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荧光定量PCR问题疑难解答
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PCR产物的电泳检测可能出现那些问题
PCR产物的电泳检测可能出现那些问题
来源：互联网
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一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。
假阴性，不出现扩增条带
PCR反应的关键环节有 ①模板核酸的制备。 ②引物的质量与特异性。 ③酶的质量及。 ④PCR循环条件。
寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板： ①模板中含有杂蛋白质。 ②模板中含有Taq酶抑制剂。 ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白。 ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。 ⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。
酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为： ①选定一个好的引物合成单位。 ②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。 ③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。 ④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。
反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20 ul、30 ul、50 ul。或100 ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20 ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。
假阳性 出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：
一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。 这种假阳性可用以下方法解决： ①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 ②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。 ③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。
二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带 PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有： ①必要时重新设计引物。 ②减低酶量或调换另一来源的酶。 ③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法（93℃变性，65℃左右退火与延伸）。
出现片状拖带或涂抹带 PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有： ①减少酶量，或调换另一来源的酶。 ②减少dNTP的浓度。 ③适当降低Mg2+浓度。 ④增加模板量，减少循环次数。
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大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某 段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带 与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、 或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数 过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶 则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引 物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次 数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓 度。增加模板量，减少循环次数。克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为： 产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA，用SOC稀释到1000u后含10 ngDNA，用1/10铺板，共用1 ng DNA。转化率为： 1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞。 