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色谱分析法实验
第5章5.1 5.1.1 气相色谱分析法 概述色谱分析法色谱是一种现代分离分析技术。气相色谱(Gas Chromatography)是以气体作 为流动相， 当它携带欲分离的混合物流经固定相时，由于混合物中各组分的性质 不同， 与固定相作用的程度也有所不同， 因而组分在两相间具有不同的分配系数， 经过多次的分配之后， 各组分在固定相中的滞留时间长短不同, 从而使各组分依 次先后流出色谱柱而得到分离。气相色谱仪是一个载气连续运行、气密的气体流路系统。气路系统的气密性、载气流速 的稳定性及测量的准确性，都影响色谱仪的稳定性和分析结果。气相色谱仪由气化室、进样器、色谱柱、检测器、记录仪、收集器组成，图 5-1 是气相色谱仪的流程图。 通常使用的检测仪器有热导检测器和氢火焰离子化检测器。 热导检测器是将两根 材料相同、长度一样且电阻值相等的热敏电阻丝作为一惠斯通（Wheatstone）电 桥的两臂， 利用含有样品气的载气与纯载气热导率的不同，引起热敏丝的电阻值 发生变化，使电桥电路不平衡，产生信号。将此信号放大并记录下来就得到一条 检测器电流对时间的变化曲线， 通过数据处理系统或色谱工作站便得到了一张色 谱图。图 5-1气相色谱仪示意图色谱谱中每个峰均代表样品中的组分。对应每个峰的时间是各组分的保留 时间。所谓保留时间，就是一个化合物从注入时刻起到流出色谱柱所需的时间。 当分离条件给定时，就像薄层色谱中的 Rf 样，每一种化合物都具有恒定的保留时间。利用这一性质，可对化合物进行定性鉴定。在做定性鉴定时，最好用已知 样品做参照对比， 因为在一定条件下，有时不同的物质也可能具有相同的保留时 间。色谱图上色谱峰的高度或峰面积可用于定量分析。 5.1.2 气相色谱仪的使用方法与维护5.1.2.1 通用注意事项： (1)钢瓶及气源 ① 钢瓶及减压阀要经常检漏。 ② 在使用空气压缩机时要定期放水，更换干燥剂。 ③ 钢瓶总压&2.0 Mpa 时，更换新钢瓶。 (2) 电源 需配制稳压电源，同时有良好的接地设施。 (3) 进样口 ① 定期更换进样垫。 ② 进样口内的玻璃衬管要定期清洗， 进样口需注意分流及不分流两种衬管， 衬管内最好加石英棉。 ③不用的进样口和检测器要用死堵堵好。 (4)色谱柱的安装 毛细柱两端切口要平齐，长时间不用或新的毛细柱两头要切掉 2 cm 左右， 再分别接进样口、检测器。两边长度参照带有标识的石墨调节器即可。 (5) 色谱柱的老化 接进样口，不接检测器，最好用程序升温老化色谱柱，老化的最高温度要高 于平时使用温度 20℃以上而低于柱子的最高使用温度。老化时间不低于 1.5 h。 载气流速应与测定样品时保持一致。 (6) 每次开机前，进行以下检查： ①压力表指示的供气压力是否正确。 ② 气体过滤器是否失效。 ③电源电压是否符合说明书要求。 ④仪器高温部位是否放置有易燃易爆物品。 ⑤各连接线路接头是否脱落或松动。⑥各控温设定值是否正确。 (7) 分析工作中的注意事项 ① 建立工作报告，对样品来源、分析工具、操作者、仪器运行状况、分析 时间作完整记录，以备拷贝； ② 定期活化色谱柱； ③ 定期检漏； ④ 杜绝分析来源不明样品； ⑤ 杜绝明火，严禁抽烟。 5.1.2.2 GC-2010 气相色谱仪的使用方法与维护 (1)开机步骤，如采用 FID 检测器 ①打开气源，载气（N2/He） ：0.7 Mpa，H2：0.2～0.3 Mpa，Air：0.3～0.4 Mpa。 ②打开 GC 和计算机的电源。 ③在计算机桌面上打开 Real Time Analysis 快捷键，进入时实分析窗口。 ④打开 System Configuration 进行自动进样器、进样口、色谱柱、检测器 的配制，在此窗口需设置载气、尾吹气种类；柱参数（柱长、内径、膜厚、最高 使用温度）输入及色谱柱的选择；样品瓶（４mL、1.5 mL） 、进样针（10 μL、 50 μL、250 μL）大小的选择，设定完毕，回到 System Configuration 窗口，点击 SET 键确认。 ⑤仪器参数的设定：先设柱温（可做程序升温） ，再设进样口温度、柱流量 及分流比， 检测器温度、 Ｈ2 、 Air 流量。 （通常Ｈ2： 47 mL/min、 Air： 400 mL/min） 。 ⑥ 用鼠标点 File 菜单找到 Save Method File As 输入你想保存的方法文件 名（如果硬件配置相同的话，可以直接调用此方法） 。 ⑦如沿用上次关机前的配制，直接在③步的窗口下用鼠标点 File 菜单找到 Open Method File，打开需要的方法文件名。 ⑧点击 Download Parameters ，再点击 System On。 ⑨ 等 FID 检测器温度升到 160℃以上时，点火，点击 Flame On。 ⑩等仪器稳定后，进行 Slope Test，出现对话框点 OK 即可。 ?没配备自动进样器的直接点 Single Run Sample Login 出现样品注对话框，样品名、数据文件名、样品重量等输完后，点确定键。再点一下 Start 键， 等数据采集窗口上面出现 Ready(Standby)之后，即可进样，在按 GC Start 键进行 数据采集。 ?配备自动进样器的直接点 Batch Processing 进行批处理编写，批处理必须 要输入样品瓶号、样品名称、样品类型、方法文件、数据文件，保存批处理文件。 点 Start 键即可自动运行。 (2)关机步骤 ①点一下 System Off， 等柱温 50℃， 检测器温度小于 100℃ 以后， 退出 Real Time Analysis 窗口，关闭计算机。 ②关闭气源，载气（N2/He） 、H2、Air。 ③关闭 GC 电源开关。 (3)注意事项 ① H2 比较危险，一定要经常检漏，不用时要立即关上。 ②柱子要老化后再接上检测器，以免流失造成喷嘴堵。 ③不使用的检测器、进样口最好在 OFF 状态。 如果使用 TCD 检测器，则按如下步骤进行： (1)开机步骤 ①打开气源，载气 如 He：0.7 Mpa、或 H2：0.2～0.3 Mpa。 ②打开 GC，计算机的电源。 ③，④同前。 ⑤仪器参数的设定：先设柱温（可做程序升温） ，再设进样口温度、柱流量 及分流比，检测器温度、桥流、尾吹气流量。 以下各步骤与 FID 操作一致。 5.1.2.3 GC-4001 仪器的使用方法(1)仪器调试 ①用 500V 兆欧表， 分别对恒温箱、 检测室、 气化室检查对地绝缘情况， 4000 Ω 以上为符合要求。 ②检漏：在系统内通人载气，将压力调至使用压力的 2～3 倍，然后直接将 皂液涂在各接头处，观察有无气泡出现。若有气泡，则证明该处漏气，查出漏气的地方后，排除漏气，必要时更换密封件。 ③测定流量：用皂膜流量计测定载气流量，利用限流阀调节两气路流量为 30～45 mL/min。 ④打开电源开关和热导池开关， 使用仪器面板上的操作键设定气化室， 柱箱， 检测室，桥温以及程序升温参数。 ⑤打开色谱工作站，进入 A4800 工作站，在方法设定页面做如下设定：工 作方式，分析；定量方法：归一化法；采样方式：色谱；处理方式：过程；打印 报告：打印；实时绘图：也可根据自己分析测试要求对每一项作具体设定。 (2) 分析测试 待系统稳定，基线平直后，即可对样品进行分析测试，注入样品，按 F1 键 （A 通道）开始绘制谱图，分析完毕，按 F3 键结束。 (3) 关机 分析结束后，先关断桥流开关，再关断电源，等温度降至 100℃以下后，关 断载气。实验五十色谱参数的测试及计算一、实验目的 （1） 通过本实验基本色谱参数的测试与计算， 定量地了解溶质组分在色谱柱过程中热 力学和动力学作用的量度。 （2）理解各色谱参数的意义及其相互关系。 （3）通过本实验进一步掌握柱效、柱选择性、分离能力、保留值等性质，使之能选择 出最佳色谱操作条件，得到可靠的定性，定量结果。 二、测定意义 通过试验，了解色谱中的各个基本参数， 从色谱图中学会参数的获得及各基本参数计 算。在给定的色谱条件下，测定惰性组分的死时间（tM）及被测组分的保留时间（tR） 、调 整保留时间，半高峰宽（W1/2） 、及峰高（H）等参数，并据此求出色谱柱分离效能， 组分 分离度等参数， 对色谱分离做出评价。 三、方法原理 通过实验， 得到色谱流出曲线， 从色谱流出曲线中可得到以下参数： 1 调整保留时间：用公式计算出, tR ? t R ? tM2 相对保留值： 计算出(正庚烷, 正已烷)； ( 乙酸正丁酯, 正已烷)； ( 正辛烷, 正已烷)的相对保留值，? is ?