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冰核活性细菌Xampelina TS206固定化技术其在冷冻浓缩领域的应用の研究
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云芝菌用于糖厂有色废水生物漂白及产生多糖的研究分析.pdf 116页
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华南理工大学博士学位论文云芝菌用于糖厂有色废水生物漂白及产生多糖的研究姓名：冉艳红申请学位级别：博士专业：制糖工程指导教师：杨连生摘要摘要糖厂有色废水嫩物治理一崴是人们研究的重大科研课题。目前，我国对予糖厂有色废水约一些雯携溜理方法辍然可班去除80．90％鹣BOD，但都不熊有效去除蠢色物质，鸯效的生物漂白研究采见报导。泼液颜色污染治理成为国际糖业界研究热点。由国内外相关研究知，云愁(Corio，“s越戆应震价蓬。云笺蓥丝嚣貔生长不震要光照，营养要求筵攀，不受耱厂深色废水遮光作用的影响，着将云芝引入对糖厂深色废水的治理中则会节省对废液添加化学助剂预处理的成本。本课题选取对糖厂废水脱色效率嘉虽生物多糖产量嘉静云慧蔻攮为戮懿对象，避学系统帮深入静磅究，首次开展用云慧菌治理糖厂废承颜色污染，同时收获多糖的研究。把环境污染治理与食品、药品的资源开发结合起来，具有深远的学术价值和工业应用前景。首先遴过对霾橡云芝菌裸黪院较壤养，选择了一橡对废永麓色能力强且多糖产量高的菌株PVCO为实验菌株。其次确定PVC0对模拟糖厂废水生物漂白的培养条件为：墙养温度30℃，起始pH蓬梵4，摇簸转遥l葡萄糖浓度为1％，氮浓度在6．1定量的生物素含量。然后将PVC0应用于糖厂实际瘦水离子交换再生渡豹漂白的研究表黉，将藏始废求两僚稀释，还藤糖浓痉诵整到1％，添黯适量生物素，可培养的菌丝体多糖产率提高1动控象l5L发藜罐敖大实验，魄愆疆簸壤羚减少4S小澈戆培养孵瀵。PVC0应用于糖厂酒精废液的漂白及收获菌丝体的研究表明，原始酒精废液五倍稀释，添加微量的生物素，调艇初始pH值为4．0，5L发酵罐现出较强酌对废水有机负荷的承受力，与一般的生物法处理酒精废液韵COD去狳效率穰当，餐具畜较簿瓣麓色效装，收获蘸丝俸量较大戮及大大缩短运行周期。进一步研究了在废水中生长的云芝菌丝形态学特征及细胞组织学特华南理工大学工学博士学位论文征，从菌丝细胞的群落特征及细胞组织变化的角度探索云芝对有色物质的生物漂白机理，阐明了废水培养过程PVCO新生菌丝球的分生机制；推理了废液培养的菌丝体外包被物的脱落机制；解释了在废液中生长的云芝菌丝的分枝频率远远大于在GPF培养基中的菌丝的原因。提出废液中云芝菌丝通过细胞壁的扩增、增加分枝来增大细胞壁面积，从而扩大与基质中待降解物质的接触面积来提高对废水的漂’白效果的观点，设想了云芝菌丝细胞壁扩增的机制。最后分析了废水培养对产生的云芝多糖结构的影响，结果表明废液培养所获得的多糖与用GPF培养相比较，特征活性结构没有受到影响。关键词：云芝；糖厂有色废水；生物漂白；多糖IIAbstracttreatmentofcoloredeffluenthasbeenadifficultBiologicalhighlytointhatofcase，the80—90％BOD5pf≮ectsugarfactory．EvencanbereducedatreatmentinChinaiSstillnobybiologicalnow；thereobviousremovalofforcolorants．Thedecolofiz赶tioneffluentsugarrefineryatohasbecomebesolvedinkeyproblemsugarindustry．Severalreportsindicatedthat￡versicolorhastheinpotentialapplicationofcolorantsexistedinindustrialwastewaterandmedicinalilluminationwasneededfortheofCversicoJorgrowthculturemediumfortheoutC．