Patent CNA - 一种钾离子通道蛋白基因、其编码的蛋白及其应用 - Google PatentsCN AApplicationCN Jul 24, 2013Apr 26, 2013Apr 26, 2013.6, CN
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(3) , 一种钾离子通道蛋白基因、其编码的蛋白及其应用
本发明属于生物技术领域，具体公开一种钾离子通道蛋白基因、其编码蛋白及该基因在植物钾吸收及耐盐性方面的应用。本发明的基因来源于盐角草，命名为SeAKT1，该基因具有K+吸收功能，能提高转基因拟南芥在3mM和100μM K+环境中K+利用率，是一种双亲和性钾通道蛋白。这预示着它在农作物钾高效利用方面的应用价值，可减少钾肥的施用，从而降低生产成本。该基因也能提高转基因拟南芥在缺钾及盐胁迫条件的K+吸收能力，同时减少对Na+的摄入，提高了K+/Na+，从而提高了植物的耐盐性。这种提高转基因植物的耐土壤低钾和耐盐的特性，可通过转基因技术应用于农作物上，从而应对日益严重的土壤低钾和盐渍化问题。
1.一种钾离子通道蛋白基因，其特征在于，该基因具有下列核苷酸序列之一:
①该基因具有序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38?2614位所示的碱基序列；
②该基因与序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38?2614位所示的碱基序列具有95%以上的同源性，且编码相同蛋白质的碱基序列。
2.—种钾离子通道蛋白，其特征在于，该蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸残基序列组成。
3.—种钟尚子通道蛋白衍生蛋白质，其特征在于，该蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而产生的具有相同的生物学功能的衍生蛋白质的氨 基酸序列。
4.一种含有权利要求1所述的钾离子通道蛋白基因的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，其表达载体为PBI121。
6.一种含有权利要求4或5所述重组表达载体的宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，该宿主细胞为根癌农杆菌GV3101菌株。
8.如权利要求1所述的基因在提高转基因植物在不同钾浓度环境下K+的利用率方面的应用。
9.如权利要求1所述的基因在提高转基因植物在低钾和盐胁迫环境下K+的利用率和耐盐性方面的应用。
一种钾离子通道蛋白基因、其编码的蛋白及其应用
[0001] 本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种钾离子通道蛋白基因、其编码的蛋白及该基因在植物钾高效利用和耐盐性方面的应用。
[0002] 钾是植物生长所必需的大量营养元素之一，广泛分布于植物的各组织和器官，是植物细胞内含量最丰富的一价阳离子。钾在植物众多生理功能中发挥着重要的作用，如维持细胞离子平衡、调节细胞膨压、调节各种酶的活性以及参与蛋白质合成等，维持高并且相对稳定的钾含量对植物生长至关重要。植物缺钾会出现明显的缺钾症状，表现为易倒伏，叶片易失水，耐旱耐盐性降低，叶片发黄和组织坏死等。耕地土壤缺钾会导致农作物产量和品质大幅下降。因此，维持植物生长过程中钾营养供给十分重要。我国的大部分耕地供钾不足，其中严重缺钾土地约2000万公顷，占耕地总面积的20%以上。并且，我国钾矿资源匮乏，钾肥的年产量十分有限，缺钾状况严重影响着我国农业的发展。
[0003] 同时，土壤盐溃化是一个全球性的生态问题。过量的钠离子对植物的成长具有毒害作用，大部分农作物在盐胁迫状态下不能正常生长，表现为发育迟缓，发芽率降低，器官生长和分化受到抑制，新陈代谢减缓等症状。土壤盐溃化不仅会造成粮食减产，也是土地荒漠化和耕地退化的主要原因之一，严重制约着农业生产。
