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PCR产物回收后,作为再次PCR的模板,为什么不可以?我反复扩增几次都失败了…之前回收的都可以做模板的…回收的模板单一，特异性好，也曾经稀释过1000倍，结果仍然一样无条带…
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那就说明这次的条带是非特异性条带呗 你怎么就确定特异性好了 不是只有一条就叫特异性好
有对照的…一个融合的片段，两个没融合的片段…
既然浓度又高 特异性又好 为啥还要拿这个做模板再P呢 直接用这个不就完了么
晕死！做TA克隆，没A末端，连不上啊大哥…要是直接可以用，我也不纠结了…
第一次用的不是taq是么
那就在第一次P的时候加一点taq进去就可以呗 照你说的什么都这么perfect了我们还能给你想出什么问题哦 PCR不就是那么回事么 不是模板就是引物 要么就是退火温度 在没有测序之前你都别说什么特异性好
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其他类似问题
回收率地，你用回收DNA跑个电泳看看，特暗或啥都没有。你先别回收，直接用产物扩。
回收的浓度特高…电泳也单一…现在头都大了！
我想你是用高保真酶扩增的，那么高保真没产物一般都没有A尾巴，但是如果想要A尾巴做TA克隆，可以直接在PCR产物上加-A，体系是（PCR回收产物，Taq酶，水，dATP，Taq PCR buffer），直接72度延伸20min即可。如果你仍想继续以回收产物为模板，那么要先检测你的条带是否为目的基因或是否有回收到产物，如果是目的基因，那么用它做模板，浓度不需要太严格，你电泳检测一下再扩增试试...
可以，不过我觉得回收后加更好点，应为直接加的话，高保真酶相关的一些buffer等还留着PCR产物里，影响加A效率。
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请求各位高手，我的扩增条带一直不单一，是什么原因？其回收后产物没有峰？，但A260/280和浓度都是可以的，下一步该怎么办？谢谢了！
该用户从未签到
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请问你的模板是什么DNA还是cDNA呢？不单一是只有两条带。三条带还是有很多呢？
不是单一的目标片段说明了你引物的特异性不强，如果是cDNA模板也有可能你的目标片段可能存在可变剪接，或是RNA存在DNA污染。关键是你目标片段有没有出来，你可以都割下来 连接 转化 测序看看
T载体连接 很少量便可以连接上去的，你可以将胶回收产物连上 转了 测序看看，
该用户从未签到
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二楼回答很正确，应该切了转了测了，我以前有个引物就是老是出两条带，结果后来发现两个都是一个（俺要的那个）基因的（基因组DNA扩的），有时候基因也有好些个，有长片段，短片段的！
该用户从未签到
谢谢了啊，我现在试试看，我的模版是CDNA，一直隐隐约约有三条，有目的条带的时候就有那几条带，现在又是一天能扩出来，一天又没有了，很烦人！回收后的产物也一直没有峰，不知道是怎么回事，也不知道怎么办，请求帮忙。
更新你的简历，加入生物秀人才库，高薪工作基因编辑峰会支持人类胚胎研究(胚胎、基因聚焦“基因剪刀”奠基人的科研历程韩春雨团队基因编辑技术取得新突破(团队,基肠道细菌影响癌症(cancer)治疗成功率(癌症
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&& 常见峰图及原因说明
测序常见峰图及原因说明
A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是，高质量的PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，希望您可以将PCR产物进行克隆处理，以确保得到好的测序结果。以下图为例：该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。
