蛋白质相互作用技术服务-蛋白相互作用检测-细胞生物学服务-
400-699-1663
广东省广州市萝岗区科学城广州国际企业孵化器A110
蛋白质相互作用技术服务
|&&&&&&&&&蛋白质相互作用技术服务
蛋白质相互作用技术服务&
蛋白质相互作用技术服务
体内验证/寻找互作蛋白的技术，符合生理条件，准确性高
体外验证/寻找互作蛋白的技术，适用范围广
用于寻找互作蛋白，在COIP基础上引入SILAC标记，采用定量的方法区分假阳性蛋白，极大的降低了假阳性率
用于寻找互作蛋白，COIP基础上加入二次纯化，液质联用鉴定免疫复合物，灵敏度高，假阳性率更低
免疫共沉淀（CO-IP）和简介
&&& 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原间的专一性作用为基础的、研究蛋白质相互作用的经典方法。 基本原理：用温和的裂解方式裂解细胞，目的是保留住细胞内的蛋白结合情况，向裂解液中加入“诱饵蛋白”特异性的抗体，抗体、诱饵蛋白和结合蛋白通过免疫反应形成复合物，洗脱收集复合物，SDS-PAGE电泳，western blot或质谱可验证或鉴定与诱饵蛋白互作的蛋白质。
&&& Pull-down又叫做蛋白质体外结合实验，是在外源条件下检测蛋白质间相互作用的方法。基本原理：将靶蛋白-GST融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当 “诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的结合蛋白，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，验证两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白；“诱饵蛋白”一般采用原核表达（也可以通过其他方式）获得，而“捕获蛋白”可以是细胞裂解物、纯化蛋白或表达系统获得的蛋白。
技术优势：
<FONT color=#.Co-IP基于细胞内的蛋白质相互作用，得到的诱饵蛋白是与靶蛋白天然结合的，符合体内真实生理状况。
基于细胞外的蛋白相互作用，其应用范围更广。
&&& 由于实验条件的限制，CO-IP的适用范围也受到一定影响，例如植物中可用于CO-IP实验的抗体极少，或某些动物组织由于含较多脂肪，都比较难进行Co-IP实验；比较而言，Pull-down实验大多采用标签（如GST）抗体来检测，因此适用范围更广；但Pull-down实验的前提是必须获得可溶的蛋白（而原核表达容易形成包涵体，这点需要考虑）。因此在实际应用中，可综合考虑实验条件，选择更合适的方法；而一般验证蛋白互作也常常需要将体内实验和体外实验结合起来。
&&& 辉骏生物已成功完成数十例Co-IP或Pull-down技术服务，协助客户完成的CO-IP结果发布在Nature子刊上。我们承诺，若验证结果为阴性，我公司做第二遍验证，若两次结果均为阴性，仅收取80%的服务费用，最大程度的降低了客户的实验成本。
SILAC-IP技术简介
&&& 在CO-IP基础上引入SILAC同位素标记来筛选互作蛋白的方法。基本原理：用轻、重链同位素培养基分别培养对照组和实验组细胞，传6代以后，细胞蛋白质被同位素完全标记上；在此基础上收集等量细胞，进行Co-IP实验，分离免疫复合物；之后，利用LC-MS/MS来定性和定量复合物中的蛋白：当实验组与对照组中某个蛋白质的含量达到统计学差异时，判定这个蛋白与诱饵蛋白具有相互作用。
技术优势：
<FONT color=#.特异性强，结果可信，假阳性极低；
<FONT color=#.高通量，能一次性检测到多种互作蛋白
<FONT color=#.能直接检测出与bait蛋白互作的其它蛋白的相对含量