versicolorwasofsimple，SOblockinglightbycolorantshadnobadeffectOlltheofC．versicolorWaSgrowthmyceliam。Ifusedforeffluentcolorantsinwiliiowerthebiodogradationsugarfactory，itcostofforeffluentwithchemicalpretreatmentagents。C。versicolorstrain，whichhasofcolorantsandOfhighability籍iodegr8da{i静nhighyieldselectedasinthismodelstraindissertation。Thenovelpolys8ccharide，wasbiotreatmentofeffluentdeeolo￡izationandthepolysaecharideproducti
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10十二碳二元酸产生菌热带假丝酵母的诱变
研究报告；中国酿造；2008年第21期总第198期?27?；十二碳二元酸产生菌热带假丝酵母的诱变；孙凤麟1，孙玉梅1，何连芳1，王淑华2；（1.大连工业大学生物与食品工程学院，辽宁大连1；摘要：以热带假丝酵母菌（Candidatropi；酵，对菌株诱变前后发酵产长链二元酸量进行了测定；关键词：热带假丝酵母菌；十二碳二元酸；诱变中图分；文献标识码：A；文章编号
2008年第21期总第198期?27?
十二碳二元酸产生菌热带假丝酵母的诱变
孙凤麟1，孙玉梅1，何连芳1，王淑华2
（1.大连工业大学生物与食品工程学院，辽宁大连.辽宁大学轻型产业学院，辽宁沈阳110036）
摘要：以热带假丝酵母菌（Candidatropicalis）为出发菌株，经紫外线和氯化锂复合诱变或亚硝酸诱变获得突变株。通过摇瓶分批发
酵，对菌株诱变前后发酵产长链二元酸量进行了测定。筛选出能够发酵产酸的突变株12株，其中8株表现出正突变，菌株最高产酸量提高了9.16%。
关键词：热带假丝酵母菌；十二碳二元酸；诱变中图分类号：Q813.5
文献标识码：A
文章编号：（7-03
InducedmutationofdodecanedioicacidproducingCandidatropicalis
SUNFenglin1,SUNYumei1,HELianfang1,WANGShuhua2
(1.CollegeofBio&FoodTechnology,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,C
2.CollegeofLightIndustry,LiaoningUniversity,Dalian110036,China)
Abstract:Inthisstudy,Candidatropicalis,thedodecanedioicacidproducer,wasmutatedbycomplexmutationofultravioletandlithiumchlorideorsinglemutationofnitrousacid.Bybatchfermentationinshakingflask,thedodecanedioicacidproductionofC.tropicalisbeforeandaftermutationwasdetermined.Theresultsshowedthat12mutatedstrainscouldproducedodecanedioicacid,and8ofthemwerepositivemutants.Thehighestdo-decanedioicacidyieldwasimprovedby9.16%.