[0004] 研究表明，不同种类的植物或同种植物的不同品种对土壤缺钾和盐胁迫的生理反应及对钾的吸收利用效率存在明显差异，并且这种差异性是可以遗传的，说明植物这种性状是由遗传基因控制的。在高盐环境下仍具有钾吸收能力，进而维持高的K+/Na+比是决定植物的耐盐性的关键因素。因此，植物钾吸收能力与其耐盐性息息相关。自从20世纪90年代以来，许多负责植物钾吸收及转运的钾离子通道基因和钾离子转运蛋白基因被相继克隆和鉴定。其中，钾离子通道在植物钾吸收中起着重要的作用，研究钾离子通道基因，为我们深入认识和理解作物体内钾的吸收及利用机制，进而提高钾的有效利用率具有积极的作用。目前，已有一些植物的钾离子通道被克隆并鉴定出来，如OsAKTl (水稻)，AKTl (拟南芥)，ZMK1 (玉米)，MIRK(甜瓜)和MKTl (冰叶日中花)等。然而这些基因大部分来自甜土植物，并且多数对Na+敏感，其中包括来自盐生植物的MKTl。在土壤既缺钾又有盐溃化的情况下，只有对Na+不敏感的钾转运蛋白才能正常发挥功能，使转基因作物既耐低钾又耐盐，因此考虑从真盐生植物盐角草中分离对Na+不敏感的钾转运蛋白基因。所以，本专利采用双子叶盐生植物盐角草为实验材料。
盐角草(Salicornia europaea): —年生双子叶草本植物,藜科盐角草属，一般生于盐碱地、盐湖旁及海边。盐角草属植物是迄今为止报道过的地球上最耐盐的陆生高等植物类群之一，其在600mM盐浓度条件下也能吸收钾离子，维持植物正常生长。(盐角草种子采于大连市营城子海边的盐碱地，并于实验室中种植，用含300mM NaCl的l/2Hoagland营养液定期灌溉。自然条件下培养)。发明内容
[0006] 为了解决上述问题，本发明公开一种钾离子通道蛋白基因、其编码蛋白及该基因在植物钾吸收及耐盐性方面的应用。该基因是从盐角草中分离出来的，具有K+吸收功能，是一种双亲和性钾通道蛋白。这预示着它在农作物钾高效利用方面的应用价值，可减少钾肥的施用，从而降低生产成本。该基因能提高转基因拟南芥在缺钾及盐胁迫条件的K+吸收能力，同时减少对Na的摄入，提闻了 K /Na ,从而提闻了植物的耐盐性。这种提闻转基因植物的耐土壤低钾和耐盐的特性，可通过转基因技术应用于农作物上，从而应对日益严重的土壤缺钾和盐溃化问题。
[0007] 本发明的技术方案如下:
[0008] 本发明的目的之一在于提供具有钾吸收功能的钾离子通道蛋白基因，该基因是从盐角草中分离出来的，具有下列核苷酸序列之一:
[0009] ①该基因具有序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38?2614位所示的碱基序列；
[0010] ②该基因与序列表中SEQ ID N0.17或其自5’端38?2614位所示的碱基序列具有95%以上的同源性，且编码相同蛋白质的碱基序列。
[0011] 本发明的目的之二在于提供了具有上文所述钾离子通道蛋白的编码蛋白，该蛋白由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸残基序列组成；且提供了该钾离子通道蛋白的衍生蛋白质，即由序列表中SEQ ID N0.18的氨基酸残基经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加而产生的具有相同的生物学功能的衍生蛋白质的氨基酸序列。
[0012] 本发明的目的之三在 于提供一种重组表达载体，该重组表达载体上含有上文所述的钾离子通道蛋白基因；且在优选的技术方案中，是以PBI121作为表达载体，本发明的实施例中，具体公开了重组载体的构建方法和鉴定方法。
[0013] 本发明的目的之四在于提供一种含有上文所述重组表达载体的宿主细胞；且在优选的技术方案中，该宿主细胞为根癌农杆菌GV3101菌株，本发明的实施例中，具体公开了根癌农杆菌GV3101为宿主菌的实验方法。
[0014] 本发明的目的之五在于提供上文所述的钾离子通道蛋白基因在提高转基因植物在不同钾浓度环境下K+的利用率方面的应用；以及该基因在提高转基因植物在低钾和盐胁迫环境下K+的利用率和耐盐性方面的应用；尤其在优选的技术方案中，该基因在改良拟南芥性状中有较好的应用效果。
[0015] 总之，本发明的基因SeAKTl具有钾离子通道蛋白的功能，本发明的实施例证明它能提高转基因拟南芥在3mmol和100 μ mo I浓度K+环境下的K+吸收效率和在缺钾、盐胁迫下的K+吸收能力，提高K+/Na+，进而提高植物钾利用效率及耐盐性，同时也预示着它在农作物钾高效利用和耐盐性方面的应用价值。