如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生&20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801，M1804，M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-TEasy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生&20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加TaqDNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液 　 10ul4种dNTP混合物 　 各200umol/L引物 　　　　 　 各10～100pmol模板DNA 　　　 　0.1～2ugTaq DNA聚合酶 　 2.5uMg2+　　　　　　 1.5mmol/L加双或三蒸水至 　100ulPCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列， 就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点， 这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，使反应产物减少。同类型文章阅读，点击下列标题即可自动跳转Bio+平台的宗旨是导师与硕博的服务者，用户与商家的联结者，科研到产业的推动者。我们免费为导师和硕博提供微信在线实名制交流群。行业大牛与初生牛犊都可能是您的群友。硕博技术专题群包涵WB,IHC,动物技术，SCI写作，分子克隆，自然基金申请，IP与蛋白相互作用，生物软件与生物信息学，non-codeRNA研究，细胞株交换与细胞培养，ppl质粒交换，CRISPR-Cas9研究，蛋白表达纯化技术，信号通路研究，表观遗传学，转化医学-细胞治疗研究，流式细胞技术，meta分析，自噬研究等，最近又新建了组学分析交流群，SCI插图制作交流群，考研调剂交流群等更有肠道微生物交流群，科研抗体讨论群期待您的加入感兴趣的请关注本公众号后回复“硕博群”即可获知加入方法。&导师群交流群（目前仅允许导师加入）包涵分子与生化导师研讨群，细胞生物学导师研讨群，免疫学导师研讨群，神经生物导师研讨群，微生物与寄生虫导师研讨群，药学相关导师研讨群，肿瘤研究导师研讨群，干细胞与组织再生导师研讨群，病理生理导师研讨群，心血管研究导师研讨群，呼吸系统导师研讨群，消化系统导师研讨群，内分泌/代谢系统导师研讨群，泌尿生殖系统导师研讨群，昆虫科学导师研讨群，老年病学（抗衰老）导师研讨群，食品安全相关导师研讨群，导师课题/项目申请经验交流群，功能基因组学与蛋白组学导师研讨群。最近又新建了同城导师聚会群等，更多专业学科导师群等待您的加入需要加入的导师，请关注本公众号后回复“导师群”即可获知加入方法科研顾问(biogot)　
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肥市召开。“中为促进我国生物化学与分子生物学领域专家的交流与合作，中国生物化学与分子生物学会2016年全国学术会议将于20来源：君子微言、彩视
转自：癌症研究Team
编辑：学妹随着新一代留学生的成长与成熟，自2004年王福利：分享本消息，并在公众号中回复分享朋友圈的截图和关键字“实验经验”，即可获得WB IHC 免疫荧光 CH福利：分享本消息，并在公众号中回复分享截图和实验经验四字，即可获得WB IHC 免疫荧光 CHIP 流式 P福利：分享本消息，并把截图回复到公众号中，即可获得WB IHC CHIP 流式等实验问题总结爱因斯坦说过：“福利：关注公众微信号，回复“文献检索”，即可获得NoteExpress软件及教程，回复“基金”即可获得基金申福利：关注公众微信号，回复“文献检索”，即可获得NoteExpress软件及教程，回复“基金”即可获得基金申福利：关注公众微信号，回复“文献检索”，即可获得NoteExpress软件及教程，回复“基金”即可获得基金申福利：关注公众微信号，回复“文献检索”，即可获得NoteExpress软件及教程，回复“基金”即可获得基金申福利：关注公众微信号，回复“文献检索”，即可获得NoteExpress软件及教程，回复“基金”即可获得基金申福利：关注公众微信号，回复“文献检索”，即可获得NoteExpress软件及教程，回复“基金”即可获得基金申福利：关注公众微信号，回复“文献检索”，即可获得NoteExpress软件及教程，回复“基金”即可获得基金申福利：关注公众微信号，回复“文献检索”，即可获得NoteExpress软件及教程，回复“基金”即可获得基金申福利：关注公众微信号，回复“文献检索”，即可获得NoteExpress软件及教程，回复“基金”即可获得基金申日前，从事模具制作的日本街道小工厂NITTO，通过与日本千叶大学前沿医学工程中心、西村拓纪设计、日本高分子技穆罕默德·阿梅德（Muhammad Z. Ahmed）是美国佛罗里达大学（University of Flo2015精准医学/临床基因组学获得了巨大进步。今年年初似乎是一个很好的时间来思考在这个领域2016年什么可能说句心里话，我发表这篇文章的心情很复杂。这篇博文完稿于今年二月底，但被我压了下来，担心这样评论北京的空气污染biogot最专业的科研顾问，让你手机电脑都能上google搜索（goolge学术搜索），全球实验protocols，科研资源分享中心，pubmed手机版，科研必备的学术网站大全，免疫细胞微论坛，共享质粒与抗体热门文章最新文章biogot最专业的科研顾问，让你手机电脑都能上google搜索（goolge学术搜索），全球实验protocols，科研资源分享中心，pubmed手机版，科研必备的学术网站大全，免疫细胞微论坛，共享质粒与抗体请求，PCR扩增条带一直不单一是什么原因？回收产物没有峰？
请求，PCR扩增条带一直不单一是什么原因？回收产物没有峰？
请求各位高手了，我的PCR扩增条带一直不单一，是什么原因啊？其回收后产物也没有峰？但是A260/280和浓度都是可以的，下一步该怎么办？请教各位了，谢谢！
可以用回收的产物作梯度稀释再P一次.