Keywords:Cinducedmutation
长链二元酸是指碳链上含有10个以上碳原子的直链脂肪族二元酸，是重要的化工生产原料[1]。由于化学法生产工艺复杂、成本高、产品质量达不到标准，限制了长链二元酸产品的利用。发酵法生产工艺能够弥补化学合成法的不足，因此国际上对发酵法生产长链二元酸的技术极为关注[2]。能利用石油烃类的细菌、霉菌、放线菌的种群极多，但用于正烷烃发酵生产长链二元酸较好的微生物都研究人员利用各种手段来提高菌种的产酸量是酵母菌[3-4]。
与转化率，比较成功和常用的诱变方法有：（1）紫外线照射及氯化锂复合诱变；（2）亚硝酸钠处理诱变；（3）亚硝基胍处理诱变；（4）多倍体诱变；（5）N+离子注入诱变处理[5-10]。
本实验采用紫外线照射及氯化锂复合诱变和亚硝酸诱变技术，对十二碳二元酸发酵菌种进行诱变处理，以期提高菌株的产酸量。1材料与方法1.1菌种
热带假丝酵母菌（Candidatropicalis）：本实验室提供的126-1菌株。1.2培养基
收稿日期：
基金项目：大连市科技攻关项目资助（）
固体斜面培养基：5°Bé麦芽汁加入2%琼脂。液体种子培养基：KH2PO48g/L、蔗糖5g/L、玉米浆3g/L、酵母膏5g/L、尿素3g/L、正十二烷100g/L（v/v），用自来水溶解，自然pH值。
初始发酵培养基：Na2HPO46g/L、KH2PO42g/L、NaCl1g/L、MgSO41.5g/L、玉米浆1g/L、酵母膏5g/L、蔗糖5g/L、尿素2g/L、正十二烷200g/L（v/v），自来水溶解，自然pH值。
YEPD培养基：蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L、葡萄糖20g/L、琼脂20g/L、pH6.0。
选择培养基1-1：正十二烷20g/L、Na2HPO45g/L、KH2PO4
1g/L、尿素2g/L、琼脂20g/L。
选择培养基1-2：蔗糖4g/L、Na2HPO45g/L、KH2PO4
1g/L、尿素2g/L、琼脂20g/L。
指示培养基：蔗糖4g/L、Na2HPO45g/L、KH2PO41g/L、酵母膏2g/L、尿素2g/L、琼脂20g/L、正十二烷20g/L、2%的甲基红指示剂。
上述培养基均在0.1MPa灭菌20min，培养基中的尿素和正十二烷需在0.05MPa分消20min，在接种前加入培养基中。
作者简介：孙凤麟（1983-），女，硕士研究生，研究方向为微生物代谢控制发酵。
：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：
达[J].微生物学通报，）：54-58．[15]王
襟，等.嗜酸热硫化叶菌麦芽寡糖基海藻糖合
）：339-341.成酶基因的克隆和表达[J].生物工程学报，
[16]吴襟，于炜婷，王
辉，等.耐热古菌芝田硫化叶菌海藻糖生成相
关酶的基因克隆、表达和序列分析[J].生物化学与生物物理进展，）：798-802.
2008No．21SerialNo．198
ChinaBrewing
ResearchReport
1.3细胞培养
菌种活化：将低温冷藏的菌种取1环划接到麦芽汁斜面培养基上，于25℃恒温培养箱中培养2d。
液体种子培养：在250mL三角瓶中装入25mL种子培养基，接入2环经斜面活化培养的菌体，于30℃、210r/min振荡培养48h。
液体摇瓶发酵：在250mL三角瓶中装入20mL发酵培养基和5mL十二烷，按2%的接种量接种，调pH值为7.5~8.0，于30℃、210r/min振荡培养144h，每24h用2.5mol/L氢氧化钠调pH值为7.5~8.0。1.4菌种诱变1.4.1细胞悬浮液制备
在250mL三角瓶中装入25mL种子培养基，接入2环经斜面活化培养的菌体，于30℃、210r/min振荡培养48h。取1mL种子液，接入装有25mL种子培养基的250mL三角瓶中，于30℃、210r/min振荡培养48h。