[0016] 图1为SeAKTl基因克隆PCR电泳图。其中，A为保守区部分片段克隆；B为3’端部分片段克隆；C为5’端部分片段克隆；D为ORF全长PCR电泳图。Ml:DL2000marker ；M2:λ -EcoT14marker。图中结果显示:A:克隆所得保守区片段长度约为750bp ；B:克隆所得3’端片段约为2000bp ；C:克隆所得5’端片段长度约为800bp ；D =SeAKTl开放性阅读框长度为2577bp。将上述克隆所得序列测序后进行blast比对，结果表明所得片段均与Shaker家族钾离子通道基因存在较高同源性。
[0017] 图2为本发明的SeAKTl基因编码的蛋白的结构图。图中结果显示该基因具有S1-S6六个跨膜结构域，cNMP结合位点及ANK结构域。从而表明SeAKTl是典型的Shaker家族内向整流型钾离子通道。
[0018] 图3为本发明的钾通道蛋白SeAKTl疏水性分析图。图中结果显示该蛋白具有S1-S6六个跨膜结构域，cNMP结合位点及ANK结构域，从而表明SeAKTl是一个跨膜蛋白，并具有Shaker家族钾离子通道蛋白的一般结构特征。
[0019] 图4为本发明的SeAKTl基因编码的蛋白的进化分析图。图中结果显示该基因与AKTl亚族中的Mktpl和NKTl等亲缘关系较近，表明该编码蛋白属于钾离子通道蛋白家族的AKTl亚族。(钾离子通道SeAKTl的氨基酸序列采用ClustalX程序预测，并采用MEGA5软件构建进化树。AKT1/2/5, KATI/2, AtKCl 和 G0RK/SK0R-拟南芥；SPIK, PeKCl/2-杨树；NKTl-烟草；RCAKTl/2/3/6-蓖麻；Mktpl-冰叶日中花；DKT1-胡萝卜；LKT1-西红柿；TaAKTl-小麦；ΗνΑΚΤ1-大麦；PutAKTl_ 星星草；0sAKTl，0sKT2-水稻。)·[0020] 图5为不同处理下，SeAKTl半定量RT-PCR电泳图。其中A为不同处理下幼苗中SeAKTl表达情况；B为不同处理下成苗中SeAKTl表达情况。其中A图中1:未处理；2:缺钾处理；3:100mM NaCl处理；4:缺钾+IOOmM NaCl处理。B图中1:未处理；2:缺钾处理；3:700mM NaCl处理；4:缺钾+700mM NaCl处理。结果表明，在缺钾情况下幼苗和成苗中表达量均有所上调，尤其是幼苗中上调幅度尤为明显；在缺钾+盐胁迫处理的情况下，幼苗(缺钾+IOOmM Na+)和成苗(缺钾+700mM Na+)中表达量都有所增加；在幼苗中IOOmMNa+处理下表达量上升而成苗中700mMNa+处理下表达量略有下调。据报道，AKTl类的钾离子通道(如:MKTl、OsAKTl、AKTl)在外部浓度为400mM，150mM或者50mM的时候表达量剧烈下调，而SeAKTl在IOOmMNa+处理下的盐角草幼苗中表达量上升，在700mMNa+处理下成苗中表达量只略微下降，相比之下具有明显优势。
[0021] 图6为重组植物表达载体pBI121_SeAKTl的结构图谱。表明该基因可在35S启动子的调控下组成型表达，重组载体具有卡那霉素抗性。
[0022] 图7为转SeAKTl基因拟南芥植株的卡那霉素筛选图。a:野生型拟南芥未加卡那霉素筛选；b:转基因拟南芥加卡那霉素筛选；c:野生型拟南芥加卡那霉素筛选；图示的结果证明转SeAKTl基因阳性苗具有卡那霉素抗性，可在卡那霉素下正常生长；而野生型拟南芥则只长出两片子叶，无法继续长出真叶，并逐渐枯萎变黄，直至死亡。
[0023] 图8为本发明SeAKTl基因的转基因拟南芥在不同处理条件下的K+、Na+含量及K+/Na+情况。WT:野生型拟南芥；SeAKTl:转SeAKTl基因拟南芥；Control:正常MS培养基；_K:缺K+MS培养基；+Na:75mM Na+MS培养基；_K/+Na:缺K++75mM Na+MS培养基。结果显示:与对照组相比，处理条件下转基因拟南芥与野生型拟南芥根和冠(地上部分)中钾含量均有所下降，但转SeAKTl基因拟南芥中钾含量下降幅度更小一些；在Na+胁迫下，转基因拟南芥和野生型拟南芥中的Na+含量均有较大幅度的升高，但相对而言，转基因拟南芥根和冠中的Na+含量均低于野生型拟南芥；与对照组相比，在不同胁迫条件下转基因和对照拟南芥根部和冠中的K+/Na+均有明显降低，但转基因拟南芥的K+/Na+要明显高于野生型拟南芥。表明SeAKTl基因可以使胁迫条件下的转基因拟南芥吸收更多的K+，并且减少对Na+的摄入，从而使细胞内维持相对较高的K+/Na+，保证植株正常生长代谢，提高了植物的耐低钾和耐盐性。
[0024] 图9为本发明SeAKTl基因的转基因拟南芥在3mmol浓度K+环境下的K+耗竭实验。图中结果显示在3mmol浓度K+环境下，转SeAKTl基因拟南芥耗竭液中K+浓度下降的更快，并且终浓度更低。表明转基因拟南芥在毫摩尔浓度K+环境下K+吸收效率有所提高。