解决办法：改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该PCR产物克隆到质粒中，初步筛选后进行单克隆测序。
A-2.以下图为例：
碱基缺失常见在PCR产物中，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段，上图的186位缺失两个连续的T
解决方法：
&& (1) 使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的。或者将该PCR产物克隆到质粒中，挑取单克隆测序。
&& (2) 如果可以确定该PCR片段中不应该有缺失的位点，那么可以改变PCR反应条件，重新扩增。
A-3.以下图为例：
引物不纯造成移码现象，该种现象与模板杂在峰图都表现为背景峰较杂，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。
解决办法：重新合成引物，或者将引物进行PAGE纯化后再进行测序。
A-4.以下图为例：
重复结构将导致测序复制框的滑移，重复结构之后峰型混乱。
解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该重复结构处，即可完成模板全长的拼接。
A-5.以下图为例：
(1) 菌液为非单克隆：
&&下图是pGEM-T载体测序的结果，在83位点处测序结果出现双峰（插入后双峰），即模板中含有两个或两个以上的相同载体，但是插入片段不同。
&&解决办法：重新挑取单克隆或者重新提取质粒。需要注意的是，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不足以证明模板的单一。
(2) PCR产物不纯，如下图所示：
在197bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在197bp位置有一个高高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大小为200bp左右的小片段。
&&注：PCR产物测序都是以A高峰终止。
&&解决方法：对PCR产物切胶纯化，再进行测序。
A-6.以下图为例：
以polyT为例，在polyA/T结构之后往往出现移码、双峰、套峰现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减或者直接中断。
&&解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处，即可完成模板全长的拼接。如果是较长的PloyG/C，建议客户使用3.0试剂盒进行测序。
A-7.以下图为例：
位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。
&&解决方法：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处，即可完成模板全长的拼接。
A-8. (1) 产物中含有小片段PCR产物；(2) 引物有两个结合位点，其中一个结果中断
解决方法：换引物反向测序。
A-9.原因和解决方法同回文结构及插入后双峰。
A-10.以下图为例：
测序无信号的判定：
&&在确认引物、质粒抽提浓度、反应安排等条件无问题的情况下，测序结果峰型杂乱且信号值小于100的结果；此时则判定结果为测序无信号。两次测序无信号，我们会取消实验。
A-11.以下图为例
在用特殊试剂盒（3.0）时，会发生碱基替代，从而出现碱基位移的现象，即飘峰。
&&解决方法：用普通试剂盒（3.1）测序消除碱基位移。
&&注：3.0试剂盒只对局部高GC有效，对POlyA/T、重复结构（GT/GA等）无效，建议先用3.0试剂盒测序，然后用普通试剂盒进行纠正。
在线技术支持：>>实验技术>免疫技术>PCR优化