将上述种子液于4000r/min离心10min，收集菌体，用pH7.0的无菌磷酸缓冲液洗涤2次，再用同样的缓冲液20mL将细胞悬浮。1.4.2紫外线氯化锂复合诱变
取10mL细胞悬浮液置于带有磁力搅拌的无菌培养距离30cm照射0s~120s，照射皿中，采用15W紫外灯，时开启电磁搅拌。每30s取菌液，适当稀释后涂布于含有0.2%氯化锂的YEPD平板，黑布包裹，30℃培养2d，菌落计数，绘制紫外氯化锂诱变致死率曲线[11]。1.4.3亚硝酸诱变
取细胞悬浮液2mL，加入1mLpH4.4的醋酸缓冲液，再加入1mL使NaNO2终浓度为0.025mol/L、0.05mol/L、0.075mol/L、0.1mol/L的NaNO2溶液，于30℃保温培养5min~10min，取2mL处理液加入pH8.6的Na2HPO4溶液，调
取液于100mL烧杯内，在通风橱中吹去乙醚，得白色固体十二碳二元酸。将提取到的二元酸加入25mL95%vol中用标准氢氧化钠溶液滴定，记性乙醇溶解，加入2滴酚酞，录消耗的氢氧化钠体积，计算十二碳二元酸的产量[13]。2结果与讨论
2.1热带假丝酵母菌的生长曲线
于装有25mL培养基的250mL三角瓶中接入2环经斜面活化培养的菌体，于30℃、210r/min振荡培养。每12h测培养液中的生物量，绘制菌体生长曲线，见图1。
76生物量（/g?L-1）
培养时间/h
图1热带假丝酵母菌生长曲线
Figure1.GrowthcurveofCandidatropicalis
从图1看出，热带假丝酵母菌约培养24h后进入对数生长期，培养48h转入稳定生长期，因此可选取菌龄为24h~48h处于对数生长期的细胞进行诱变处理，实验选取培养36h的菌体细胞进行诱变处理。2.2热带假丝酵母菌的紫外线诱变
采用紫外线照射后，取诱变后的菌悬液涂布于含有0.2%氯化锂的YEPD培养基中，30℃培养，菌落计数，绘制菌体致死率曲线，见图2。
120100致死率/%
诱变时间/s
整pH值为7，终止诱变，适当稀释反应液涂布于YEPD平板，30℃培养2d，菌落计数，绘制亚硝酸诱变致死率曲线[11]。1.4.4筛选菌种
将在YEPD平板培养的菌株分别接入选择培养基1-1与1-2中，于30℃培养2d。挑选在培养基1-1上生长良接种于指好，而在培养基1-2上不生长或弱生长的菌株，示培养基，于30℃培养2d，挑选周围变色菌体进行发酵培养，测其产酸量。1.5分析方法
生物量测定：采用菌体干重法[12]。
十二碳二元酸的提取与测定：将发酵液离心，回收上层未利用的十二烷，用滤纸过滤上清液。取3mL过滤液置于碘量瓶中，加适量玻璃珠，在沸水浴中加热，用6mol/L盐酸调pH值为2.0~3.0，加入100mL乙醚，摇瓶至十二碳二元酸完全溶解于乙醚中，静置30min后倒出50mL乙醚提
图2紫外线诱变菌体的致死曲线
Figure2.Mortalitycurveofultravioletirradiation
从图2看出，菌体经紫外线照射，其致死率随诱变时正突变一般出现在致死率为70%~80%时，间延长而增大。
因此研究选择紫外诱变时间为70s（致死率为78.2%）。2.3热带假丝酵母菌的亚硝酸诱变
采用亚硝酸诱变后，取诱变后的菌悬液涂布于YEPD培养基中，30℃培养，菌落计数，绘制菌体致死率曲线，见图3。
10080致死率/%
亚硝酸浓度（/mol?L-1）图3亚硝酸诱变菌体的致死率
2008年第21期
总第198期?29?
由附表可以看出，紫外线氯化锂复合诱变的菌株正突变率较高，接近80%，产酸最高达到49.93g/L，较对照菌株的最高产酸量提高4.19g/L；而亚硝酸诱变菌株的正突变率较低，产酸量无明显提高。3结论
经紫外线氯化锂复合诱变或亚硝酸诱变后，筛选出能够产酸的突变菌株共12株，其中8株表现了正突变，菌株
最高产酸量提高至49.93g/L。紫外线氯化锂复合诱变效果比亚硝酸诱变效果明显。参考文献：
[1]陈远童.长链二元酸的用途[J].微生物学通报，）：389.[2]陈远童.长链二元酸及其二步开发有待解决的问题[J].微生物学通报，）：104.
