产生自由基的起始物，核黄素激活聚合反应则需要光和 氧气的存在，因此称光化学聚合。聚合反应如下所示：（方程式 7） ）（图见《医学分子生物学原理与实验技术》P195聚合而成的网状结构也称分子筛，孔径的大小由丙烯酰胺单体和双丙烯酰胺的总浓度（T%）以及 双丙烯酰胺的浓度（C%）决定。在 Bis 浓度（C%）一定的情况下，总浓度 T%越高，孔径就越 小，总浓度和 Bis 浓度对凝胶的强度也有影响，虽然 T%越高，胶的强度越高，但是 Bis 浓度过低 时，即使 T%很高，凝胶的强度也很低。另外，Bis 浓度为 10%以上时，凝胶变得不透明。凝胶的 孔径的大小，可根据待分离分子量范围选择，凝胶浓度大小与待分离物分子量的关系，大致范围 如下表，最常用的浓度为 10%。 分子量范围与凝胶浓度的关系 分子量范围 50~200KD 30~70KD 12~45KD 3、蛋白质与 SDS 的结合 SDS 的分子结构如下所示，一般情况下，1g 重量的蛋白质大约可与 1.4g 的 SDS 结合，分子 中大约 2 个氨基酸残基结合一分子 SDS 蛋白质的极性部位不易结合，疏水部位容易结合，蛋白质 分子中的二硫键（-S-S-）部位，与 SDS 结合后，蛋白质的高级结构受到影响。 蛋白质电泳前，需用样品缓冲液处理。样品缓冲液 中除 SDS 外，还有还原剂β-巯基乙醇，它可将蛋白质 分子中 S-S 还原。SDS 巯基乙醇与蛋白质的反应需要一 （图见《医学分子生 物学原理与实验技 术》P196） 适用的凝胶浓度（T%） 7.5% 10% 15%36定时间，SDS 首先与易结合的部位结合，高级结构改变 后，SDS 再与暴露部位结合。电泳样品制备时 100℃， 加热与 5min 的条件，就是为了加速 SDS 与蛋白质的结 合反应。 虽然迁移率与蛋白质自身所带电荷无关，但以下特殊情况需引起注意： （1）富含碱性基团的 碱性蛋白质与 SDS 的结合量减少。 （2）糖蛋白和酸性蛋白与 SDS 结合量少，迁移率大幅度降低。 （3）富含疏水区域的蛋白质与 SDS 的结合量增加，迁移率增加。 4、浓缩胶浓缩 Pr 的原理： 多数情况下，SDS-聚丙烯酰胺凝胺电泳使用一种不连续的缓冲液系统。整个电泳系统中采用了两 种缓冲液浓度，pH 值和凝胶孔径。一般将不同缓冲液浓度、pH 值、孔径的聚丙烯酰胺凝胶重叠 起来。 （如图 7-4）见上页红框（图 13） （ ，上层胶为浓缩胶，下层胶为分离胶，样品在浓缩胶泳动 ） 的全过程中被浓缩，大大提高了电泳的分辨能力。 在此不连续系统中，浓缩胶中的缓冲对为 Tris-HCl，电泳缓冲液的缓冲对为 Tris-甘氨酸。电 ，移动速度最快，电泳缓冲对中的甘氨酸（等电点为 6.0） ，在 泳时，胶中带负电的氯离子（Cl ）－浓缩胶 pH 值为 6.8 的条件下，解离度很小，只有 1%~0.1%解离，因为移动速度最慢，而与 SDS 结合已带负电的 Pr，在没有分子筛效应的大孔径浓缩胶中，其泳动速度居第二。因此泳动速度为 Cl &Pr&甘氨酸离子。－随着电泳过程的进行，走在最前面的 Cl 带与后面的 Pr 带之间，形成了离子浓度较低的低导－电区，根据电压=电流×电阻的关系，可知在此低导电区，有较高的电势梯度，同理在 Pr 带与甘 氨酸离子带之间，也有同样的现象发生。