[0025] 图10为本发明SeAKTl基因的转基因拟南芥在100 μ mol浓度K+环境下的K+耗竭实验。图中结果显示在100 μ mol浓度K+环境下，转SeAKTl基因拟南芥耗竭液中K+浓度下降的更快，并且终 浓度更低。表明转基因拟南芥在微摩尔浓度K+环境下K+吸收效率有所提闻。
具体实施方式:
[0026] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。
[0027] 下面实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规条件或分子克隆中所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。
[0028] 下面是实例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029] 实施例一 SeAKTl基因cDNA的克隆与分析
[0030] 一盐角草总RNA提取
[0031] 称取50mg新鲜盐角草组织，于液氮中研磨成粉末，将研磨好的材料迅速转移至含有Iml trizol试剂的离心管中，震荡混匀；加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min ；4° C12000r/min, 10_15min，取上清；将上清转移至新的离心管中；加入0.5ml异丙醇，混勻，室温IOmin ；4° C, 12000r/min,离心IO弃上清,加入Iml冰预冷的70%乙醇(新鲜配制)，洗漆沉淀；4° C, 7500r/min, 5弃上清,室温晾干(勿太干),加入20 μ I RNase-freeddH20,充分溶解RNA，-70 ° C保存备用。1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取的质量。结果呈现了 28S、18S、5S三种典型的RNA带型，各条带清晰，无明显的拖尾现象，表明提取的RNA无明显降解，可进一步用于RT-PCR实验。
[0032] 二单链cDNA的获得
[0033] 以提取的盐角草总RNA为模板(500ng),按照宝生物Reverse TranscriptaseM-MLV反转录说明书进行反转录反应,得到的单链cDNA可直接用于2nd_Strand cDNA的合成或者PCR扩增等。
[0034] 三盐角草SeAKTl基因部分编码区的获得
[0035] ①简并引物设计。根据NCBI上提供的冰叶日中花、烟草、拟南芥、水稻和大麦等植物的AKTl家族基因序列进行同源性比对，在其高度保守区设计一对简并引物AKF (SEQ IDN0.1) /AKR (SEQ ID N0.2)。此简并引物中 Y=C/T，D=A/G，W=A/T，R=A/G。
[0036] ②PCR扩增。以反转录获得的单链cDNA为模板，AKF (SEQ ID N0.1)和AKR (SEQID N0.2)为引物，PCR扩增SeAKTl通道基因部分编码区。反应体系如下:
[0038] PCR 反应条件如下:先 94°C (5min);再 94°C (30s)，50°C (40s)，72°C (lmin),35个循环；最后72°C (lOmin)。将PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离(结果如图1A)，至溴酚蓝指示带位于凝胶2/3处，在紫外灯下切下750bp区域的凝胶放入1.5mL离心管中，用TaKaRa 公司(大连)的 MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0 回收试剂盒进行回收。
[0039] ③回收DNA片段连接、转化与测序。采用宝生物pMD18_T vector试剂盒,将回收后的PCR产物直接与T载体相连，反应体系如下:
[0041] 反应条件为16°C保温过夜连接，连接产物用于大肠杆菌转化。PCR及酶切检测获得片段长度约750bp的阳性克隆，送测序。测序结果见SEQ ID N0.14。将测序结果在NCBI上进行Blast-N比对显示:该序列与冰叶日中花MKTl，拟南芥AKTl，水稻OsAKTl，小麦TaAKTl和大麦HvAKTl基因序列的同源性分别达到69%，61%，57%，57%和53%。初步推断此cDNA片段是盐角草钾离子通道基因编码区的部分序列。