&&& 辉骏生物在细胞培养、CO-IP、蛋白质组学实验方面都有丰富的经验，拥有从SILAC细胞培养，到LC-MS检测和生物信息学分析的一整套服务体系，可以为客户提供全面的蛋白质互作服务；2013年已协助客户发表以SILAC-IP为主体的SCI论文。近两年，我们在 “SDS-PAGE+胶内酶解”的基础上开发了“磁珠偶联+溶液酶解”的方法，进一步提高了检测的灵敏度。
TAP-MS技术简介
&&& TAP是在COIP的基础上加入第二次亲和纯化，筛选互作蛋白的方法。基本原理：靶蛋白融合2个标签蛋白（STREP和Flag），采用慢病毒的方法介导靶蛋白在细胞内的过表达（同时设置对照组），用温和条件裂解细胞，分别获得实验组和对照组的细胞裂解液，2组样本分别经过两步连续的亲和纯化获得蛋白质复合物，再通过LC-MS分别鉴定实验组和对照组中的蛋白质。
技术优势：
<FONT color=#.采用双标签两步纯化获得高特异性的结合蛋白，可信度高
<FONT color=#.高通量，可以一次性鉴定到多种互作蛋白
服务优势：
辉骏生物拥有完善的细胞培养、载体构建、慢病毒包装、稳转细胞株建立、蛋白质互作、蛋白质质谱鉴定实验平台，可以为客户提供整体实验服务；已完成项目显示，该技术可以一次性检测到50-100种差异蛋白（即互作蛋白），能为客户的后期项目提供十分有利的研究基础。
实验服务周期及收费标准：咨询本公司
更多资讯可直接点击QQ咨询，或者登陆了解更多详情&1&
点击：3362& 录入时间：&
│实验服务│││││
www. 广州辉骏生物科技有限公司 版权所有
服务电话：400-699-1663 QQ： 邮箱： 站长统计
技术支持：盛豪网络新功能、新界面、新体验，扫描即可下载生物谷APP!
>> PNAS：研究发现蛋白相互作用可以促进癌症转移！
PNAS：研究发现蛋白相互作用可以促进癌症转移！
来源：生物谷
日讯 /生物谷BIOON /——来自梅奥诊所的研究人员发现了蛋白之间的一种相互作用，允许癌细胞生长并转移。他们认为这项发现对于明白一系列恶性肿瘤如何生长具有重要意义，包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、直肠癌、肺癌和皮肤癌等。他们的工作最近发表在Proceedings of the National Academy of Sciences上。
“在我们的文章中，我们发现了粘着斑激酶和肌球蛋白之间的直接相互作用，这种作用可以促使产生分泌促癌蛋白。”梅奥诊所的皮肤科医生Alexander Meves博士说道。
Meves博士说癌细胞使用这些分泌的蛋白创造出刚性、不溶的支架，从而抑制抗癌免疫、促进肿瘤生长转移。转移是一种致命的状况，这种情况下癌细胞会从它们产生的部位到达机体其他部位。
“肿瘤细胞对它们的环境具有很强的响应性，它们会适应环境。”Meves解释道，“粘着斑激酶为细胞提供了环境信息，尤其是环境的刚性或弹性。”
Meves博士说肌球蛋白可以将粘着斑激酶从细胞膜转运到细胞核中，他认为一旦粘着斑激酶和肌球蛋白相互作用，粘着斑激酶就可以被运输到细胞核中帮助细胞通过基因转录适应环境。
“我们的希望是我们文章中的结构数据信息也许可以帮助开发出通过抑制粘着斑激酶和其他蛋白相互作用来抑制癌症进展的药物。”Meves说道。
这项研究是一个基于梅奥诊所团队的以病人为中心的研究结果，该团队包含知名的医生、研究者及科学家，他们正在开发或者提供最新技术和治疗方案满足病人需求。（生物谷）
本文系生物谷原创编译整理，欢迎转发，转载需授权！点击&&。更多资讯请下载生物谷&.
原文出处：
Joel B. Heim et al, , Proceedings of the National Academy of Sciences (2017). DOI: 10.1073/pnas.