升高退火温度。
可以提高退火温度或做个温度梯度
回收效率不好可以换一种回收试剂盒试试
可以提高退火温度或者做温度梯度看看条带是否单一
回收效率不好的话 可以换一种回收试剂盒试试
估计要重新设计引物，特异性太差，没有峰可能是回收浓度太低了，建议冷冻抽干在溶解。
出现dimer时常见的事
可能是引物特异性的问题，提高退火温度或做个梯度PCR试一试
做个梯度PCR试试，如果不单一，肯定是特导性不强。
引物特异性的问题，如果不是引物设计的问题的话，而是模版本身就很不容易p出特异条带，建议巢式pcr试试。PCR条带一直很弱，各种调体系无能(条带,无条带,引物,反应体系) - PCR实验 - 生物秀
标题: PCR条带一直很弱，各种调体系无能(条带,无条带,引物,反应体系)
摘要: [PCR条带一直很弱，各种调体系无能(条带,无条带,引物,反应体系)] 我做了好久的PCR了，好不容易出了条带，可是一直都很弱，用了很多方法也提高不了亮度，拿去测序就说回收无带，各种郁闷，还望高手给予指点一二！！扩出条带的反应体系：25微升DNA 5 buffer 2 5 镁离子 2 5 dNTP 0 5 Taq 0 5 Primer 各1 94 8min 94 30s 48 52 5梯度PCR 40s 72 1min 35 循环 延伸 72 8min 做过二次PCR 关键词:[条带 无条带 引物 反应体系 测序 镁离子 胶回收]……
我做了好久的PCR了，好不容易出了条带，可是一直都很弱，用了很多方法也提高不了亮度，拿去测序就说回收无带，各种郁闷，还望高手给予指点一二！！扩出条带的反应体系：25微升DNA 5 buffer 2.5 镁离子 2.5 dNTP 0.5 Taq 0.5 Primer 各1 94 8min 94 30s 48/52.5梯度PCR 40s 72 1min 35 循环 延伸 72 8min 做过二次PCR PCR产物稀释过1倍 5倍 10倍 20倍，结果什么都没有切胶回收之后PCR也什么都没有做了TDpcr也是什么都没有 条带什么的。。。都没有减少过引物浓度，变0.5微升，也是无条带稀释过DNA模板，仍然无条带减少循环数，也是无条带。不知道还有什么办法没有，我已经尝试了好久，都没的结果，希望帮帮忙！！有条带的地方就是弱带，maker是一微升的。我做胶回收之后都没有条带了。不知道怎么优化才能更亮。我用的引物是没问题的，之前学长也用过的，很好用的引物。其他的怎么改呢？？
回复做PCR的目的是什么？假如是为了克隆，可以用pcr产物直接连T载体试试。回复个人怀疑是引物设计不好或是模板浓度过低导致的。可以把模板序列和引物序列告诉我，我可以帮你看一下。回复模板是什么 基因组么？有一个方法可以试试 你把第一次PCR的结果大概的位置胶回收 然后直接拿回收产物 再扩一轮PCR 我以前做过 涂抹带都做出来了 你这个还有条带 应该没什么问题 因为如果直接拿第一轮的PCR产物扩第二轮 存在一个杂质干扰的问题 而且你的体系还比较小 干扰比较强 祝你好运！回复那你拿p出来的带在重新p不及可以啦啊回复你的每个孔都有很多引物二聚体，而且上面几乎都是两条带，说明特异性不好啊，那么由于竞争抑制的作用你的目的条带自然就会淡， 引物放时间久了也是会降解的，你可以合成一份新的引物试试，而且镁离子浓度也会影响产物，较高的浓度会增加产量但会引起非特异性扩增。。。不过一般的主要原因是在引物上。。。加油吧！回复个人怀疑是引物设计不好或是模板浓度过低导致的。可以把模板序列和引物序列告诉我，我可以帮你看一下。引物是之前学长用过的，设计上应该没问题，因为他用的时候很好用的，我这个是未知基因扩中间片段，和他的一样，所以应该没问题。回复那你拿p出来的带在重新p不及可以啦啊我之前做过二次PCR啦，特异性非常差，而且目的条带也不清晰。 二次PCR之后这个是做的胶回收之后ＰＣＲ，结果都是涂抹带这个做的是TDPCR就是做过梯度ＰＣＲ，做过Mg2+梯度，才出的条带，不过条带特弱，之前镁离子放的少，连条带都没有之后就一直用2.5了才有条带，Tm值也改过很多次，不管怎么改都不好使，不是弱带就是没带，DNA我也跑了电泳很亮的稀释了25倍之后有条带，DNA浓度梯度也做过，其他的根本没条带。