[0042] 四RACE法克隆盐角草SeAKTl基因3’ cDNA
[0043] ①3’RACE特异引物的设计。根据已获得的盐角草SeAKTl基因部分cDNA片段以及TaKaRa (大连)公司的 3’-full RACE Kit 提供的引物 3’RACE Outer Primer/3’RACE InnerPrime (表I)设计一对嵌套PCR引物:3'正向特异性外侧引物3-GSP1 (SEQ ID N0.3)，巢式特异性内侧引物3-GSP2 (SEQ ID N0.4)。
[0044]②巢式 PCR 反应。Outer PCR 反应用外侧引物 3-GSP1 (SEQ ID N0.3)和 3’RACEOuter Primer进行外侧扩增。反应体系如下:
[0046] PCR 反应条件如下:先 94°C (5min);再 94°C (30s)，55°C (40s)，72°C (2min)，35个循环；最后72°C (IOmin)0
[0047] Inner PCR反应以外侧PCR产物为模板，用内侧引物3-GSP2 (SEQ ID N0.4)和3’ RACE Inner Primer引物进行巢式扩增。反应体系如下:
[0050] PCR 反应条件如下:先 94°C (5min);再 94°C (30s)，55°C (40s)，72°C (2min)，35个循环；最后72°C(10min)。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离(结果如图1B)、切胶回收、连接克隆载体、转化大肠杆菌感受态、PCR及酶切检测(方法同上)，选取长度为2000bp的阳性克隆送测序。测序结果见SEQ ID N0.15。测序结果通过NCBI数据库做Blast-N比对，结果显示:该序列与冰叶日中花MKTl，蓖麻RcAKTl，烟草NKTl和杨树SPIK基因序列的同源性较高。初步推断此cDNA片段是盐角草钾离子通道基因3’端部分序列。
[0051] 五锚定PCR法克隆SeAKTl基因5’ cDNA
[0052] 本实施例中SeAKT15’ cDNA序列采用锚定PCR方法获得。步骤如下:根据已克隆得到的SeAKTl基因保守区序列设计2条特异性巢式引物，以盐角草总RNA反转录成的cDNA为模板，用外侧特异性引物5-GSP1 (SEQ ID N0.5)为引物进行单引物扩增，在末端转移酶(TdT)的作用下，在单链扩增产物的3’末端加上寡聚鸟嘌呤Oligo d(G)，以加尾产物为模板，利用特异性引物 5-GSP2 (SEQ ID N0.6)、5_GSP3 (SEQ ID N0.7)和 Oligo d(C)为正反向引物对加尾的产物进行PCR扩增，将PCR结果电泳，切取目标条带回收测序，并鉴定。
[0053] ①单引物扩增
[0054] 以反转录产生的盐角草单链cDNA为模板，首先以5-GSP1 (SEQ ID N0.5)为引物进行单引物扩增，反应体系和反应条件如下:[0055]
dNTP Mixture(2.5mM each) 2μΙ
IOxLA PCRBuiferIl 2pL
5-GSPf (SEQIDN0.5) 2pL
LATaq (SU/pL) 0.2μ?
ddH20 总体IH 20pL
[0056] PCR 反应条件如下:先 94°C (5min);再 94°C (30s)，57°C (40s)，72°C (lmin), 35个循环；最后72°C (IOmin)0
[0057] ②加尾反应
[0058] 将以上PCR产物用于加尾反应。混匀反应液，于37°C温浴3h。20 μ I反应体系如下:
SxTDT Buffer 4μ1
0.1%BSA 2μ1
dGTP(lOmM) Ιμ?
TDT 0.5μ1
<<TWI 物扩 Iff 产物 12.5μΙ
[0060] ③巢式PCR扩增
[0061] 以上述加尾产物为模板，Oligo(Cic)15为正向引物，先后以特异性巢式引物5-GSP2(SEQ ID N0.6)、5-GSP3 (SEQ ID N0.7)为反向引物进行巢式PCR反应。PCR反应体系如
dNTP Mixture(2.5mM each) 5pL
IOLA PCR BufferI1.\uL
5-GSP2 (SEQ ID N0.6)或5-GSP3 (SEQ IDN0.7) 2pL
Oligo (dC)is 2pL
LATaq C5U/pL) 0,5pL
CWH2O 总体枳至50μ?