温馨提示：87%用户都在上阅读，扫描立刻下载! 天天精彩！
...（全文约2261字）
旗下网站： |
Copyright&2001- 版权所有 不得转载.关注今日：18 | 主题：396391
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
我总结的细胞中提取核蛋白步骤
页码直达：
这个帖子发布于13年零89天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
从25cm2细胞瓶中提取步骤：1、PBS洗2次。2、胰酶消化细胞，加4度培养液5ml中止反应。3、3000rpm 离心5min（4度），去上清。4、加入裂解液1.5ml，剧烈涡旋。5、冰加异丙醇，搅拌成糊状，离心管放入冻结，然后37度融化，反复3次。6、100度煮沸5min。7、15000rpm离心10min。8、吸上清于新管，进行电泳。或者－80度冻存。裂解液：60mM Tris-HCL(PH7.2)
PMSF和巯基乙醇有毒，所以没有用，影响应该不大。保持低温操作，可以不用加蛋白酶降解抑制剂。我看到有人加了10％甘油，不知道起什么作用。
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
不知这是哪里的配方？是用于核蛋白的提取的吗？细胞裂解后只是低温操作而没有蛋白酶抑制剂应该是不可以的，是否是因为系统里早早加入了有机溶剂的原因？请提供该方法的出处。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
可是师姐告我由于：（1）、低温操作（2）、裂解操作时间短，所以不需要加入蛋白酶抑制剂。这是我自己总结细胞中提取核蛋白步骤，请指正。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
看起来如果可行更象是全细胞裂解，原因是胞质蛋白在系统中象是没有除去。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
yes,the nuclear proteins still are
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请问主任：我的目的是将细胞核内的P53蛋白提取出来，这个步骤是否还需要修改？我马上要做，请指教。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
不敢当。但我觉得这个步骤好象是提全细胞裂解液的，也就是不分细胞质蛋白和核蛋白。当然这个方子也完全可以提出蛋白来，不过不是核里的。P53 是活化后进核的吗？我不太了解，总之根据不同的实验目的，核蛋白可以用全细胞裂解液，也可以单提胞质和胞核。这个方子觉得有个缺点，好象没有中间留样品测蛋白浓度的一步。不过WB 里也可以用beta-actin 来 normalize，不一定要测浓度定量。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
icesugar75 edited on
有谁知道细胞色素c的检测方法， 不用蛋白印迹，检测裂解细胞的含量
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
多谢主任（xddu是我的马甲）！p53基因是抑癌基因。我用脂质体介导入细胞内，然后染毒，观察P53蛋白表达水平。p53基因在细胞核内稳定表达，所以我要提取核蛋白。有的裂解液还有巯基乙醇和10％甘油。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
:):) 看出来了看一下资料版的全细胞裂解液吧，如果要定量可以用那里的方法。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
不知道是不是真的，我也急着做核蛋白的WB，真的能做得出来？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
xddu wrote:我看到有人加了10％甘油，不知道起什么作用。 甘油有稳定蛋白的作用
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请教组织中提取核蛋白的方法
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我是应用梁国栋编的 最新分子生物学实验技术 （细胞的方法）请告知组织提取核蛋白的方法 万分感谢！！！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园准中级站友
我用的是这种方法：提取效率还是可以的：Buffer A：
HEPES (pH 7.9)
10mMBuffer C:
HEPES pH 7.9
25%,v/v用前加入0.5ul 1M的DTT，2ul 100mM的PMSF以及在每ml Buffer中加入10ul 蛋白酶抑制剂。100 mM PMSF：174.2mg PMSF+10ml 水步骤为：1．
用冷D-PBS洗两次细胞2．
刮除细胞入1ml D-PBS中3．
离心细胞3000rpm，5分钟4．
用400ul Buffer A重悬细胞，并上肿胀细胞10分钟，vortex10秒5．
1000rpm离心10秒，弃上清6．
12000rpm离心5分钟，弃上清7．
重悬细胞在50-100ul Buffer C中，置于冰上20分钟8．
12000rpm离心5分钟，转移上清于另一EP管中9．
定蛋白，分装于-70℃保存0.5M EDTA1M 碳酸钠：3.277g+ 20ml H2OBuffer A: HEPES (pH 7.9)
0.15ml1M KCl
100mlBuffer B
HEPES (pH 7.9)
(10mM) EDTA
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
细胞裂解后只是低温操作而没有蛋白酶抑制剂应该是不可以的，其中的变性步骤使蛋白酶失活，因此只要变性之前的那些步骤所需的时间不长，应该不会有什么大问题。我们实验室做western blotting的使用的蛋白酶抑制剂是EDTA和PMSF，提的蛋白放置个把月也可以用。我的实验中提的蛋白需要尽量防止蛋白质变性，因此用的蛋白酶抑制剂除了EDTA和PMSF还有leupeptin、pepstatin A。即使是这样，这些蛋白还得提了马上做后续的实验，我试过，把提的蛋白一部分马上用，另外一部分保存在4℃的冰箱里第二天再用，马上用的得到了较好的结果，第二天用的就不好了。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