以正已烷作标准。 3 容量因子：t , R (i ) tR ( S )?Vg (i ) Vg ( s )?, VN (i ) , VN (s), tR ? tM tR K ? ? tM tM ,计算出正已烷；正庚烷；乙酸正丁酯；正辛烷的 K’，以其中 K’=2-5 的组分进行计算。 4 理论塔板数：以其中 K’=2-5 的组分进行计算。n ? 5.54(tR 2 t ) ? 16( R ) 2 W1/ 2 W5 有效塔板数：以其中 K’=2-5 的组分进行计算。当 K’足够大时理论塔板数与有效塔 板数是否近似相等。neff, , tR tR 2 ? 5.54( ) ? 16( ) 2 W1/ 2 W6 分离度：计算出较难分离二组分的分离度。R?2(t R 2 ? t R1 ) t R 2 ? t R1 ? W1 / 2 ? W1 / 2 WR?n ? ? ?1? k ? ? 4 ? ? ? k ?17 分离数：计算出任意二相邻正构烷烃峰之间的 TZ 值（即二峰间可容纳的峰数） 。TZ ?t R ( Z ?1) ? t( Z ) W1/ 2( Z )W1/ 2( Z ?1)?18 保留指数：计算出任意二相邻正构烷烃峰之间的 I 值, , lg t R ( X ) ? lg t R ( z ) , , lg t R ( Z ? n ) ? lg t R ( Z )? ? ? 100 [Z ?]四、仪器与试剂 气相色谱仪，GDX-102 填充柱 2 m× 3 mm； 1 μL， 100μL 微量注射器各一支，热导池 检测器。 载气：Ｈ２ 样品： 正己烷，正庚烷，正辛烷，乙酸正丁酯混合样，苯，乙酸正丁酯纯样，空气。 五、实验内容 （1）联接好仪器系统，检查并排除故障至正常工作状态。 （2）色谱条件： 进样温度２００° C，柱温１３０° C，热导池温度 1５0° C；载气 H２ -1 流速 40 mL?min ；进样量：空气 50 μL，乙酸正丁酯+正己烷+正庚烷+正辛烷混合样０.６ μL；苯，乙酸正丁酯纯样各进样 0.２μL。信号衰减视灵敏度而定。 （３）测试 待仪器开启运行至基线平稳后，取空气５０?L 注入 GC 仪器系统(如信号 过大则可以适当减少进样量)，计时，准确记录保留时间(tM)。重复进样 5~10 次，至 tM 值绝 大多数重复为止。取其平均值，为本实验的 tM 值[tM (空气)]。再取 4 种混合组分的样品溶液 ０.６ ?L 注入仪器系统，得到较理想谱图后，再重复进样 3~ 5 次，取其平均保留时间为各 组分的保留时间[tR (乙酸正丁脂)，tR (正已烷)、tR (正庚烷)、tR (正辛烷)]。 再分别进乙酸 正丁酯和苯样品各０.２μL，得到色谱图。 六、数据处理 （1） 记录空气的 tR 值和四组分混合样的各保留值(平均值)。 令 tn-1=tR(正己烷)； tn=tR(正 庚烷)；tn+1=tR (正辛烷)；ti=tR (乙酸正丁酯)。 （2）测量并记录各组分的半高峰宽 Wh/2。 （3）各基本参数计算： ①调整保留时间 以 t'R = tR －tM 关系计算出 t'n-1、 t'n 、t'n+1 及 t'i。 ②相对保留值(ri,s) 按 ri,s =t'R(i)/ tM 的关系，计算出 r 正庚垸，正已垸，r 乙酸正丁 酯，正已烷，r 正辛烷，正已垸(以正已烷作标准物时)。 ③容量因子 根据 K'＝t'R/tM 的关系，计算出 K' (正己烷) K' (正庚烷)，K' (乙酸正丁脂)，K' (正辛烷)值。 2 2 ④理论塔板数 以苯组分测定柱效能，根据 n=5．54(tR/Wh/2) 或 n=16(tR/W) 关系计算 出柱效率(每米柱长所具有的理论塔板数)。 2 2 ⑤有效塔板数 neff =5．54(t'R／Wh/2) 或 neff =16(t'R／W) 计算出有效塔板数。 ⑥分离度 根据 R=2(tR2－tR1)/(W1+W2)，计算出 4 种组分中较难分离的二组分间的分离 度。 ⑦分离数 可根据 TZ=(tR(n+1)－tR(n))/( Wh/2(n) ＋Wh/2(n+1))，计算出任意二相邻正构烷烃峰 之间的 TZ 值(即二峰间可容纳的峰数)。 ⑧保留指数 按 I=100[(lgt'R(?)－lgt'R(n))/ (lgt'R(n+1)－lgt'R(n))+n]计算出任意二相邻正 构烷烃间某组分的保留指数 I 值。如载气流速不非常稳定时,可用 V'R(i), V'R(n), V'R(n+1),代替上 述的 t'R(?)、 t'R(n)) 和 t'R(n+1)，这样可以使 I 值测量更准确些。 七、问题讨论 （1）色谱定性尚有一些色谱参数可以用，如 tR ,t'R , V'R, r'i,s 等，为什么说用 I 值最可 靠? 因为采用保留值定性要求两次进样条件完全一致，这是比较困难的，r'i,s 要求温度一 定，且需要标准物质。保留指数定性的重现性最佳，当固定液和柱温一定时，定性可不需要 标准物质。一般讲只要色谱柱（固定液）和柱温相同，就可以利用文献或手册发表的保留指 数来定性。 （2）关于 tM 值的测量：从 tM 定义看，tM 值的测量规定为惰性组分从进样开始至柱后流 出浓度极大点所对应的时间， 即该惰性组分不能与固定相发生任何作用(溶解或吸附)便流出色谱柱。实际上不存在这种理想的惰性组分，因此直接测量而得到的 tM 值，相对说不那么 准确，特别是数值小的 tM，会引入一定的误差(而数值大的误差往往可以略而不计)。因 tM 值是诸色谱参数的基淮数据， 故有许多人研究它的准确计算方法。 如利用三个同系物的保留 值来推算死时间，其三个同系物的碳数必须符合如下条件， Cn－C(n－i)=C(n+i)－Cn (1) 又根据同系物的碳原子数与调整保留时间的对数呈线性关系而推导出来的方程式，即 Cn=mlgt'n +q= mlg(tn－tM )+q (2) 式中， Cn――同系物中的碳原子数； tn――Cn 同系物的保留时间； t'n――Cn 同系物的调整保留时间； m、q――方程式中常数。 三个同系物(正己烷，正庚烷，正辛烷)的 t'R 值可分别设定为[t(n-i)－tM]，[tn－tM]，[t(n＋i) －tM]，把它们代入(2)式；则得： C(n－i)= mlg (t(n-i)－tM )+q (3) Cn=mlg(tn－tM )+q (4) C(n+i)= mlg (t(n+i)－tM )+q (5) 将(4)式减去(3)式，(5)式减去(2)式得: Cn － C(n － i)= mlg [(tn － tM )/(t(n-i) － tM )] (6) C(n+i)－Cn = mlg [(t(n＋i)－tM )/(tn－tM )] (7) 又因为存在(1)式的关系，所以得： (tn－tM )/(t(n-i)－tM ) =(t(n＋i)－tM )/(tn－tM) (8) 整理(8)式，得到最终结果： tM＝（t(n＋i)+t(n-i)-2tn）/ (t(n＋i)+t(n-i)－2tn) (9) 式中 i=1，2，3...； tn-i ――第一个同系物的保留时间(正己烷)； tn ―― 第二个同系物的保留时间(正庚烷)； tn+i――第三个同系物的保留时间(正辛烷)。 X. Guardino 等人的验证认为（3）式准确可靠，并提出 i 值愈大则计算出来的 tM 值愈 准确。请同学们根据本实验测得的 tn-i 、tn 、tn+i 值，试计算出 tM 与空气组分实测值的比较 值，分析其误差。 八、注意事项 （1）色谱基本参数的测定，要严格控制操作条件的稳定性, 否则易产生误差。 （2）为了保护色谱柱，要求载气首先打开，然后开机，结束时先关机，后关载气；严格 按照要求的顺序开启和关闭色谱仪。 九、思考题 （1）色谱基本参数测量与计算的关键问题是什么? （2）K'值及 Wh/2 值的大小与色谱柱过程的哪些因素有关?其原因何在?控制哪些操作条件 可以得到适宜 K'值和 Wh/2 值?实验五十一气相色谱测定混合烃含量（归一化法）一、实验目的 （1）掌握气相色分析的基本操作及混合烃的分析方法。 （2）学习定量校正因子及归一化法定量分析的基本原理和测定方法。 二、测定意义 石油是一种主要由碳氢化合物组成的复杂混合物， 对石油及其产品的组成和质量指标的 测试，有利于有效地利用石油资源、选择合理加工条件和提高石油产品质量。正确测定石油 中混合烃的含量在石油化工等领域具有重要意义。 