[0063] PCR 反应条件如下:先 94°C (5min);再 94°C (30s)，58°C (40s)，72°C (lmin), 35个循环；最后72°C(10min)。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离(图1C)、切胶回收，连接克隆载体，转化大肠杆菌感受态，PCR及酶切检测片段长度，方法同上，检测长度约为SOObp的阳性克隆送测序。测序结果见SEQ ID N0.16。通过NCBI数据库对测序结果进行Blast-N比对，结果显示:该序列与冰叶日中花MKT1，葡萄VvAKTl，胡萝卜DKTl和蓖麻RcAKTl基因序列的同源性较高，初步推断此cDNA片段是盐角草钾离子通道基因5’端部分序列。
[0064] 5SeAKTl基因全长cDNA获得
[0065] 将上述SeAKTl通道基因保守区、3’端和5’端片段进行拼接， 得到3189bp的cDNA序列(SEQ ID N0.17)，其中包括5'端非编码区37bp，3,端非编码区576bp，编码区2577bp，即自SEQ ID N0.17序列的5’端38位起始密码子ATG，至2614位终止密码子TGA的碱基序列，为2577bp的SeAKTl编码区，其编码一个由858个氨基酸构成的蛋白，将此钾离子通道蛋白命名为SeAKTl (SEQ ID N0.18);以盐角草cDNA为模板，根据拼接所得全长序列设计编码区全长引物 SeAKTl-S (SEQ ID N0.8)/SeAKTl-A (SEQ ID N0.9), PCR 获得该基因完整ORF的cDNA序列，长度为2577bp (如图1D)。酶切及PCR检测，选取3个长度为2577bp的阳性质粒测序，得到2577bp的SeAKTl编码区。测序表明此全长序列与拼接序列完全相同。
[0066] 6生物信息学分析
[0067]利用在线 expasy 软件(http://web.expasy.0rg/protscale/)对 SeAKTl 进行疏水性分析，结果表明SeAKTl具有多个跨膜结构域，是一个跨膜蛋白(图3)。系统发育树分析表明SeAKTl是典型的Shaker家族内向整流型钾离子通道(图4)，与已报道的冰叶日中花、拟南芥、大麦、水稻等植物钾离子通道蛋白氨基酸序列同源性在39%?69%之间。
[0068]表 ISeAKTlPCR 扩增引物
[0071] 实施例二不同处理条件下SeAKTl表达量分析
[0072] 盐角草幼苗发芽一周后，转入不同培养皿中处理48h。培养皿底部铺入4层滤纸，并分别以正常、缺钾(以Ca2+替代)、IOOmM NaCl和缺钾+IOOmM NaCl的l/2Hoagland营养液润湿。盐角草发芽四周后，选取长势一致的成苗5X4棵，分别转入4个水培容器中处理48h。水培容器分别加入等体积的正常、缺钾(以Ca2+替代)、700mM NaCl和缺钾+700mM NaCl的l/2Hoagland营养液,并定期通气。
[0073] 48h后分别称取经不同处理的0.05g长势一致的盐角草幼苗和成苗提取总RNA，合成cDNA，方法同实施例一。以内参基因Actin为对照，进行RT-PCR，引物碱基序列见表2。
[0074] 表2半定量RT-PCR扩增弓I物
[0076] 选择适合的PCR扩增循环数，一方面保证可在琼脂糖凝胶电泳中观察到PCR产物，另一方面保证PCR扩增在达到平台期之前，经过预实验最终确定扩增循环数为27个循环。PCR扩增反应体系如下:
[0079] PCR 反应条件如下:先 94°C (5min);再 94°C (30s)，55°C (40s)，72°C (lmin), 27个循环；最后72°C (lOmin)。此RT-PCR结果采用1%琼脂糖电泳检测，根据各条带亮度判断基因表达量的变化(图5)。结果表明，在缺钾情况下幼苗和成苗中表达量均有所上调，尤其是幼苗中上调幅度尤为明显；在缺钾+盐胁迫的情况下，幼苗(缺钾+IOOmM Na+)和成苗(缺钾+700mM Na+)中表达量都有所增加；在幼苗中IOOmMNa+处理下表达量上升而成苗中700mMNa+处理下表达量略有下调。据报道，AKTl类的钾离子通道(如:MKTU OsAKTU AKTl)在外部浓度为400mM，150mM或者50mM的时候表达量剧烈下调，而SeAKTl在IOOmMNa+处理下的盐角草幼苗中表达量上升，在700mMNa+处理下成苗中表达量只略微下降，相比之下具有明显优势。(其中A为不同处理下幼苗中SeAKTl表达情况；B为不同处理下成苗中SeAKTl表达情况。其中A图中1:未处理；2:缺钾处理；3:100mM NaCl处理；4:缺钾+IOOmM NaCl处理。B图中1:未处理；2:缺钾处理；3:700mM NaCl处理；4:缺钾+700mM NaCl处理。)