高电势使 Pr 和甘氨酸离子的移动速度加快，形成一个迅 速移动界面，但由于 Pr 的有效电泳率居第二，而使 Pr 聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一狭 窄的中间层。所以被分离的 Pr 样品，体积稍大，只要通过此浓缩过程，也能形成一狭窄区带。 [操作步骤 ： 操作步骤]： 操作步骤 （一）凝胶的制备 SDS-凝胶电泳可采用柱型，也可采用板型，本文以柱型不连续系统、板型连续系统为例叙 述。 （1）SDS-不连续系统柱状凝胶的制备步骤 装管：选取若干支洁净干燥的玻璃管（内径 5-6ml，外径 7-8ml,长 80-100ml）,在 65ml 高度处做好制胶长度的标记，然后分别垂直放入制胶玻璃管架上（参见图 5-2）（图 14）玻璃管 （ ）（图 ） 。 下口必须封好，封闭的方法根据具体条件而定。可以在玻璃管的下口用一层薄膜封住，常用的薄 膜为 Parafilm(商品名，American Can Company 产品)；或在玻璃管的下口套上一小段乳胶管，乳 胶管内塞入直径为 0.7-0.8cm 的玻璃珠。也可以将玻璃管的一端插在青霉素或疫苗小瓶的橡皮帽 中（如图 5-3） 图 15） ） （图 ） ，使其垂直站立在桌面上或管架中。与橡皮接触的部分凝胶不易聚合，可 （ （ 在橡皮帽中先加 2-3 滴 40%蔗糖。37见《高级生物化学实验教程》P46 图 5-25-3（图 14） ） （图 15） ）配胶：根据所测蛋白质分子量范围，选择某一合适的分离胶浓度，按照表 5-3 所列的试 表 剂用量和加样顺序配制某一合适浓度的凝胶。（表 18） ）插入表 5-3 见《高级生物化学实验教程》P46凝胶液的注入和聚合 分离胶胶液的注入和聚合：用尖头滴管或注射器将凝胶液沿玻璃管内壁缓缓注入，直至 6.5cm 高度的标记处为止。用一注射器通过注射针头沿玻璃管内壁缓缓注入 0.5-1cm 高度的蒸馏 水进行水封。水封的目的是隔绝空气中的氧，并有助于消除凝胶柱表面的弯月面，使凝胶柱顶部 的表面平坦，水封切忌注入的蒸馏水呈滴状垂直下落，否则会使顶部的凝胶浓度变稀，从而改变 预定的凝胶孔径，并造成凝胶表面不平坦。 水层放好后，静置凝胶液进行聚合反应，聚合时温度要与电泳时温度相同。正常情况 10min 开始聚合，应控制在 30min-1h 内完成。 刚加水时看出有界面，后逐渐消失，等到再看出界面时，表面凝胶已经聚合，再静置 30min 使聚合完全。 浓缩胶胶液的注入和聚合：用注射器或滴管吸去分离胶胶面顶端的水封层，并用无毛边的 滤纸条吸去残留的水液，滤纸尽量不要接触分离胶的胶面。 按比例混和浓缩胶，按表 5-3，先用这种凝胶液很快漂洗一下分离胶顶部。除去漂洗液后， 按上法用细滴管加入浓缩胶约 0.5-1cm 高（0.2-0.4ml 或为样品液的 1.2 倍） ，立即按上法小心地加 水层。静置聚合，待出现明显界面表示聚合完成。浓缩胶也可用光聚合法，即不用 AP 液，代之38加入 1-1.5ml 的 4%核黄素溶液（4mg 核黄素溶与水中，加水到 100ml） 。浓缩胶如用核黄素催化， 应在距管 10cm 处用日光灯照， 进行光聚合。 注意不要使温度上升过高。 正常情况下， 照射 6-7min 就可看到浓缩胶呈乳白色，表明聚合开始，继续照射半小时，使聚合完全。 （2）SDS-连续系统板状凝胶的制备步