丁香园准中级站友
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
Buffer 中MgCl2 起什么作用？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
谢谢指教！！！！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
mtpu Buffer 中MgCl2 起什么作用？MgCl2 的主要作用是保护细胞核的完整性，但浓度过高会造成核的聚集。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
我们实验室的经验是必须加蛋白酶抑制剂，但是有人不加是因为已经提前加到裂解缓冲液中了，还有提取胞核蛋白的话可以使用胞浆胞核抽提蛋白试剂盒
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请问 buffer c中的甘油占总体积的25%么 也就是说如果是100ml液体 buffer c应为25ml？？？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
可以考虑使用专门提取核蛋白的试剂盒。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
中帜-吴 edited on
我觉得还是用试剂盒的比较方便，效果应该也不错的！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
试剂盒国产的哪家好用啊 ？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园关注今日：18 | 主题：396391
微信扫一扫
扫一扫，下载丁香园 App
即送15丁当
（求助）细胞裂解液能保存多久？
页码直达：
这个帖子发布于11年零338天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
细胞裂解液4度能保存多久？另外，用细胞裂解液冰上裂解20min，4度17000g离心30min，只有一点点沉淀，吸上清时发现还是和离心前一样粘稠，是怎么回事啊？请赐教!
不知道邀请谁？试试他们
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
收起全部有料回复
apple668 请问剑气如虹 ：为什么要这么高的转速？不会把膜蛋白沉淀掉吗？（因为我要做WB的蛋白是膜蛋白，我想有胞浆蛋白在也不会有多少影响，所以就只用了1000g离心去上清，您看这样行吗？）你的问题提得很好。如果你的目的蛋白是胞浆蛋白，也就是可溶性蛋白，那么要求高转速离心，而且尽量不要吸沉淀防止杂蛋白污染和电泳条带发生拖尾现象。如果你要的是膜蛋白，正好相反，不用那么高的转速，而且你的目的蛋白是在沉淀中。RIPA裂解液只适合可溶性蛋白的提取，因此你用RIPA想提取膜蛋白，在沉淀中是没有裂解出来的膜蛋白的，要用专门的膜蛋白提取配方！建议在发帖之前先搜索一下园子里的贴子，看看有没有别人问同样的问题，这样可以节省你我共同的宝贵时间。以下是以前战友发的相关帖子，希望对你有帮助。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
剑气如虹 edited on
apple668 谢谢剑气如虹，我就是因为看了太多，各式各样的才很困惑。你的话点醒了我，也就是说加入可溶性蛋白裂解液后，把膜蛋白溶解了，膜蛋白在上清里，多少转都没关系，取上清就行。如果加入的不是RIPA此类能溶解膜蛋白的裂解液，就要用差速离心，超速离心后膜蛋白在沉淀里，取沉淀就行。请问是这么理解吗？不是的。膜蛋白的提取有专门的配方和操作步骤，和可溶性胞浆蛋白的提取是不同的。4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。所以，我们这个时候弃上清，取沉淀，才能得到膜蛋白。NP-40, Tween-20, TritonX-100都是非离子去垢剂，和离子去垢剂SDS、脱氧胆酸钠等都用于溶解细胞膜。RIPA缓冲体系能使细胞内大部分蛋白释放，但也能破环一部分蛋白质-蛋白质之间相互作用。 膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS，Emulgen和Lubrol等表面活性剂。以下是网上分离膜蛋白的方法汇总：1 先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。2 用特殊的去污剂选择性的分离。 从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题.如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如 triton X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂.将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（&5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。3 膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。层析柱提取
（参步骤）4 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。你可以仔细看看下面两个页面关于膜蛋白提取原理和方法的介绍。:)
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
剑气如虹 edited on
写出具体配方！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
RIPA配方：0.1%SDS1%NP-400.5%去氧胆酸钠1mmol/L偏钒酸钠5mmol/LEDTA1XPBS
使用前加PMSF
4度能保存多久？
另外，用细胞裂解液冰上裂解20min，4度17000g离心30min，只有一点点沉淀，吸上清时发现还是和离心前一样粘稠，是怎么回事啊？之前同样做法已提出蛋白的。请赐教!