[3]陈远童.烃类氧化和生产长链二元酸的微生物[J].微生物通报，）：103.
[4]vanHAMMEJD,SINGHA,WARDOP.Recentadvancesinpetroleum
microbiology[J].MicrobiolMolBiolRev,）：503-549.[5]佟明友，张
全，李淑兰.现代生物技术在二元酸发酵菌种改良中的
应用[J].微生物学通报，）：91-93.
[6]陈远童.生产长链二元酸菌株的诱变筛选[J].微生物学通报，）：104.
[7]BasselJ,MortimerR.Geneticanalysisofmatingtypeandalkaneutilizat-ioninSaccharomycopsislipolytica[J].JBacterial,：894-896.[8]沈永强，姚佩华，焦瑞身.尿素对热带假丝酵母（Candidatropicalis）多倍体变种形成微体的影响[J].植物生理与分子生物学学报，1981（1）：257-259.[9]陈祖华，叶
晴，尹光琳.N+离子注入热带假丝酵母对长链二元酸产
佳，等.酸性α-淀粉酶菌株的诱变及酶的性质
量的影响[J].微生物学通报，）：174-177.[10]陈远钊，罗俊成，胡
研究[J].中国酿造，2007（1）：10-13.
[11]杜连祥.工业微生物学实验技术[M].天津：天津科学技术出版社，
[12]沈萍.微生物学[M].北京：高等教育出版社，8.[13]陈远童.长链二元酸发酵的特点及其控制[J].微生物学通报，2001，
28（4）：102.
Figure3.Mortalitycurveofnitrousacidinducedmutation
从图3可以看出，随亚硝酸钠浓度的增加菌体致死率增大，致死率为70%~80%时多为正突变，因此研究选用0.075mol/L亚硝酸进行诱变（致死率为78.2%）。2.4诱变菌株的筛选
经紫外氯化锂诱变、亚硝酸诱变处理菌种后，从培养3d的大量菌落中挑取生长快、菌落半径大的菌落共78株，接于YEPD平板30℃培养，2d后将YEPD平板培养的菌株分别接入选择培养基1-1与1-2，于30℃培养2d。挑选在培养基1-1上生长良好，而在培养基1-2上不生长或弱生长的菌落37株，将其点接于指示培养基，于30℃培养2d。挑选周围变色较大的菌落12株，将其接入发酵培养基发酵144h，测定产酸量的结果见附表。
附表菌株诱变前后的产酸量
Attachedtable.DodecanedioicacidyieldofCandidatropicalisbefore
andaftermutation
）产酸量（/g?L-1
产酸量（/g?L-1））
49.42.7646.64
注：0号为对照菌株；1~9号菌株为紫外氯化锂诱变菌株；10~12号为亚硝酸诱变菌株。
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《粮油加工》杂志征订启事
邮发代号：2-826（月刊）
创刊于1970年的《粮油加工》(原《粮油加工与食品机械》)是中国粮油学会油脂专业分会会刊。该刊为全国中文核心期刊、中国科技核心期刊、中国科学引文数据库来源期刊、中国学术期刊全文入编期刊、万方数据期刊数字化期刊群收录期刊等。
《粮油加工》杂志将继续坚持“全面、领先、实用”的办刊宗旨，奉行“立足粮油工业，关注行业热点，探求行业发展，注重实用技术”的办刊理念。
《粮油加工》杂志每月8日出版，大16开本，每期定价8.00元，全年96.00元。国内统一刊号：CN11-5534/TS，国际标准连续出版物号：ISSN，邮发代号：2-826，广告经营许可证：京朝工商广字第0004号。全国各地邮局（所）均可订阅。逾期可随时与杂志社联系补订。
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水生细菌生物量的估算方法
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富含DHA裂殖壶菌工业化生产试验、脂肪酸提取与应用及研究.pdf 137页