三、测定原理把所有出峰组分的含量之和按 100%计的定量方法称为归一化法。使用归一 化法定量， 要求试样中的所有组分都能得到完全分离， 并且在色谱图上都能出峰， 计算式为：为了消除色谱条件对响应值勤的影响， 在色谱定量分析中通常采用相对校正 因子 f’i 即被测物质 i 与标准物质 s 的绝对质量校正因子之比值：本实验通过测量混合烃试样中各组分的峰面积，利用相对校正因子，用归一 化法计算出各组分百分含量。四、仪器与试剂 GC-4001 型气相色谱仪； A4800 色谱数据工作站； 色谱柱 2m× 3 mm 不锈钢柱 （双 柱体系、SE-30 作固定液） ；氢气钢瓶，微量进样器（10 μL 或 1 μL） 。 分析纯苯、甲苯、正己烷； 五、实验内容（1）实验条件钢瓶输出压强 8 kg?cm-2；机前总压 300 MPa；柱前压力100 Mpa；柱温 100℃；进样口温度 150℃；检测器（TCD）温度 150℃；桥电流 50 mA；进样量 1 μL。 （2）仪器调试 用 500 V 兆欧表，分别对柱箱，检测器，汽化室，检查对地绝缘情况，4 kΩ 以上为符合要求。（3）检漏 半量程检漏：当气路压力为 2 kg?cm-2 以下时，堵住色谱柱前气路口，关闭减压阀的总阀门，半小时漏气压降不应超过 0.05 kg?cm ,半量程检漏是检查前气路。全 量程检漏：检查全气路系统是否漏气，用闷头螺母堵住出气口，用肥皂粉液做起泡剂，看接 头处有无气泡产生。 检漏完毕， 将起泡剂擦净， 取下出气口的闷头螺母， 仪器投入正常使用。 打开氢气钢瓶阀门和减压阀，调节载气 1 和载气 2 的流量，用皂膜流量计测定到流量为 15 -1 mL?min 。-2（4）打开电源开关，开启热导池，桥温调到 110℃。 （5）按面板上总清，编程灯亮，按编程，再按输入，柱箱灯亮，按清除键，指示 0，输入柱箱温度为 30℃，按输入， 热导灯亮， 按清除， 再输入热导他工作温度 100℃，按输入， 汽化灯亮， 按清除， 输入汽化室温度 30℃， 按输入,再输入， 保护灯亮， 输入保护温度 150℃，按输人，再按运行键，就绪灯亮，连续按运行两次，仪器进入正常工作状态。（6）打开 A4800 色谱数据工作站，按 F1 键，观察基线漂移情况约 0.5～1 h，基线平稳，就可进样分析。（7）以苯为标准物质测定甲苯、正己烷、环己烷的相对校正因子。分别注入体积比为 1：1：1 的苯、甲苯和正己烷 1 μL，测算相应的峰面积，计算各物质的相对校正因子。 重复操作 3 次。（8）注入 1 μL 混合待测样品，测定相应的峰面积，用归一化法计算各物质的质量百分含量。（9）实验结束，退出色谱工作站，关闭热导池和色谱仪电源，待仪器完全冷却，关闭氢气。 六、数据处理根据实验数据，求算表 1 中相关值。 表 1 实验数据列表 组 分 苯 甲苯 峰面积 Ai 单测值 平均值 相对校正 因子 fi′ 1 样品峰面积 Ai′ 单测值 平均值 百分含量正己烷七、问题讨论 本次测定采用的是热导池检测器， 它是气相色谱仪中应用较为广泛的检测器， 尤其是在 气体分析中应用最多。要注意影响热导池灵敏度因素：①桥路工作电流：电流增大，使钨丝 温度提高，钨丝和热导池体的温差加大，气体容易将热量传出去，灵敏度就提高。②热导池 体温度：当桥路电流一定时，钨丝温度一定。如果池体温度低，池体和钨丝的温差就大，能 使灵敏度提高。一般池体温度不应低于柱温。但池体温度不能太低，否则被测组分将在检测 器内冷凝。③载气：载气与试样的热导系数相差愈大，则灵敏度愈高。由于一般物质的热导 系数都比较小，故选择热导系数大的气体，如氢气。④热敏元件阻值：选择阻值高，电阻温 度系数较大的热敏元件（钨丝） ，当温度有一些变化时，就能引起电阻的明显变化，灵敏度 就高。 八、注意事项（1）不同的载气在不同的操作温度下都有最高桥电流限制，使用时不得超过。在关机前，应将桥电流设置为D零‖。 （2）进样器应先用待测液洗 5~6 次才可取样进样，进样时间不超过 1 s。进 样器用完后要用无水丙酮洗净后收藏。使用 1 μL 以下的微量进样器时，不得把 内芯拔出外筒。九、思考题（1）为什么机前压力应比柱前压力高？ （2）为什么启动仪器时，用先通载气，后通电源？而实验完毕后，要先关电源，稍后才关载气？实验五十二气相色谱法测定乙醇中少量杂质的含量(外标法)一、实验目的 （1）学习峰高加高法进行定性分析。 （2）了解氢火焰离子化检测器的检测原理。 （3）学习外标法定量的基本原理和测定试样中杂质含量的方法。 二、测定意义最好的工业乙醇也只有 99.9%的含量，而工业乙醇中含有少量甲醇，或工业甲醇中含 有少量工业乙醇是很正常的事。因为甲醇沸点是 64.7℃，乙醇是 78℃，相差 13℃是不可能 100%完全分离的。食用乙醇需要严格限制甲醇量， 所以非常有必要测定乙醇中杂质的含 量。三、方法原理外标法定量是用组分 i 的纯物质配制成已知浓度的标准样，在相同的操作条件下，分析 标准样和未知样， 根据组分量与相应峰面积或峰高呈线性关系， 则在标准样与未知样进样量 相等时，由下式计算组分的含量：式中：Ci――样品中组分 的含量； Cis――标准样中组分 的含量； Ais――标样中组分 的峰面积； Ai――样品中组分 的峰面积。四、仪器与试剂GC4001 气相色谱仪； A4800 色谱数据工作站；真空泵；漏斗；不锈钢色谱柱 2 m x 3 mm；氢气、空气、氮气高压钢瓶；微量注射器，1 μL ，100 μL ；分析纯甲醇， 乙醇试剂。五、实验内容（1）实验条件 色谱柱：GDX-102 填充柱 2 m× 3 mm； 1 μL， 100μL 微量注射器各一支，载气：氮气， 检测器：氢火焰离子化检测器。柱温，110℃；气化室温度 150℃；检测室温度 200℃。 （2） 配制含乙醇 40%， 甲醇含量分别为 0， 0.5%， 1%， 2%， 4%和 6%的水溶液， 作 为标准系列。 （3）未知样品 1，及在未知样 1 中加入 1%甲醇， 作为未知样 2. （4）仪器开机， 打开色谱仪电源， 开载气，设置操作条件， 待温度达到氢火焰离子 化检测器温度后， 开氢气和空气， 点火， 等待仪器极限平稳后开始进样分析。（5）标准曲线的绘制：在给定色谱条件下，用微量进样器向色谱柱中进 1 号、2 号、3 号、4 号、5 号,6 号标准溶液各 0.4μL，得到各标准溶液的色谱图，记录下色谱图中色谱峰 保留时间及峰面积。重复进样分析 3 次，进行数据处理，绘制出标准曲线。 （6）实验完毕，用乙醚清洗 1 μL 注射器，退出色谱工作站，关闭 H2 和空气钢瓶，关闭 氢火焰离子化检测器及色谱仪开关，待柱箱温度降至室温后关闭载气。六、数据处理（1）记录色谱条件，包括柱前压，进样器温度、柱温、检测器温度、进样量等 （1）比较未知样 1 和未知样 2 的色谱图， 根据峰高加高法判断甲醇色谱峰。 （2）绘制甲醇的标准曲线， 并求出线性回归方程及相关系数。 （3）利用 A4800 色谱数据工作站采用外标法求未知样品 1 和 2 中甲醇的含量， 两未知 样品甲醇含量差应为 1%。七、问题讨论（1） 本实验采用外标法定量测定乙醇中的少量杂质， 外标法的优点是操作简单和计算 方便， 缺点是色谱操作条件对分析结果影响很大， 不像归一化法和内标法定量操作中可 以互相抵消， 在实验操作中， 要求准确进样，进样量不准确是导致本实验结果线性不好 的主要原因， 应严格控制操作条件稳定， 并重复进样， 以获得满意结果。 （2）本实验中， 测量的少量杂质为甲醇， 在实际样品中， 工业酒精， 造假白酒中 都有少量甲醇的才存在， 本实验方法也可以测定乙醇中其它杂质， 如果要测量乙醇中水的 含量， 注意需要选用热导池检测器。 八、注意事项 (1) 开机时必须先通载气，再开色谱仪（升温） ；关机时，先关色谱仪（降温） ，后关载 气！ (2) 进样技术 （i） 进样时要求注射器垂直于进样口，左手扶着针头以防弯曲，右手拿 注射器， 食指卡在注射器芯和管的交界处， 这样就可以避免当进针到气路中由于载气压力较 高把芯顶出，影响进样； （ii） 注射器取样时，应先用被测试液洗涤 5C6 次，然后缓慢抽取 一定量试液。若仍有空气带入注射器内，可将针头朝上，轻轻敲注射器管，待空气排尽后， 再排除多余试液即可，用滤纸擦净针头； （iii） 进样时要求操作稳当、连贯、迅速，进针 位置、进针速度、针尖停留和推出速度都会影响进样重现性，一般要求进样相对误差为 2C5%； （iV） 要注意经常更换进样器上的硅橡胶密封垫片， 该垫片经 10C20 次穿刺进样后， 气密性降低，容易漏气。 