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
你的RIPA配方我看了，4度能保存3个月应该没问题。其实你可以买成品，省得自己配麻烦。许多试剂公司都有的卖。裂解细胞的染色体DNA使溶解物粘稠。你有没有试过超声破碎？打断DNA那样就不会粘稠了。你裂解的是细胞么？沉淀很少没关系，只要跑SDS－PAGE有清晰的条带就行阿。如果是组织，沉淀不会少的。一般组织：裂解液＝1：5。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
剑气如虹 edited on
我们这以前自己配的RIPA现在都快一年了，虽然出了些沉淀，不过还是能用。。。呵呵，有条件还是买成品吧~~~自己配也省不了多少钱的~~
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
请问你离心17000g，蛋白是在上清里还是在沉淀里？我今天做了一下，才1000g，就有好多沉淀了。蛋白好像在上清里
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
剑气如虹兄：非常感谢你的指点！RIPA我是买上海申能博彩的，裂解的是细胞，没有超声破碎的设备。不知细胞种类不同有无差别？蛋白在上清里
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
只要是贴壁培养的细胞，细胞种类不同应该没有差别的。只要细胞长满瓶，用胰酶消化然后RIPA提取蛋白，SDS－PAGE的话，量足够了。提取过程中肯定存在蛋白丢失，但是不至于电泳条带什么都没有的。顺便给你一个我抄的别人的RIPA裂解细胞的配方：PBS洗细胞，用刮子刮下细胞或者用胰酶消化，1000转离心5分钟，倒掉PBS，将细胞转移到EP管中，加RIPA裂解液，吹打均匀，4度冰箱20分钟。1000g（3000多转）离心20分钟，收集上清，加上样缓冲液，100度煮沸10分钟，离心取上清，SDS－PAGE电泳（我一般都是80／120V电压）。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
剑气如虹 edited on
请问剑气如虹 ：为什么要这么高的转速？不会把膜蛋白沉淀掉吗？（因为我要做WB的蛋白是膜蛋白，我想有胞浆蛋白在也不会有多少影响，所以就只用了1000g离心去上清，您看这样行吗？）
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
apple668 请问剑气如虹 ：为什么要这么高的转速？不会把膜蛋白沉淀掉吗？（因为我要做WB的蛋白是膜蛋白，我想有胞浆蛋白在也不会有多少影响，所以就只用了1000g离心去上清，您看这样行吗？）你的问题提得很好。如果你的目的蛋白是胞浆蛋白，也就是可溶性蛋白，那么要求高转速离心，而且尽量不要吸沉淀防止杂蛋白污染和电泳条带发生拖尾现象。如果你要的是膜蛋白，正好相反，不用那么高的转速，而且你的目的蛋白是在沉淀中。RIPA裂解液只适合可溶性蛋白的提取，因此你用RIPA想提取膜蛋白，在沉淀中是没有裂解出来的膜蛋白的，要用专门的膜蛋白提取配方！建议在发帖之前先搜索一下园子里的贴子，看看有没有别人问同样的问题，这样可以节省你我共同的宝贵时间。以下是以前战友发的相关帖子，希望对你有帮助。
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
剑气如虹 edited on
谢谢剑气如虹，我就是因为看了太多，各式各样的才很困惑。你的话点醒了我，也就是说加入可溶性蛋白裂解液后，把膜蛋白溶解了，膜蛋白在上清里，多少转都没关系，取上清就行。如果加入的不是RIPA此类能溶解膜蛋白的裂解液，就要用差速离心，超速离心后膜蛋白在沉淀里，取沉淀就行。请问是这么理解吗？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
apple668 谢谢剑气如虹，我就是因为看了太多，各式各样的才很困惑。你的话点醒了我，也就是说加入可溶性蛋白裂解液后，把膜蛋白溶解了，膜蛋白在上清里，多少转都没关系，取上清就行。如果加入的不是RIPA此类能溶解膜蛋白的裂解液，就要用差速离心，超速离心后膜蛋白在沉淀里，取沉淀就行。请问是这么理解吗？不是的。膜蛋白的提取有专门的配方和操作步骤，和可溶性胞浆蛋白的提取是不同的。4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。所以，我们这个时候弃上清，取沉淀，才能得到膜蛋白。NP-40, Tween-20, TritonX-100都是非离子去垢剂，和离子去垢剂SDS、脱氧胆酸钠等都用于溶解细胞膜。RIPA缓冲体系能使细胞内大部分蛋白释放，但也能破环一部分蛋白质-蛋白质之间相互作用。 膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从膜中释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常用的有胆酸盐，CHAPS，Emulgen和Lubrol等表面活性剂。以下是网上分离膜蛋白的方法汇总：1 先分离膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆法、自溶法和酶处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。2 用特殊的去污剂选择性的分离。 从膜上提取蛋白有许多困难.在多数情况下，都是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，然后将蛋白质稳定.去垢剂的选择通常是依据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的纯化步骤.虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，但最终仍可能需要除去去垢剂.这常常会引起蛋白质失活，但如果蛋白质是用于测序的，他将不是一个问题.如果不是用于测序的，可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠.许多文献和生化试剂供应商的产品目录中，都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋白的去垢剂.然而，他们并不是普遍适用的.在设计膜蛋白溶解方案时，必须考虑某一去垢剂的特殊性质.如 triton X-100在280nm处有吸收，如果某蛋白质的测试与280nm处的吸收有关，就应避免使用这类去垢剂.将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，再进一步从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶下来.这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，而无需考虑胞质蛋白、细胞核成分或染色质成分的混入.使用这种方法所获得的膜蛋白，无论在种类上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（&5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白总量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，无疑对于研究膜蛋白的结构和功能都是非常重要的. 第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般的都是利用4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，在温度超过20度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。利用此性质可提取膜蛋白。3 膜蛋白色谱(Chromatography of Membrane Protein,CMP)CMP+分离强疏水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。层析柱提取
（参步骤）4 顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进行抽提的方法。用Tris碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用标准液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前两次抽提后不能溶解的膜蛋白。你可以仔细看看下面两个页面关于膜蛋白提取原理和方法的介绍。:)
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
剑气如虹 edited on
十分感谢！
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
刀剑无声伴落花　　落花如雨剑气如虹大侠风范！佩服佩服！我也想请教一个问题：　我想测我培养的细胞有无分泌酪蛋白，想用细胞的裂解液做为培养上清和空白培养液的对照，作琼脂扩散或western　blotting分析，我该用什么裂解液呢？　我也有看一些关于裂解的文章，他们提到直接用裂解液作用与贴壁的细胞，充分吹打后离心取上清用于实验，不是比刮细胞更方便吗？这是不是由于所用裂解液的不同，所以其方法也不同呢？
微信扫一扫
广告宣传推广
政治敏感、违法虚假信息
恶意灌水、重复发帖
违规侵权、站友争执
附件异常、链接失效
关于丁香园