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中国海洋大学博士学位论文富含DHA的裂殖壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研究姓名：宋晓金申请学位级别：博士专业：海洋生物学指导教师：张学成富含DHA的裂殖壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研究摘要limacinumoUC88)的发酵论文主要对海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium培养，脂肪酸提取及其饵料效果进行了研究。主要探讨了发酵条件对细胞生长和产物形成的影响，并对菌株在发酵中的动力学特性进行了分析，分别在IOL、IOOL微生物发酵罐中进行了扩大实验。利用有机溶剂进行了裂殖壶菌胞内脂肪酸的提取研究。随后，进行了裂殖壶菌对轮虫卤虫营养强化及大菱鲆育苗的饵料实验。结果表明：1利用IOL生物反应器优化裂殖壶菌的发酵条件。首先进行单因子优化试验，试验因子有温度、pH、通气量、搅拌转速、接种量、发酵时间、接种菌龄，分别对试验因子设立一系列水平梯度，结果得到一条包含拐点的曲线，得出单个试验因子的最佳水平；依据单因子优化试验，对发酵温度，通气量，pH，转速，接种量，发酵体积，裂殖壶菌发酵产量起决定作用的因子是发酵时间，通气量，转速和接种菌龄；接下来对这四个因子进行旋转中心组合设计并结合响应面曲线得到最佳的发酵条件；得到最佳发酵条件后，对裂殖壶菌的发酵动力学进行了初步研究，利用数学公式对试验结果进行非线性拟合获得了裂殖壶菌发酵过程中的菌株生长的动力学模型，产物生成的动力学模型和底物消耗的动力学模型。利用IOOL生物反应器进行裂殖壶菌发酵的中型试验，基本证实了小试得到的结论，中试取得了较好的结果。最终产率为每升发酵液获得24．19裂殖壶菌干粉并含有二十二碳六烯酸(DHA)4．79。建立的菌株生长动力学模型为：X--9．19*eo一戤／(24．46．0．37,eO．OStl：产物生成动力学模型为：P=．0．25+O．2X2用裂殖壶菌干粉强化轮虫卤虫，提高饵料体内不饱和脂肪酸特别是DHA的含量，增加饵料的营养价值。高压气相色谱检测显示：经过12小时的强化，富含DHA的裂殖壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研究饵料进行大菱鲆育苗时，仔鱼的成活率达到12％和正常体色率85％，较之原来都有显著提高。3用有机溶剂和C0：超临界两种方法萃取细胞内的脂肪酸。利用正交试验设计分别获得两种提取方法的最佳条件组合。两种方法各有优点，有机溶剂法能提取细胞内全部的脂肪酸且萃取率较高，而C0：超临界法可以得到单一的DHA组分，没有有机溶剂残留，安全可靠。关键词裂殖壶菌；DHA：发酵优化；动力学模型；萃取；营养强化．富含DHA的裂殖壶菌的工业化生产试验、脂肪酸提取及应用研究acidTheindustrialisationdistillationandproduce，fattyapplicationoflimaniumOUC88SchizochytriumAbstractThisthesisisaboutamarinelimacinumheterotrophicfungalSchizochytriumOUC88．ItstudiedtheeffectenvirmentalfactorsOIlbo也thebacterialcellmainlyandinculture．Inordertoindustrializethegrowthproductssynthesissuspensionwholemiddle—scaleculturein10L、100Lfermentorandtheextractionprocess，themethodswerestudied．Theresultareasfollow：1．FermentationforbiomassandDHAofparametersproductionSchizochytriumlimacinumOUC88inavolume7fermenter(workingL)wereoptimizedusingPlackett-Burrnanandcentralrotatableof10factorsstudiedcompositedesign．OutbyPlackett-Burmaninfluencedthebiomassdesign，fourproductionrotatableWasusedtOthefactorsandcompositedesignoptimizesignificantresponsesurfacewerethesesurfaceandplotsgenerated．Usingresponseplotspointprediction，valuesofthefactorsweredetermined鹊followsoptimizedtemperature23℃，aerationrate
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