九、思考题 （1）外标法测含量有何特点？ （2）你认为做好本实验， 需要注意的关键点在哪里？实验五十三气相色谱法分析测定水中苯系物（内标法）一、实验目的 （1）了解改变柱温对样品分离效果的影响。 （1）掌握分离度的测定方法和内标法定量原理。 二、测定意义 水中的苯系物通常包括苯、甲苯、乙苯、间二甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、异丙苯、苯 乙烯等几种化合物 除苯是已知的致癌物外，其它几种化合物对人体和水生生物均有不同 程度的毒性。苯系物的工业污染源主要源于石油化工、炼焦化工生产的排放废水。因此，测 定水中苯系物含量对环境保护具有重要的意义。 一般样品中除了含有苯系物外， 还含有许多 其他成分如脂肪烃等，气相色谱分离能力能满足要求，且有较高的灵敏度。 三、方法原理 由于检测器对各个组分的灵敏度不同， 计算试样某组分含量时应将色谱图上的峰值加以 校正。 校正因子s 为参比物质，i 为待测组分 用一定量的纯物质作内标物， 加入到准确称量的试样中， 根据被测试样和内标物的质量 比及相应的色谱峰面积之比，计算被测组分的含量.式中：ms 和 mi 分别为内标物和被测组份的质量；As 和 Ai 分别为内标物和被测组份的 峰面积；fis 为组份 i 相对于内标物 s 的相对校正因子 。 本实验采用内标标淮曲线法求得苯系物的含量(甲苯为内标物)。 四、仪器与试剂 气相色谱仪，氢火焰离子化检测器（FID） ，微量注射器（1 L）氮气（钢瓶） 、氢气（钢 瓶） 、空气（钢瓶） ，毛细管柱：SE-54（15 m×0.33 m） 。 苯，甲苯，间二甲苯，苯乙烯，均为色谱纯或优级纯。 五、实验内容 色谱作条： 色谱柱 SE-54 毛细管柱； 氢气压力 0.5kg? cm-2， 氮气压力 0.5 kg? cm-2， 空气压力 0.5 kg?cm-2；进样量 0.2 μL；柱温 100℃；检测器温度 120℃；气化室温度 120℃。 （1）保留值的测定 通载气，启动仪器，设定以上温度条件。待温度升至所需值时，打开氢气和空气，点燃 FID(点火时，氢气的流量可大些)，缓缓调节氮气、氢气及空气的流量，至信噪比较佳时为 止。待基线平稳后，分别注入苯、甲苯、乙苯、苯乙烯，得到色谱图并记下各物质的 tR 值。 再注入苯系物混合液，根据各组分峰的保留时间进行定性鉴别。 （2）分离度（R）和校正因子（f）的测定 在色谱图上画出基线，量出各组分色谱峰的峰宽（W） ，按 R 的定义式计算相邻两个组分的分离度。 准确称取甲苯、乙苯、苯乙烯，苯配成溶液，溶液中参比物质（甲苯）和待测组分（乙 苯）的质量比（ms/mi）即为已知。在一定的色谱条件下，取此溶液进样，得色谱图，根据 两物质的峰面积，求出乙苯的校正因子（f） 。同样，亦可测定苯乙烯的校正因子。 （3）内标法定量测定 按照表 1 配制标准溶液，甲苯作为内标。将各标准溶液注入气相色谱仪，记录色谱图。 将对照品与内标物峰面积的比值作线性回归，得线性方程。取待测样品进样，可求得待测样 品中各组分的体积。 表 1 标准溶液的配制 组别 1 2 3 4 5 待测样品 苯（mL) 2 2 2 2 2 2 甲苯（mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 乙苯（mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.25 苯乙烯（mL) 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.25（4）改变柱温对样品分离效果的影响 取苯、甲苯、乙苯、苯乙烯组成的混合物溶液进样，记录色谱图。改变柱温，进样，观 察色谱图中各色谱峰的保留时间及分离度有何变化。 六、数据处理 （1）计算甲苯和乙苯的分离度以及苯乙烯和甲苯的分离度，并将二者进行比较。 （2）通过苯和甲苯的色谱分析，计算甲苯的校正因子。 （3）计算样品中各组分的含量。 七、问题讨论 增加 FID 的温度会同时增大响应和噪声， 相对其他检测器而言， FID 的温度不是主要的 影响因素。一般将检测器的温度设定比柱温稍高一些，以保证样品在 FID 内不冷凝。但 FID 温度不可低于 100℃， 以免水蒸气在离子室冷凝， 导致离子室内电绝缘下降， 引起噪声骤增。 所以 FID 停机时必须在 100℃以上灭火（通常是先停 H2，后停 FID 检测器的加热电流） ，这 是 FID 检测器使用时必须严格遵守的操作。 八、注意事项 （1）配制苯系物贮备液时，要在通风橱中进行。 （2）进样时所用的注射器应预热到稍高于水样的温度。 九、思考题 （1）使用气相色谱分析样本时，怎样选择合适的检测器？ （2）分析水中苯同系物出峰顺序。5.2 5.2.1离子色谱分析法 概述离子色谱(Ion Chromatography, IC)是色谱法的一个分支，它是将色谱法 的高效分离技术和离子的自动检测技术相结合的一种分析技术。 离子在离子交换柱上或涂渍离子交换剂的纸上进行离子交换反应，由于离子特性的差异，产生不 同的迁移而得以分离，再配以适当的检测器进行检测。离子色谱具有以下优点： 同时测定多组分的离子化合物，分析灵敏度高，重现性好，选择性好，分析速度 快。 根据分离机制的不同可分为双柱抑制型离子色谱法，单柱非抑制型离子色谱 法，流动相离子色谱法，离子排斥色谱法。 离子色谱定性定量分析和一般色谱法相似，具有多组分同时测定的能力，但 是需要标准物质对照。离子色谱已广泛应用于化学、能源、环境、等领域的各种 分析，尤以阴离子分析具有独到之处。 5.2.2 离子色谱仪 离子色谱仪的结构5.2.2.1IC 仪由流动相传送部分、分离柱、检测器和数据处理系统四大部分组成， IC 仪的流程图如图 5-2。图 5-2离子色谱仪的流程图A―流动相传送；B―分离柱；C―监测器；D―数据处理1―淋洗液槽；2―泵；3―进样阀；4―分离柱；5―抑制器； 6―电导池；7―记录仪；8―积分仪；9―色谱工作部5.2.2.2离子色谱仪的部件 IC 仪中输液泵的作用与 HPLC （见 5.3 高效液相色（1）流动相传送部分谱分析法） 中的泵完全相同， 仅是材质、 流速范围和对压力的要求不同。 HPLC 的 流速准确度到 0.001 mL?min-1，而 IC 仅为 0.01 mL?min-1 。HPLC 中的泵常在 压力高于 15 MPa 状态工作，而 IC 中的泵常在压力低于 15 MPa 状态下工作。 IC 中所用的流动相一般是酸、碱、盐或络合剂，因此流动相经过的部件最 好用可防止酸碱腐蚀的材料制作，避免流动相与金属接触而发生腐蚀。 （2）分离柱 IC 仪的分离系统是填充柱，其柱理论与 HPLC 的液-固色谱相当，但填料和分离机理不同，IC 的柱填料是 IC 研究的热点，是 IC 发展的主要 推动力，发展很快。 用得最广泛的阳离子交换柱填料是磺酸或羧酸官能基的聚苯乙烯二乙烯基 苯共聚物。 阴离子交换柱填料是季胺官能基的苯乙烯二乙烯基苯共聚物，或叔胺 官能基的聚甲基丙烯酸酯树脂。 离子排斥柱填料主要为全磺化的聚苯乙烯二乙烯 基苯共聚物。 用于阴离子交换色谱法的典型薄壳型填料是用含有季胺官能团的甲基丙烯 酸十二醇酯聚合物涂渍在二氧化硅微球上制备的。 阳离子交换树脂是用低分子量 的磺化氟碳聚合物涂渍在二氧化硅微粒上制备的。 （3）检测器 IC 的检测器主要有电化学和光学两类。电化学检测器包括电导、安培、脉冲和积分安培；光学检测器主要有可见紫外和荧光。电导检测器是 IC 中用得最多的检测器。 用电导检测的 IC 仪有两种，一类称为化学抑制型电导 检测器， 即在分离柱与电导池之间串入一个叫做抑制器的部件，文献上常将抑制 器视为电导检测器的一部分，统称为化学抑制型电导检测器。 （4）数据处理系统 5.2.3 记录仪、积分仪和色谱工作站，均可用于 IC。IC-6 离子色谱仪的使用方法与维护（1）检查仪器 检查仪器的流路，电源线，地线是否接好，面板的按钮是否处于正常位置。 （2）开机并使仪器进入正常工作状态①接通电源，打开稳压器开关，将电压调至 220 V。 ②开启平流泵及色谱仪主机开关， 指示灯亮， 通去离子水， 流量 1.5 mL? min-1 到 2.5 mL?min-1，同时检查流路系统有无渗漏。 ③平流泵正常运转后，利用排气手轮进行调零，用流量选择和限压选择，调 至所需流量和压力。 ④打开离子色谱仪开关，按下电导按钮，量程选择数字表显示近 50 处为最 佳检测状态，按调零按钮，调节基线调节旋钮，使数字显示为零。 ⑤打开计算机，进入 EAST 色谱数据工作站。 （3）分析 ①输入文件名称，确定各个参数。 ②点采样菜单， 当进行阴离子分析时，将色谱仪主机板上的电导池转换键弹 起，将进样阀扳到进样位置，启动 A 采样，用注射器取试样从Ⅰ进样口进样，迅 速将阀扳到分析位置便完成一次进样，同时按阴离子绿色传导按钮。 ③当分析阳离子时，按下主机板上的电导转换键，样品从进样口Ⅱ进样，完 成进样后同时用手按下阳离子分析用的红色按钮。 ④开始采样，微机显示色谱流出曲线，数据采集完成后读取谱图文件。 ⑤对色谱数据进行处理，打印出结果。 （4）关机 ①分析完毕，退出 EAST 工作站。 ②连续通 10 min 去离子水冲洗色谱柱。 ③关闭色谱仪主机，平流泵及稳压器电源。 （5）注意事项与维护 ①操作过程中，出现与此规程不符者，立即报告老师。 ②所用淋洗涤液应过滤和脱气处理。 ③样品中不应含有悬浮物、大量有机物和重金属离子。 ④进样时，转动阀要迅速，以免造成高压力损坏流路和柱子。 ⑤色谱柱较长时间（1 周以上）不用时，应通 3％硼酸保存，用去离子水冲 洗平流泵。 实验五十四 离子色谱法测定生活饮用水中的阴离子一、实验目的（1）学习离子色谱分析的基本原理及其操作方法。 （2）了解常见阴离子的测定方法。 （3）了解微膜抑制器的工作原理。二、测定意义 我国生活饮用水卫生标准 （GB5749-85） 对生活饮用水水质标准及检验项目有明确规定， 生活饮用水中的氟化物(F )、氯化物(CL )、硝酸盐(NO3-)和硫酸盐（SO42-）含量是判断水质 是否合格的重要指标，国标检验方法对 F-、Cl-、NO3-、SO42-阴离子的测定，分别使用电极 法、滴定法和分光光度法，操作步骤多，尤其是在大批样品测定时，耗时较多。随着高性能 离子色谱柱的开发，离子色谱法可用于生活饮用水中多种阴离子的同时分析，具有简单、快 速和灵敏度高等优点，是光度法等其它方法无法比拟的。 三、方法原理 不同离子对某一给定离子交换柱中功能基存在亲合力的差异。 使用适宜的淋洗剂， 待测 的阴离子随淋洗液进入离子交换系统中时， 则在树脂功能基位置发生淋洗剂阴离子与样品阴 离子的离子交换平衡，不同样品离子因与固定相的作用力不同而在色谱柱中的保留时间不 等，通过柱后可得到分离。 四、仪器与试剂 离子色谱仪，ICS-90； EASY 色谱数据工作站；超声波发生器；注射器：l mL ；恒流 泵。 NaF、KCl、NaBr、K2S04、NaNO3、NaH2PO4、NaNO2、Na2CO3、NaHCO3、H3BO3、 浓 H2SO4 等均为优级纯；去离子水，其电导率&5 μS?cm-1。 7 种阴离子标准贮备液的配制 分别称取适量的 NaF，KCl，NaBr，K2SO4(于 105℃下 烘干 2 h，保存在干燥器内)，NaNO3，NaNO2，NaH2PO4(于干燥器内干燥 24 h 以上)溶于水 中，各转移到 1000 mL 容量瓶中，然后各加入 10.00 mL 洗脱贮备液，并用水稀释至刻度， 摇匀备用。7 种标准贮备液中各阴离子的浓度均为 1.00 mg?mL-1。 7 种阴离子的标准混合使用液的配制（见表 1 所示）分别吸取上述 7 种标准贮备液体积 为： 表 1 标准混合使用液的配制 标准贮备液 V(mL) NaF 0.75 KCl 1.00 NaBr 2.50 NaNO3 5.00 NaNO2 2.50 K2SO4 12.50 NaH2PO4 12.50于同一个 500 mL 容量瓶中，再加入 5.00 mL 洗脱贮备液，然后用水稀释至刻度，摇匀，该 标准混合使用液中各阴离子浓度如表 2 所示 表 2 阴离子浓度 阴离子 c/(ng?mL-1) F1.50 Cl2.00 Br-1 5.00 NO310.0 NO25.00 SO4225.0 PO4325.0洗脱贮备液(NaHCO3-Na2CO3)的配制 分别称取 26.04 g NaHCO3 和 25.44 g Na2CO3 （于 105℃下烘干 2 h，并保存在干燥器内） ，溶于水中，并转移到 l000 mL 容量瓶中，用水 稀释至刻度，摇匀，该洗脱贮备液中 NaHCO3 的浓度为 0.31 mol?L-1，Na2CO3 浓度为 0.24 mol?L-1。 洗脱使用液(即洗脱液)的配制 吸取上述洗脱贮备液 10.00 mL 于 1000 mL 容量瓶中， 用水稀释至刻度，摇匀，用 0.45 μm 的微孔滤膜过滤，即得 0.003l mol?L-1NaHCO3― 0.0024mol?L-1 Na2CO3 的洗脱液，备用。抑制液(0.1 mol?L-1 H2SO4 和 0.l mol?L-1 H3BO3 混合液) 称取 6.2 g H3BO3 于 1000 mL 烧杯中，加大约 800 mL 纯水溶解，缓慢加入 5.6 mL 浓 H2SO4，并转移到 1000 mL 容量瓶， 用纯水稀释至刻度，摇匀。 柱保护液 15 g H3BO3 溶解于 500 mL 纯水中。 五、 实验内容 （1）实验条件：YSA8 型分离柱；微膜抑制器，抑制电流 50 mA； 洗脱液流量：1.5 mol?L-1； 进样量 100 μL。 （2）打开电源，开启平流泵电源，流量调至 1.5 mol?L-1。按下色谱仪电导按钮，用量 程选择使数字表显示近 50 为最佳。按下调零按钮，调节基线调节旋钮，使数字表显示为零。 打开 EASY 数据工作站，按操作指南使用该色谱仪数据工作站。 （3）吸取上述 7 种阴离子标准贮备液各 0.50 mL，分别置于 7 个 50 mL 容量瓶中，各 加入洗脱贮备液 0.50 mL，加水稀释至刻度，摇匀，即得各阴离子标准使用液。 （4）将仪器调至进样状态，吸取 l mL 各阴离子标准使用液进样，再把旋钮打至分析状 态，同时启动开始键，样品开始进行分析，记录色谱图，各样品重复进样两次。 （5）工作曲线的绘制: 分别吸取阴离子标准混合使用液 1.00、2.00、4.00、6.00、8.00 mL 于 5 个 50 mL 容量瓶 中，各加入 0.5 mL 洗脱贮备液，然后用水稀释到刻度，摇匀，分别吸取 l mL 进样，记录色 谱图，各种溶液分别重复进样两次。 （6）取 1.00mL 洗脱贮备液于 100 mL 容量瓶，用待测水样稀释至刻度，摇匀，取 l mL 按同样实验条件进样，记录色谱图，重复进行两次。 六、数据处理 （1）按照 EASY 工作站使用手册，分别绘制各标准的工作曲线。 （2）计算出未知液中各组分的含量。 （3）打印分析结果和色谱图，并计算色谱分离度。 七、问题讨论 如果水样经过含氯消毒剂消毒， 被测定离子浓度与标准浓度相差较大， 会影响测定结果 的准确性，应适当加大样品稀释倍数，稀释时，最好用淋洗液进行稀释，以减小负峰对测定 结果的影响。 标准曲线和样品等实验测定应在相同条件下进行。 如果水样浑浊时， 用 0.45 μm 孔径滤膜过滤后进行测定，以免使仪器流路及色谱柱发生堵塞。 八、注意事项 （1）所有淋洗液应过滤和脱气处理。 （2） 样品中不应含有悬浮物、大量有机物和重金属离子。 九、思考题 （1）离子色谱与高效液相色谱在分离原理、系统构成方面有何异同？ （2）为什么需要在电导检测器前加入抑制器？实验五十五 离子色谱法测定水果和饮料中 Na 、NH4 、K 、Mg 、Ca2+、 Zn 的含量一、目的要求 （1）学习单柱离子色谱分析的基本原理及其操作方法。 + + （1）学习离子色谱分析 Na ，K 等常见碱金属阳离子。 二、测定意义2++++2+各种水果丰富了人们的生活， 各式各样富含营养元素、 微量元素的饮品也逐渐成为人们 + + + 2+ 2+ 2+ 的“新宠” 。不论水果还是饮品中都富含 Na 、NH4 、K 、Mg 、Ca 、Zn 等离子。对于人体来 讲，这些离子的含量保持在一定的生理浓度范围内，可保证电解质平衡，对人体的生长和正 常发育都非常重要。 人们通过吸收食品中上述离子适当补充这些微量元素和营养元素， 所以 有必要对食品中这些元素的含量进行测定。 目前测定这些离子的方法很多， 主要有原子吸收 光谱法、原子荧光光谱法、X 荧光光谱法、电位滴定法和分光光度法等。这些方法大多不能 同时分析多种离子，有时样品前处理复杂，操作繁琐，测定时间较长，而离子色谱法则分析 速度快、灵敏，能同时分离分析多种离子。 三、方法原理 双柱法分析阳离子与双柱法分析阴离子相似， 不同的是分析柱用低交换容量的阳离子交 换树脂，抑制柱用高交换容量的阴离子交换树脂，淋洗涤液用极稀的硝酸。