在PCR的优化开始阶段，应用新的DNA模板，引物或热稳定DNA聚合酶等材料建立的PCR方法，其扩增效果一般总不是最佳的。这种PCR反应通常要求尽量抑制非特异性扩增和（或）增加目的DNA产物的产率。表1列举了一些通常遇到的问题和对PCR反应进行优化的一些推荐方法。表1 PCR扩增的疑难解析问题&&解释&&补救措施目的产物条带在两种阳性对照管与试验管内部呈现明显的非常模糊的带型。目的产物条带有时呈不清晰的成片条带，条带在凝胶中扩散到较期望分子量更小的DNA分子量的区域内。&&无效引导或无效延伸&&通过建立两个引物不同浓度的PCR系列试验，从中发现两个引物的最适浓度；通过建立降落PCR系列试验，摸索最佳镁离子浓度的水平。应用GC-Melt（Clonte-CH）PCR反应混合液。应用尽可能低的复性温度（即退火温度）考虑添加佐剂，如在反应体系中加牛白蛋白（0.2~0.6mg/ml），二甲基亚砜（5%）或甘油（5%）目的产物条带在阳性对照管2与试验管内呈现非常模糊的带型，而在阳性对照管1内却又很强的条带。&&模板DNA不纯。&&重新纯化模板DNA，用酚：氯仿抽提两次，乙醇沉淀回收。纯化后的DNA样品溶解于水中（不含EDTA）。在阴性对照管扩增出目的条带。&&盛模板DNA的塑料器具溶解模板DNA的溶液污染所致。&&重新配置新的试剂。扩增产物呈现明显的分子质量错误的条带。&&根据一条或两条引物的非特异性引导。&&缩短复性时间或增加复性温度。扩增目的产物DNA呈现模糊的广泛的成片条带。&&要么为引物二聚体所致的扩增；要么为模板DNA过量。&&检查引物是否均一及模板DNA序列内是否具有高度重复序列存在。优化每条独立引物的浓度。应用降落PCR和（或）热启动PCR。降低模板DNA的量。对可能发生在PCR过程中的主要问题的解析表2描写在PCR扩增反应中可能遇到的一些问题以及提供怎样解决这些问题的一些方法。表2 多种PCR扩增过程的一些疑难问题的诊断与解决方法症状&&可能原因&&补救措施扩增的目的产物条带较弱或不能检测到相应的条带。&&试剂不合格；PCR仪有故障；扩增程序设置错误。&&在两台不同的PCR仪上用新鲜购买的试剂与老的试剂分别进行PCR，比较其扩增产物结果。&&复性条件不是最合适的。&&重新计算引物Tm；应用降落PCR，最好再结合热启动PCR。验证引物浓度，如果必要可优化引物的浓度；若引物显然是问题的症结所在，重新设计合成新的引物。&&被复性结合到模板上的引物不适合延伸。&&优化MgCl2、模板DNA和dNTP的浓度；试验此PCR的pH值的范围；考虑用N-三甲基甘氨酸、N,N-二羟乙基甘氨酸或EPP等具有更低温度变异系数的化学物质替代Tris（Cheng et al. 1994）。应用新鲜制备的热稳定DNA聚合酶。重新纯化模板DNA以去除抑制物。在恒定复性温度（55℃）条件下增加PCR循环数。如果问题依然存在，添加增强剂（如10%二甲基亚砜，5% PEG6000或10%甘油）。如果问题依然存在，用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增。应用GC-Melt（CLONTECH）PCR反应混合液。&&变性不完全。&&增加变性的时间或者设置更高的变性温度。&&两个引物之间的距离太大。&&应用那些能够扩增大DNA片段的热稳定DNA聚合酶。多种扩增产物条带&&&& 应用降落PCR，最好再结合热启动PCR或加强PCR（booster PCR）。优化MgCl2、模板DNA、热稳定DNA聚合酶及dNTP的浓度。用首次扩增的PCR产物进行1：100稀释后作为模板，再加入新的PCR缓冲液与引物在恒定复性温度条件下进行30个循环的第二次PCR扩增；或者进行嵌套式PCR扩增；或者从凝胶上切割目的条带作模板重新进行PCR扩增。确证引物的浓度，如果必要，可优化引物的浓度；若问题仍然存在，重新设计合成引物。引物二聚体过量&&&& 应用降落PCR，最好再结合热启动或加强PCR（booster PCR）；若问题仍然存在，重新设计合成引物，要特别注意引物3’末端的序列。
（来源： 来宝网
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常见峰图说明
1.测序成功
所有的序列文件都是根据测序峰图生成的，测序结果的好坏，请根据峰图判断。ABI3730测序仪一个测序反应只能测到1200bp左右，其中有效碱基(99%准确)在前750bp左右，之后的序列会出现宽峰。对于PCR样品，如果一个反应能测通，那么正常的测序结果就能够测到PCR终止末端的那个A碱基 (高保真酶扩增的产物没有末端那个A)。对于菌液或质粒样品,由于质粒是环状的,在正常情况下,信号均不会出现终止。&