[0080] 实施例三转SeAKTl基因拟南芥的获得
[0081] 一.SeAKTl基因植物表达载体构建
[0082] ①pBI121表达载体质粒及pMD18T_SeAKTl质粒的提取。采用生工生物工程有限公司质粒小提试剂盒(SK8192)的操作步骤，提取质粒，具体方法见说明书。
[0083] ②SeAKTl编码区与表达载体连接片段的获得。分别用Xba I和Sac I对pMD18-SeAKTl和pBI121质粒双酶切，以获得2577bp SeAKTl编码区片段和12947bp的PBI121载体大片段，用于连接。利用T4连接酶将以上两个片段进行连接、转化大肠杆菌DH5a，经PCR和酶切检测后筛出长度正确的克隆，获得了 SeAKTl基因的植物重组表达载体pBI121-SeAKTl。酶切反应37°C温浴过夜，反应体系如下:
[0085] ③连接。回收酶切后的SeAKTl基因片段和ρΒΙ121大片段用TaKaRa T4DNA连接
酶将二者连接。连接反应条件为16°C温浴过夜，体系如下:
[0088] ④采用热击法将连接液转化大肠杆菌DH5a。PCR及酶切检测，根据片段长度(2577bp)筛选出阳性克隆，
[0089] ⑤阳性重组质粒转化农杆菌。提质粒pBI121_SeAKTl，转化农杆菌GV3101感受态。根癌农杆菌GV3101感受态细胞的制备方法如下:挑取GV3101单菌落于含有100mg/L利福平和100mg/L链霉素的YEB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养过夜。取过夜培养的菌体按1:100的比例接种到50mL YEB液体培养基中，28°C，180rpm振荡培养3_4h至细菌生长对数期OD6qq=0.5-0.6左右。取5mL菌液于4°C, 4000rpm离心lOmin,沉淀用5mL预冷的TE (pH7.5)洗涤一次，加ImL新鲜的YEB培养基，重新悬浮，分装，_70°C保存。
[0090] 采用冻融法将质粒pBI121_SeAKTl导入农杆菌，方法如下:取一管(0.2mL)根癌农杆菌(Agribecterium tumefaciens) GV3101菌株感受态细胞置冰上融化,加入Iyg质粒pBI121-SeAKTl，混匀，然后依次在冰上、液氮中及37°C水浴中放置5min，用YEB液体培养基稀释至lmL，于28°C，180rpm振荡培养2_4取适量菌液涂布于含有100mg/L利福平、50mg/L卡那霉素和100mg/L链霉素的YEB平板培养基上，28°C培养36h左右长出抗性菌落。PCR及酶切确定阳性克隆。
[0091] ⑤花器浸泡法转化拟南芥
[0092] 首先，制备用于转化的农杆菌菌液。以1:100比例接种农杆菌于有YEP培养液(YEP+100mg/L利福平+100mg/L链霉素+50mg/L卡那霉素)的试管中。28°C，200rpm摇过夜。次日早上将已活化的菌按1:100的比例加入250ml新鲜的YEB中继续按上述条件培养，当0D_达到2.0左右时取出，40C，4000rpm离心lOmin，收集菌体，倒掉上清，用250ml转化液(l/2MS+50g/l 蔗糖和 0.5ml/LSilwet-77，用 KOH 调 PH 值为 5.8)悬浮菌体，OD600 为 0.8左右。选取株高10-15cm左右,最大花序已产生一个角果的野生型拟南芥苗用于转化,转化前一天将苗浇透。将果荚及已开放的花朵全部剪掉，只留花蕾，用宽胶布把花盆的土封好。将准备好的拟南芥植株倒插入转化液中，确保所有的花蕾都浸入农杆菌悬液中，顺时针缓慢摇晃2min。标记好已转化植株,将植株平放于避光盒子内，上盖封口膜封好,避光培养2天后，将植株立起正常培养，收获种子(转入的当代为Ttl代，其收获的种子为T1代转基因种子)。
[0093] ⑥转基因拟南芥卡那霉素筛选(图6)