若以 RSO3 H 代 + 表阳离子交换树脂，以 R4NOH 代表阴离子交换树脂，以 Y 代表碱金属离子，以 X 代表淋洗涤 液和样品中的阴离子，则交换反应如下： + + + + RSO3 H + Y → RSO3 Y + H (前置柱和分离柱的反应) + + + R4N OH + X → R4N X + OH H + OH ? H2O （抑制柱上的反应） + 由于 Y 中各碱金属阳离子与 RSO3 的亲和力不同，因而被淋洗涤液冲洗出。色谱柱的速 度也不同，这就使混合碱金属阳离子，按先后顺序流出色谱柱，经检测和数据记录系统将各 离子的色谱峰记录下来。 四、仪器与试剂 离子色谱仪，色谱数据工作站，超声波发生器，1 mL 注射器♂ 吡啶-2 , 6- 二羧酸、氯化锂、氯化钠、氯化铵、硝酸钾、无水乙二胺、草酸、硝酸钙、 硝酸镁、氯化镍、氯化锌、硝酸钴、硝酸镉、氯化锰、氢氧化钠、盐酸、氯化钾，以上试剂 均为分析纯。 去离子水电导率小于 1 μS?cm-1。 色谱条件：测定 Na+、 NH4+、K+离子时， 淋洗液为 1.5 mmol? L-1 的吡啶-2,6-二羧酸溶液； 流速 1.0mL? min-1；进样量 20 μL；测定 Mg2+、Ca2+、Zn2+ 离子时，淋洗液为 0.25 mmol? L-1 乙 二胺 -0.50 mmol? L-1 草 酸 -0.001 mmol? L-1 吡 啶 -2,6- 二 羧 酸溶 液 (pH 4.00) ； 流速 1.0 -1 mL? min ；进样量 20 μL。 五、实验内容 （1）标准溶液的配制 用去离子水配制标准溶液和淋洗液。 （2） 样品前处理 对于市售饮料，无需前处理，直接用去离子水稀释适当倍数，经 0.45 μm 微孔滤膜过滤后待测。对于水果，去皮，取可食用部分用研钵捣成浆状，加水煮沸 5 min 左右，放凉定容至 100 mL，放置过夜。布氏漏斗过滤，滤液经 0.45 μm 微孔滤膜过滤 后待测。 （3）回收率实验溶液的配制 样品前处理同上，在样品中加入各阳离子标准溶液， 定 容备用。 （4）分离 Na+、NH4+、K+离子的色谱条件 用不同浓度的吡啶-2,6-二羧酸作淋洗液， 分别测定 Li+、Na+、NH4+ 和 K+ 4 种离子的保留时间。随着淋洗液中吡啶-2,6-二羧酸浓度的 增大，淋洗液的洗脱能力增强，Li+、Na+、NH4+ 和 K+ 4 种离子的保留时间均缩短。当吡啶 -2,6-二羧酸浓度为 1.5 mmol?L-1 时，分离效果最好，各种离子的保留时间也适当。 （5）分离 Mg2+、Ca2+、Zn2+离子的色谱条件 实验选择 0.25 mmol?L-1 乙二胺-0.50 mmol?L-1 草酸-0.001 mmol?L-1 吡啶-2,6-二羧酸溶液(pH4.00)作淋洗液。 （6）配制一系列不同浓度的混合标准溶液 分别在上述色谱条件下进行分析，得到相 对标准偏差、线性范围和检出限(S/N=3)等定量参数。（7）样品分析 按实验方法测定，根据保留时间进行定性，采用标准加入法检验方法 的回收率 六、数据处理 （1）打印分析结果和色谱图，并计算色谱分离度。 （2）计算相对标准偏差、线性范围和检出限(S/N=3)等定量参数。 （3）计算各阳离子含量。 七、问题讨论 影响组分保留的因素很多，有固定相和淋洗液的种类，淋洗液的浓度，温度等，本试验 中考察了淋洗液中吡啶-2,6-二羧酸浓度、乙二胺浓度、草酸浓度以及溶液 p H 值对各种离子 保留行为的影响。随着淋洗液中吡啶-2,6-二羧酸浓度、乙二胺浓度、草酸浓度以及溶液 pH 的增加，各种离子的保留时间均有所减少，甚至有时会出现淋洗顺序交错现象。综合考虑淋 洗液中各因素对金属离子保留时间的影响， 实验选择 0.25 mmol? L-1 乙二胺-0.50 mmol? L-1 草酸-0.001 mmol?L-1 吡啶-2,6-二羧酸溶液(pH4.00)作淋洗液。 八、注意事项 （1）测定前，要通过淋洗液对机器进行足够时间的淋洗，确保机器达到稳定状态。 （2）室温控制在 20℃左右，尽量保持温度的稳定。温度的波动会导致时间的改变、基 线的飘移及重复性变差。 九、思考题 （1）单柱离子色谱与双柱抑制型离子色谱有何区别？ （2）电导检测器为什么能用做离子分析的检测器？5.35.3.1高效液相色谱分析法概述高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是以 液体作为流动相的一种色谱分析法。与气相色谱相比，它同样具有高灵敏度，高 效能和高速度的特点，但它的应用范围更加广泛。据估计，在自然界数百万种有 机化合物中，仅有 20％可以不经过化学预处理，直接采用 GC，而对于总数的 75％～80％则可采用高效液相色谱进行分离分析，特别是许多高沸点、难挥发、 热稳定性差的物质，如生物化学制剂，金属有机结合物等物质的分离分析，尤须 借助于高效液相色谱方法。 根据固定相的类型和分离机理，HPLC 可分为液-固吸附色谱，液-液分配色 谱， 离子交换色谱和凝胶渗透色谱等几大类。用于 HPLC 的检测器有紫外-可见分 光光度检测器，差示折光检测器，荧光检测器，极谱检测器，电导检测器等。HPLC 的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中，采用保留 值定性，或与其他定性能力强的仪器分析法连用，如与质谱法，红外吸收光谱法 等联用。在定量分析法中，采用归一化法，内标法或外标法。HPLC 在分离复杂 组分时，有些组分常不能出峰，因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被 广泛使用。 5.3.2 高效液相色谱仪使用方法高效液相色谱仪由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统等五大部 分组成。图 5-4 为高效液相色谱仪示意图。分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲 洗柱子，待柱子达到平衡而且基线平直后，用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样 带入色谱柱进行分离， 分离后的组分依次流入检测器的流通池， 最后和洗脱液一起流入流出 物收集器。当有样品组分流过流通池时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记 录器记录下来就得到色谱图。色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。图 5-4 高效液相色谱仪示意图 1D流动相贮瓶；3D高压泵；8D过滤器；9D脉冲阻尼； 10D进样器；11D色谱柱；12D检测器；13D记录仪具体操作步骤如下： （1）将恒流泵上末端带有过滤器的输油管插到经脱气的液相贮液瓶中。 （2）开启高压电源开关，电源指示灯亮，泵内电机工作，并调节流量选择于 所需流量。 （3）打开排气旋钮，将空气排尽，旋紧排气旋钮，此时压力即指柱前压力， 旋转限压选择，使其值较柱前压大 980～2000 kPa 处。 （4）开启紫外检测器电源开关，电源指示灯亮，并把灵敏度选择置于所要求 的挡上。 （5）开启电平衡开关，电流表指针偏转，旋转电平衡粗调和微调，使电流表指针在“0”处，若调不到，表明检测器的测量池内有气泡，应予以排除。 （6）开启色谱数据工作站，设置各参数，待基线平直后，即可进样。 （7）旋转六通进样阀至进样位置。 （8）用微量进样器吸取一定试样溶液，插入六通进样阀的进样针孔中，把试 样溶液缓慢推入，把进样阀切向分析位置。 （9）经过半分钟，拔出微量进样器并将切换手柄再切向进样位置。 （10）记录下色谱图，并用工作站对数据进行处理。 （11）实验完毕后，依次关闭计算机、检测器、恒流泵等电源开关。 注意事项同离子色谱法使用注意事项。实验五十六一、目的要求HPLC 柱填充技术和柱性能考察（1）掌握匀浆法装柱技术。 （2）掌握考察色谱柱基本特性的方法。二、测定意义 色谱柱分离效能的好坏， 不仅与填料特性和填充方法有关， 而且与从事装柱工作的经验 有关。无论是自己装填的还是购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放 置一段时间后也要重新检查。柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温 度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分 离度。