测序的荧光信号是从测序引物之后的第一个碱基开始标记的，所以测序得到的序列看不到测序引物，测通的样品仅能看到另一端引物的反向互补序列。因为测序信号是荧光信号，所以请不要提供任何干扰荧光信号的样品（尤其是荧光定量PCR产物）或引物，如果该产物进行常规测序我们会正常收费。
序列峰图杂乱无章，信号干扰较大，无明显主峰。
原因：测序模板与引物无法配对或配对能力较低，从而测序信号较弱甚至无信号；菌液浓度较低或失活，载体拷贝数较低以至于质粒浓度较低造成测序无法生成足够的信号；PCR产物样品浓度太低或送样量太少，造成DNA总量太少，纯化之后无法产生足够模板，测序信号弱，甚至无信号；PCR片段大于2000bp时，纯化效率显著降低，造成模板浓度不足，测序信号偏弱。&
解决方法：菌和质粒请正确提供载体信息及酶切位点；非通用引物测序的请提供足量（10ul起送），保证质量的测序引物并提供引物序列；PCR纯化产物，自行检测的样品，检测量不要超过3ul，条带单一、明亮、清晰，提供量大于30ul；PCR产物若大于2000bp，建议分段扩增或克隆后测序。
备注：新鲜菌液1ml起送，质粒浓度200ng/ul（低拷贝载体质粒要求更高）; 我公司默认的M13F引物是M13F(-47)，并非M13-20。PDONR系列载体没有M13F(-47)的结合位点，仅有M13-20的结合位点。
3.PCR产物电泳检测条带单一，但测序结果表明模板不纯
PCR产物电泳检测的结果只是对产物简单的定性，相对于与目的片段相差不大的非特异性PCR扩增产物无法用肉眼区分；DNA测序反应敏感而客观，可以精确反应出模板本身的情况。高质量的PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，建议将PCR产物进行克隆后测序，以确保得到好的测序结果。以下图为例：该反应的背景信号较高，对碱基的判读存在干扰。
解决办法：更改PCR条件，重新扩增或将该PCR产物克隆到载体中，初步筛选后挑单克隆测序。
4.碱基缺失&
碱基缺失在PCR产物中比较常见，特别是从基因组中扩增得到的PCR片段，上图的箭头位置缺失两个T
解决方法：
使用反向引物继续测序，以矫正缺失位点并达到测通的目的（测序结果仍会有后面部分双峰的现象）或将该PCR产物克隆到质粒中，挑取单克隆测序。
如果可以确定该PCR片段中不会有缺失，则可以更改PCR条件，重新扩增。
5.引物不纯？
引物不纯会造成移码现象，该现象与模板不纯在峰图都表现为存在背景峰，但是引物不纯在峰图上表现的更有规律，一般在每一个主峰前或者后都有一个同一碱基的小峰。
解决办法：重新合成引物或重新PAGE纯化后进行测序。
6.重复结构
图一：F引物测序的部分结果
图二：R引物测序的部分结果
图三：F和R反应拼接在一起的部分结果
Ａ／Ｔ重复结构将导致测序复制框的滑移，重复结构之后峰型混乱；Ｇ／Ｃ重复结构可能会造成测序信号衰减或中断。
解决办法：使用反向引物测到该重复结构处（必须保证测序结果能将重复结构处完整覆盖），即可完成模板全长的拼接或采用高级试剂盒对模板测序。
7.模板不单一
1）菌液为非单克隆：
上图在290位点处测序结果出现双峰（插入后双峰），即模板中含有两个或两个以上的插入片段不同的相同载体。
解决办法：重挑单克隆或重新提取质粒。
注意，重新进行PCR反应或者酶切鉴定仅能证明该克隆含有插入片段，并不能证明模板是否单一。
(2) PCR产物不纯，如下图所示：
在525bp前测序峰表现为杂或有明显套峰，且在525bp位置有一个较高的A峰，这个A峰标志着此PCR产物中有一个片段大于525bp的片段。
注：PCR产物测序大部分是以A高峰终止，高保真酶扩增的产物没有末端那个A。
解决方法：对PCR产物切胶纯化后测序，对于片段大小相差不大的样品建议克隆后测序。
8.Poly结构
在polyA/T结构之后往往出现移码、双峰、套峰现象，而在polyG/C之后会往往导致测序信号的衰减或者直接中断。
解决办法：使用反向引物对模板进行测序，测到该poly结构处（必须保证测序结果能将poly结构处完整覆盖），即可完成模板全长的拼接。如果是较长的PloyG/C，建议使用高级试剂盒进行测序。