哎。。。这弱带咋办？？回复模板是什么 基因组么？有一个方法可以试试 你把第一次PCR的结果大概的位置胶回收 然后直接拿回收产物 再扩一轮PCR 我以前做过 涂抹带都做出来了 你这个还有条带 应该没什么问题 因为如果直接拿第一轮的PCR产物扩第二轮 存在一个杂质干扰的问题 而且你的体系还比较小 干扰比较强 祝你好运！这个我之前也做过，得到的是涂抹带。。。。。。回复做PCR的目的是什么？假如是为了克隆，可以用pcr产物直接连T载体试试。我就是扩增未知基因的中间片段，我这边没有T载，切胶都挺费劲的。。。有啥别的法子没啊？回复我就是扩增未知基因的中间片段，我这边没有T载，切胶都挺费劲的。。。有啥别的法子没啊？T载体还是很便宜的，宝生物的3、400，可以用20次呢回复引物是之前学长用过的，设计上应该没问题，因为他用的时候很好用的，我这个是未知基因扩中间片段，和他的一样，所以应该没问题。那就应该是模板质量有问题，比如浓度太低，另外，看到有人建议直接用T-easy载体进行克隆，我觉得不太靠谱，还是看到条带比较好。你这样的问题我以前遇到过。其实我也看了其他人的建议和你的回复，我觉得如果你真能按照给所有人回复的那样都试过的话，不应该做不好的。有很多小问题虽然你认为肯定没问题的，但还是应该认真想想，众人的建议很多，每个都试是不太可能的，关键还是自己知道如何判断。就像你说引物没问题，你学长用过，但是如果降解了呢？当然，我并不相信真的降解了。呵呵。。。祝好！回复你学长的引物是多久之前合成的啊？我以前觉得这个引物一般不会出现降解问题，但是后来做荧光定量就看出来了，放的久的引物就有些降解，溶解曲线就会有杂峰。如果你是和你学长做得完全一样，他的很成功你的却不行，你为什么不把所有都换成新的重新做一遍呢？做PCR的都不贵的。或者你可以不换试剂让别人用你的东西完整的帮你做一遍，也许有的操作你自己意识不到是错误的，别人却能避免出现这个错误。回复你学长的引物是多久之前合成的啊？我以前觉得这个引物一般不会出现降解问题，但是后来做荧光定量就看出来了，放的久的引物就有些降解，溶解曲线就会有杂峰。如果你是和你学长做得完全一样，他的很成功你的却不行，你为什么不把所有试剂都换成新的重新做一遍呢？做PCR的试剂都不贵的。或者你可以不换试剂让别人用你的东西完整的帮你做一遍，也许有的操作你自己意识不到是错误的，别人却能避免出现这个错误。引物是我新合成的，pcr试剂也都是新买的，我只是引物序列和学长的一样！！回复也许学长留了一手，回复建议，1，把你的引物给你学长试试（如果他还在实验室），排除引物因素，可能存在合成问题。2，换个热启动酶，特异性会好些。3，体系里dNTP同样重要，买只新的或者跟别人借一只试试。4，买个优化好的mix试试，还是排除引物因素。5，模板是什么的？模板不纯，杂蛋白多也会出现smear，换模板试试。回复1.可能是用来读胶的那个软件有问题，之前我的也是看不见，换一个软件就看见了。2.引物降解3.实验过程要注意干净无污染，人的呼吸和唾液含有很多酶，也要经常更换手套回复你的体系跟我的很不一样啊，dNTPs是各200微mol每升吗？不是请加量；你为什么要94°先来个8min呢？，这样对没活力损失很大的，一般4min足以完全变性解链了；你的退火温度还要往上提一提，做梯度pcr温度总跨度最好有个10°，温度高点可以减少非特异条带；避免涂抹带和非特异的方法是降低镁离子浓度，注意看下你的buffer有没有标示Mg plus，否则就不用加镁离子了，降低你的模板量（最好把你说的很好的模板的电泳图给我看下），如果你是从组织中提取RNA反转录之后PCR，扩成这样有可能是如下情况：引物设计跨了内含子，提取RNA后没有去除基因组，反转录后扩增其实是两套模板，一套是剪接过的mRNA反转录成的较短DNA，另一段是较长基因组DNA。我觉得除了上述问题之外，你关键是没有交代清楚你的模板。
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