一般说来容量因子和选择性因子的重复性在±5%或±10%以内。进行柱效比较时， 还要注意柱外效应是否有变化。一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、 内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称度和柱压降等。 三、方法原理 （1）色谱柱的填充 目前，一般都采用湿法+匀浆法装柱。匀浆法，就是选择一种合 适的液体作为分散介质，制成微粒在介质中高度分散的固定相悬浮液，在整个填充过程中， 微粒不沉降或凝聚。然后，用高压输液泵在高于实际操作压力下，用顶替液将该悬浮液迅速 压入柱内。 （2）柱性能考察 评价液相色谱柱的性能是否优良，有不同的方法和考察指标。本实 验从理论塔板数和峰对称性二个方面进行考察。 ①理论塔板数：色谱柱的分离效率简称柱效，可定量地用理论塔板数来表示，理论塔板 数反映色谱柱本身的特性，表明柱效受填料颗粒度、柱内径、流动相流速和粘度、进样方式 等影响，是一个具有代表性的参数。 ②峰对称性： 峰不对称性用峰不对称因子(Peak Asymmelry Factor)表示。 其计算方法为， 由峰顶向基线作垂线，并在峰高 10%处作基线平行线，得 A、C、B 三交点，则峰不对称因 子可由下式计算求得。 PAF=CB/AC 一根良好的色谱柱，峰不对称因子应在 0.8~1.2 范围内。四、仪器与试剂 气动放大恒压泵（流量 1L?h-1） ；超声波发生器，不锈钢色谱柱(15 cm× 4 mm)。 YWG-C18(5 m 或 10 错误！未找到引用源。m) 甲醇：水=60：40，试验混合物：硝基苯―苯乙酮―甲苯。 五、实验内容 （1）色谱柱的填充 ①将色谱柱依次用氯仿、丙酮、甲醇、水、甲醇清洗，然后吹干，在柱下端装上过滤片 及带密封垫的螺母，按主教材接好装置。 ②检查泵系统是否正常，是否泄漏。 ③将 500 mL 顶替液置于超声波发生器上，脱气处理 15-20 min。 ④称取超过色谱柱实际用量 15%的 YWG-C18 填料， 倒入小烧杯中， 加入分散介质(5~10 -1 mL?g 填料)，摇匀，用超声波处理 l0 min，制成均匀的匀浆液。 ⑤迅速将匀浆液倒入匀浆罐中。 ⑥压紧顶盖，打开放空阀，从出气扫加入少量分散介质，使排气管充满液体，关闭放空 阀。 ⑦打开高压阀，使压力迅速升至 400~500 Mpa，让顶替液迅速将匀浆液压入柱中，待流 出 100~150 mL 液体后，逐渐降低压力，至停泵。待柱中不再流出液体时，卸下柱子，装上 过滤片及密封螺母。 （2）色谱柱性能考察 ①将填充好的色谱柱接入色谱系统。 ②启动仪器，待基线平稳后即可进样。 ③检测器 UV-254 nm，注入 3-5 L 试验混合物溶液，记录色谱图。 六、数据处理 根据柱长(cm)，组分的保留时间 tR(min)，组分的半高峰宽 Wh/2(mm)，计算每米柱的 理论塔板数、理沦塔板高度和合组分的不对称因子。 七、问题讨论 对于一个装填良好的色谱柱而言，随着所装填的填料平均粒径的减小，柱效提高，但是 对于某个特定的 HPLC 仪器，如果引起峰展宽的柱外效应足够大，小粒径色谱柱的高柱效 就不能实现。柱外峰展宽效应由填料本身以外的所有额外的体积引起，包括进样体积（包括 进样环以及进样阀内的额外体积） ；从进样阀（器）出口到色谱柱入口的管路体积；保护柱 内的间隙体积（保护柱如果有柱头，还包括柱头内体积） ；在线过滤器内体积；色谱柱入口 到色谱填料之间的一段距离的体积， 包括筛板孔隙和液流路径的体积； 色谱柱内填料颗粒之 间的间隙体积； 色谱柱色谱填料到出口的一段距离的体积， 包括筛板孔隙和液流路径的体积； 色谱柱出口到检测器入口的管路体积；检测器入口到流通池的管路体积；检测流通池体积。 所以，要得到期望的分离效率，就要确保把 HPLC 体系的柱外效应减到最小。 八、注意事项 （1）所配制的匀浆液浓度不宜过高，否则将影响固定相在分散介质中的均匀分散。通 常，悬浮液中含填料 10%左右。 （2）填充过程所施加的压力，一般在 200～600 MPa 的范围内。压力过高，柱内填充 床可能产生裂纹或结块，压力过低，固定相不够紧密，柱效降低。 九、思考题 （1）如果用填充好的柱子测得的色谱峰不对称应该怎样进行改善。 （2）如何保护色谱柱延长使用寿命？实验五十七高效液相色谱用于芳香族化合物的定性定量分析一、实验目的 （1）了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术。 （1）了解高效液相色谱仪和紫外检测器（或二极管阵列检测器 DAD)的使用范围、原 理和使用方法。 （1）学会内标曲线法进行定量分析。 二、测定意义 水中的苯系物通常包括苯、甲苯、乙苯、间二甲苯、对二甲苯、邻二甲苯、异丙苯、苯 乙烯等几种化合物 除苯是已知的致癌物外，其它几种化合物对人体和水生生物均有不同 程度的毒性。室内空气污染是继D煤烟污染‖和D光化学污染‖之后的全球第三代污染重点。其 中造成室内空气污染的一个重要污染源便是苯类物质（甲苯、二甲苯） ，苯系物(甲苯、二甲 苯等)超标率为 14.6%。近年来，随着国民经济的日益发展，人民生活水平的逐步提高，买 房装修已成为平常事，而且现代人 90%的时间在室内工作或生活，因此，室内空气污染问 题不得不引起人们的高度警觉。 它们对人类身体健康的影响及对他们的监测已成为一个重要 问题。因此， 测定水中或空气中苯系物含量对环境保护具有重要的意义。气相色谱法和高 效液相色谱法都能用于苯系物的测定，并具有很高的检测灵敏度。 三、方法原理 高效液相色谱法以液体作为流动相的色谱法。 它是在经典液相色谱实验基础上引入气相 色谱的理论, 在技术上采用高压输液泵?高效固定相和高灵敏的检测器?而发展起来的快 速分离分析技术。具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。 苯系物为芳香烃化合物，具有紫外吸收官能团，样品不需要衍生，可以直接采用紫外光 谱法进行检测。 本实验采用内标曲线法进行定量分析。 四、仪器与试剂 （1）岛津LC-20 高效液相色谱仪，具有可变波长紫外检测器， 色谱工作站，微量进样 器（10μL），Hypersil BDS C18( 4.6 mm× 250 mm，5 μm)色谱柱。 0.45μm孔径微孔过滤器 （2）试剂：苯，甲苯，二甲苯（色谱纯） ， 甲醇，水（新蒸二次重蒸水） 五、实验内容 (1) 高效液相色谱操作条件： 流动相：甲醇+水=70+30（V/V）, 使用前经 0.45μm 滤膜 过滤并超声脱气。 柱温：室温， 流速：1.0 mL/min， 检测波长：254nm, 进样量：10μL。 （2）标准溶液配制： 称取色谱纯苯， 甲苯， 二甲苯各 0.05g（精确到 0.0001g）于 50mL 容量瓶中， 用甲醇溶解并稀释至刻度， 摇匀待用，此溶液质量浓度（苯， 甲苯， 二甲苯） 为 1.00 mg/mL。 （3） 试样溶液的配制 称取 1g （精确到 0.0001g） 混合试样， 置于 50mL 容量瓶中， 用 甲醇溶解并稀释至刻度， 超声振荡 20min, 取出， 经 0.45 经 0.45μm 滤膜过滤， 备用。 （4）标准曲线的制备 分别吸取苯，甲苯和二甲苯标准溶液 0.50，1.00，1.50，2.00 2.50，3.00mL 置于 50 容量瓶中， 用甲醇稀释至刻度， 摇匀， 配制成含苯， 甲苯，二甲苯 10.00μg/mL, 20.00μg/mL，30.00μg/mL， 40.00μg/mL，50.00μg/mL，60.00 的标准溶 液， 经 0.45 经 0.45μm 滤膜过滤待用。 在上述色谱条件下， 待仪器基线稳定后进样 10μL 标准系列溶液， 记录色谱峰面积， 以苯， 甲苯， 二甲苯的质量浓度为横坐标， 相应的峰面积为纵坐标， 绘制标准曲线， 或 求出线性回归方程。 （5） 试样的测定 在与标准系列溶液相同的条件下注入待测溶液， 根据色谱峰保留时 间定性，记录色谱峰面积，并根据标准曲线或线性回归方程求得待测样品中各组分的浓度。 (6) 测试完毕， 先用 100%水洗脱色谱柱至压力平衡， 持续 10 分钟， 改用 90% 甲醇 水溶液洗脱至压力平衡， 最后用纯甲醇平衡色谱柱。 六、数据处理 （1）分别绘制各标准样品的工作曲线，确定线性范围。对照工作曲线计算各组分含量。 苯， 甲苯， 二甲苯质量分数X(%)按下式计算式中m 为试样的质量。 （2）利用保留时间对各组分定性。 七、问题讨论 芳香烃混合物的分离检测可以采用气相色谱法也可以采用高效液相色谱法分析， 高效 液相色谱分析不需要对样品进行加热， ?高效液相色谱只要将样品制成溶液?而气相色谱需 加热气化或裂解， 液相色谱采用紫外检测器， 对样品无破坏，样品好、可以纯化回收，而 气相色谱法采用氢火焰离子化检测器，是破坏型检测器。 本实验采用的是反相色谱法， 固定相极性大于流动相极性， 在反相色谱体系中，极性 强的组分，在流动相中溶解度较大，因此 k 值小，先出峰。极性弱的组分，在固定相中的溶 解度较大，因此 k 值大，后出峰。在正相色谱中组分的出峰正好相反，标准试液组分的出峰 顺序依次为苯， 甲苯， 二甲苯。 八、注意事项 （1）采用微量进样器进样时， 不要将气泡注入色谱系统中， 以免引起压力不稳定， （2）及时添加流动相， 工作状态时， 切不可使液面低于泵头。 九、思考题 （1）从仪器构造， 分离原理和应用范围比较HPLC和GC的异同点。 （2）试分析苯的保留时间为什么比甲苯的短？高效液相色谱法同时测定氨基酸一、实验目的 （1）了解高效液相色谱在叶绿体色素全分析的应用。 （1）掌握生物样品的高效液相色谱实验技术。（1）初步掌握梯度洗脱实验技术。 二、测定意义 植物光合色素的分析方法有许多种，经典的方法有纸层析和薄层层析。方法较简便，但 准确性不高。随着高效液相色谱技术的发展，有人已将它应用于植物色素的分析中 。由于 从植物提取液分离出来的叶绿素和胡萝卜素已发现有多种异构体，而且常常是同时存在的， 因此对叶绿素和胡萝卜素的深入研究较为困难。 高效液相色谱是一种准确度好和精密度高的 分析技术， 尽管难以得到所有的植物色素标准品， 但仍被认为是研究叶绿素和胡萝卜素的一 种最有效手段。 三、方法原理 叶绿素提取液可以采用正相或反相高效液相色谱法分析， 实验表明， 反相高效液相色谱 法更加方便。 由于色素提取液各组分的极性差别较大， 等度洗脱可能使某些组分的分离不够 完全。因此，对植物色素提取液的全分析应采用梯度洗脱方式以改善分离和缩短分析时间。 本实验采用高效液相色谱法可对绿色植物叶片提取液中的色素进行较全面的分离， 并直 接测定叶绿素 a、叶绿素 b 和 β-胡萝卜素的含量。 四、仪器与试剂 （1）岛津LC-20 高效液相色谱仪，色谱工作站，微量进样器（100 μL），Hypersil BDS C18( 4.0 mm× 200 mm，5 μm)色谱柱。 （2）叶绿素a、叶绿素b和β-胡萝卜素纯品，甲醇、二氯甲烷和乙腈为液相色谱淋洗剂， 实验用水为二次去离子水，经玻璃系统重蒸馏。 五、实验内容 （1）色素的提取 取约0.5 g左右干净、新鲜的去脉菜叶，准确称重。剪碎，置于研钵 中，加0.1 g MgCO3和5 mL 90% 丙酮，研磨至浆状，分次加入5 mL 丙酮，沥出提取液。高 速离心后，移出上清液。重复提取直至植物组织无色。合并上清液，转入50 mL容量瓶中， 以90% 丙酮定容。试液经过0.2 μm 针筒式微孔滤膜过滤器直接注入色谱仪分析。 （2）流动相的配制 实验前，配制二氯甲烷-乙腈-甲醇-水（20 : 10 : 65 : 5，v/v）流动 相。流动相需用0.45 μm 微孔膜过滤，并经超声波除气15 min 后使用。 （3） 色谱条件 色谱柱为Hypersil BDS C18( 4.0 mm× 200 mm， 5 μm） ， 另加一20 mm C18 的保护柱。流动相为二氯甲烷-乙腈-甲醇-水（20: 10 : 65 : 5，v/v），流速为1.5 mL?min-1， 检测波长为440 nm和660 nm。进样体积为20 μL。 （4）工作曲线的绘制 于6个10 mL 容量瓶中，分别移入0，0.20，0.40，0.60，0.80和 1.00 mL 0.10 mg?L-1色素标准混合液，用流动相定容，然后分别进样分析。为提高各个组 分的检测灵敏度，可设定一个检测波长-时间程序进行检测。在0~50 mg?L-1范围内，叶绿 素a、叶绿素b、叶绿素a和β?胡萝卜素的浓度应与峰面积呈现良好线性关系。计算相应的回 归方程和相关系数。 （5）实际样品测定：菜叶色素提取物经0.2 μm针头式过滤器直接进样分析。 六、数据处理 （1）分别绘制各标准样品的工作曲线，确定线性范围。对照工作曲线计算各组分含量。 （2）利用保留时间对各组分定性。七、问题讨论 在正相色谱体系中，极性弱的组分，在流动相中溶解度较大，因此 k 值小，先出峰。极 性强的组分，在固定相中的溶解度较大，因此 k 值大，后出峰。在反相色谱中组分的出峰正 好相反，标准试液组分的出峰顺序依次为叶黄素、叶绿素 b、叶绿素 a 和 β?胡萝卜素。 八、注意事项 （1）在所有的提取过程中，应尽可能防止色素发生分解、氧化。操作过程中均应在避 免高温、强光照射、高湿度、低 pH 条件下迅速完成。 （2）每完成一种试液分析，应用丙酮等溶剂将进样注射针彻底洗干净。否则会引起样 品残留，影响下一个样品分析。 九、思考题 （1）为什么要进行梯度洗脱？在梯度洗脱过程中要注意哪些问题？ （2）对生物样品进行高效液相色谱分析，应对进样溶液做那些预处理？实验五十八反相离子对色谱分离水溶性维生素一、目的要求 （1）掌握反相离子对色谱分离水溶性纤维素的方法。 （2）了解反相离子对色谱分离水溶性纤维素的原理及方法特点。 二、测定意义 目前，含维生素药品制剂很多，且它们的组成复杂，所以对其分析是很有意义的。而反 相离子对色谱分离方便简单，效果好，重现性好。 三、方法原理 水溶性纤维素包括：VB1 (硫胺素)，VB2(核黄素)，VB5(烟酰胺，烟酸)，VB6(吡哆醛、 吡哆醇)， VB11 （叶酸） ， VB12(钴胺素)和 VC 等。 在用反相离子对色谱法测定中， 阳离子 A+(样 品离子)和反离子 B-(烷基磺酸根离子)先形成离子对，再在流动相和固定相中分配。 保留时间为：式中，β 为相比，tM 为死时间，KA，B 为平衡常数。 可见样品的保留时间受离子对试剂的浓度和可逆过程的总平衡常数的影响。 因此， 对混 合水溶性纤维素分离的影响，除反离子的浓度外，还有流动相的 pH，甲醇与水的配比，有 机添加剂三乙胺(TEA)浓度和柱温。TEA 作为流动相的添加剂，可减少碱性样品色谱峰的 拖尾。 四、仪器与试剂 高效液相色谱仪；超声波发生器。 甲醇；十二烷基磺酸钠；三乙胺；水溶性纤维素混合标样。 混合标样配制 将 VB1、烟酸、烟酰胺、吡哆醛、吡哆醇、VB12 和 VC 溶于水配成含 量均为 30 μg?mL-1 的水溶液(溶液 1)。将 VB2 和 VB11 滴入少量发 5％Na0H 使之溶解，再用 去离子水稀释至各含 100 μg?mL-1 的混合液(溶液 2)。使用前，将溶液 l 和溶液 2 以 1：1 混 合，配成含 9 种纤维素的混合标样。以相应的方法制成各维生素的单个标样。同时配制一含有 9 种维生素的混合试样，以供实验分析。 五、实验内容 （1）实验条件： 色谱柱：YWG―G18，10 μm，25cm× 4.6 mm；检测器：UV―254nm；柱温：30℃； 流动相：甲醇：水=40：60，十二烷基磺酸钠 1.5 mmol?L-1，三乙胺 0.3％，用磷酸调节 PH 至 3.0；流动相流速：1.0 mL?min-1。 （2）启动仪器，用大约 180 mL 流动相流经色谱拄，待基线稳定后，分别注入 10 μL 的各单个维生素标样，记录色谱图和出峰时间。 （3）注入 10 μL 混合试样，记录色谱图和各峰的出峰时间。 （4）实验结束，用 90％甲醇―水溶液冲洗色谱柱 1 h 左右。 六、数据处理 根据标样的保留时间找出混合试样色谱图中各峰对应的样品名称。 七、问题讨论 本实验采用离子对反相色谱法分离水溶性维生素， 用十二烷基磺酸钠作离子对试剂， 在 流动相中加入少量三乙胺以减少 VB1 和 VB2 的拖尾现象，使峰变窄。同时在流动相中加入 醋酸调节流动相的 pH 值。流动相的 pH & 3 时，VB1 和 VB2 保留时间太短，峰形不好，分 离差；pH & 5 时，VB1 和 VB2 的保留时间增长, 并且 VB1 和 VB2 在碱性介质中不稳定。 八、注意事项 （1）制备流动相用试剂均为分析纯，水用二次蒸馏水，维生素为生物试剂。 （2）用庚烷盐作为离子对试剂效果更优，但其价格较贵。 九、思考题 （1）反相离子对色谱同时分离混合水溶性纤维素有哪些影响因素？ （2）流动相的组成对分离有何影响？在实验中，若改变流动相中甲醇与水相之比，分 离情况会怎样？