9.回文结构
位点94至137是一个回文结构，该结构导致后面的信号衰减，出现错误的判读。
解决方法：使用反向引物对模板进行测序，测到该回文结构处（必须保证测序结果能将回文结构处完整覆盖），即可完成模板全长的拼接。
10.测序峰图前双峰
(1)产物中含有小片段PCR产物；
(2)引物有两个结合位点，其中一个结果中断
解决方法：反向测序。
11.测序峰图为后双峰
原因及解决方法和碱基缺失，回文结构和插入后双峰一样。
峰图说明：序列峰图从第一个碱基开始到测序结束(有时是部分重叠)，测序峰不是单一峰型，我们称之重叠峰，有些公司称之套峰。
现象原因说明：出现重叠峰，说明上机的模板不止一个即PCR反应完成后生成了两个或两个以上的模板，也就是说生成了两条或两条以上的序列。
造成重叠峰原因：1.菌液或质粒的话，接菌可能污染；2. 测序引物和模板不止一个结合位点（如果目的片段上有结合位点，哪怕不是100%匹配），也有可能出现重叠峰；3.测序引物降解，客户自带引物更容易降解；4.对PCR产物而言，有可能是产物不纯或产物是单引物扩增产物。
解决方法：1污染或不纯a.对菌来说，请重新提供单克隆b.对质粒来说，请重新提供质粒或挑单克隆我公司进行提取；c.对PCR产物来说，重新采用切胶纯化后测序；2.引物a.重新选择或提供特异性引物；b.重合测序引物并PAGE纯化；3.需要长期使用的测序自带引物，请及时提供或将测序引物序列告知我公司，我们自行合成并保存。
备注：部分载体含多个多克隆位点区，如PETDUET系列载体有两个多克隆位点区，T7也就有两个集合结合位点，用T7测序肯定会有重叠峰；非单克隆的样品，测序结果仅载体部分不会是重叠峰，对于非单克隆的样品我们会正常收费。
13.缺失突变
缺失突变：PCR产物测序时常见的二级结构。菌液、质粒一般不存在，因为挑取单克隆已经去除杂合体。缺失突变样品均无法测通、拼接。
序列峰图：从某一个点之后出现重叠峰，峰图末端出现不止一个代表PCR终止的&A&峰。
原因：DNA模板不纯。PCR扩增产物出现多态性，且切胶无法分离，缺失的序列和长度我们无法准确判断。
解决方法：建议将PCR产物克隆后跳去多个单克隆测序；如从反向测只会得得长度互补的位点之后出现重叠峰。
14.飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移
在用特殊试剂盒（3.0）时，会发生碱基替代，从而出现碱基位移的现象，即飘峰。
序列GC含量太高，有可能产生回文结构，造成测序反应后弱，严重的情况造成测序反应无法有效延伸，序列中断。
解决方法：用普通试剂盒（3.1）测序校正碱基位移；两个方向均可以尝试进行测序，但是我们无法保证一定能测通。
注：3.0试剂盒只对局部高GC有效，对POlyA/T、重复结构（GT/GA等）无效，建议先用3.0试剂盒测序，然后用普通试剂盒进行校正。
15.发夹结构：常见的DNA二级结构。
峰图：从某一点后信号出现重叠峰，衰减甚至于中断。
原因：测序反应由于非正常情况，造成无法正常延伸，从而使序列后部分峰型发生变化，我们无法准确确定是哪段序列造成的何种二级结构！
解决方法：发夹结构的样品，我们会尝试采用特殊试剂盒进行双向测序，但也不能完全保证测序成功。
16.测序失败
测序失败：我们不进行收费的测序结果。
峰图：序列峰图显示为有主峰，但噪音干扰较大（非重叠峰），信号很弱或提前中断。
原因：样品浓度太低，测序反应无法正常延伸，序列信号提前减弱，并不一定是测序技术的问题，有可能是样品本身不太理想。长时间的运输、温度，都有可能使样品（质粒和PCR产物）发生降解，造成浓度降低。
解决方法：建议重新制备符合要求的样品。若客户要求重新测序，如果重新测序对该结果没有产生任何改善，我们都将针对重新测序正常收费费用。
甲基化序列
甲基化序列：近年比较常见的二级结构，特别是对于线粒体的序列。
序列峰图：一条序列GT含量较高，互补序列AC含量较高，GT高的方向信号校容易中断。
原因：GT含量高易一起DNA的二级结构，从而测序PCR无法正常延伸，信号中断。
解决方法：从序列的另一方向测序。
备注：TA克隆的方向不定，我们无法保证一个方向就能测通。线粒体DNA存在高度甲基化，PCR引物特异性较差，且并不是每个方向都适合测序。