[0094] 于培养基中无菌筛选转基因拟南芥植株。T1代转基因拟南芥种子经过70%酒精(30s)和0.1%升汞(7min)消毒后种植于含50mg/L卡那霉素的MS培养基(MS+0.7%琼脂+3%蔗糖，pH6.0)中，4°C暗培养2天，之后转入光周期为16h/8h (光/暗)，温度为22°C -25°C的组培间培养。长出的阳性苗为T1代转基因苗。同样的方法获得T2代转基因拟南芥苗，用于生理检测。
[0095] 实施例四SeAKTl在转基因拟南芥中的K+、Na+含量测定。
[0096] MS培养基中生长的拟南芥苗发芽约一周左右，可筛选出阳性植株。以野生型拟南芥为对照，在正常MS培养基，缺钾MS培养基，加75mM Na+的正常MS培养基和加75mM Na+的缺钾MS培养基(培养基成分见表2)中生长，每皿20棵幼苗，竖直放置，7d后分别收获根和冠。将待测的拟南芥根部和冠部组织置于恒温干燥箱中，120°C杀青2小时，然后68°C烘干至恒重(24h)，称干重，置于IOOml三角瓶中，用5mL浓硝酸与高氯酸混合液(4: I, v/v)于暗室中消化一夜，高温加热使酸挥发干净，冷却至室温，分别加入去离子水溶解，定容。原子吸收测钾钠含量。每个试验设有三次重复。
[0097] 实验结果:与对照组相比，在缺钾处理下转基因拟南芥与野生型拟南芥根和冠中钾含量均有所下降，但转SeAKTl基因拟南芥中钾含量下降幅度更小一些；在似+胁迫下，转基因拟南芥和野生型拟南芥中的Na+含量均有较大幅度的升高，但相对而言，转基因拟南芥根和冠中的Na+含量均低于野生型拟南芥；与对照组相比，在不同胁迫条件下转基因和对照拟南芥根部和冠中的K+/Na+均有明显降低，但转基因拟南芥的K+/Na+要明显高于野生型拟南芥。
[0098] 该实验在转基因拟南芥中验证了钾通道蛋白SeAKTl的功能，证明了胁迫条件下的转基因拟南芥能吸收更多的K+，并且减少对Na+的摄入，从而使其根部和叶片K+/Na+均高于野生型烟草，提高了耐低钾和耐盐性。
[0099] 表2培养基成分对照表(微量元素、铁盐、以及蔗糖、琼脂加入量不变。)
[0101] 实施例五SeAKTl在转基因拟南芥中的钾耗竭实验
[0102] 材料培养和饥饿处理:称取实施例三中的转基因拟南芥种子5mg，表面消毒、春化后播撒于MS培养基上，每皿两排，光照培养6-7天(刚长出2片真叶)，期间每天更换一次培养皿的位置，以使光照条件尽量一致；之后转入装有50mL饥饿液(200 μ MCaSO4,0.5mMMES，用Tris调节pH至5.8)的三角瓶中钾饥饿处理36小时，其间每隔12h更换一次饥饿液。所用的玻璃器皿用稀释的硝酸浸泡后，清洗干净。
[0103]饥饿液:5mM MES ；200 μ M CaSO4 ；pH5.8 (Tris 调)；
[0104]耗竭液:5mM MES ；200 μ M CaSO4 ；ρΗ5.8 (Tris 调)，另加入 100 μ M 或 3mM KCl ；
[0105] 以溶液耗竭法(Derw等，1984)进行各个株系的钾吸收动力学测定、比较。取饥饿处理48小时后的植株，吸干表面水分，转入装有25ml含有3mM和100 μ M KCl耗竭液的三角瓶中，置于摇床上(150r/min)在与培养条件一致的环境中进行溶液耗竭-钾吸收实验。植株放入耗竭液中平衡5分钟后开始取样，每次取500μ L耗竭吸收液，补入相同体积的超纯水，使耗竭液的体积保持不变。直到耗竭液中钾浓度维持稳定时结束取样。
[0106] 实验结果显示在3mM K+浓度下，随着耗竭时间的增加，转SeAKTl基因拟南芥和野生型拟南芥的耗竭液中的钾离子浓度都在逐渐降低，即钾离子都得到了吸收。然而，相比之下，转基因拟南芥钾离子浓度变化幅度更大，并且其耗竭液中钾离子的终浓度也小于野生型拟南芥耗竭液(如图9)。表明转化SeAKTl基因的拟南芥具有低亲和钾吸收能力，能在外界毫摩尔级K+条件下更有效地吸收K+，维持植物的钾素营养。
[0107] 同样，在100 μ M外部K+环境中转基因拟南芥耗竭液中钾离子浓度变化更大一些，24h后溶液中剩余钾离子浓度也小于野生型拟南芥耗竭液(如图10)。表明转化SeAKTl基因的拟南芥具有高亲和钾吸收能力，能在外界毫微尔级K+条件下更有效地吸收K+的能力。
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