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串联质谱联合气相色谱-质谱检测遗传性代谢病
中华医学杂志，)：串联质谱联合气相色谱-质谱检测遗传性代谢病韩连书& 叶军& 邱文娟& 高晓岚& 王瑜& 金晶& 顾学范[摘要] &目的& 应用串联质谱检测干血滤纸片中的氨基酸和酰基肉碱谱，联合气相色谱-质谱技术检测尿液中有机酸谱，对性代谢病进行筛查和诊断。 方法& 留取4981例临床疑似遗传性代谢病儿童的干血滤纸片、尿或尿滤纸片，利用串联质谱仪检测血中氨基酸和酰基肉碱，利用气相色谱-质谱仪检测尿中有机酸，部分患儿结合相关酶活性测定及基因突变分析进行诊断。结果& 在4981例患儿中共诊断319例(6.4%)24种遗传代谢病，其中氨基酸代谢病155例（48.6％），8种疾病；有机酸血症150例（47.0％），10种疾病；脂肪酸b氧化代谢病14例（4.4％），6种疾病。结论 串联质谱对氨基酸和脂肪酸代谢病的诊断具有特异性，气相色谱-质谱对有机酸血症的诊断具有特异性，部分氨基酸代谢病需要这2种技术联合应用才能诊断。[关键词] &串联质谱；气相色谱-质谱；遗传性代谢病；氨基酸；酰基肉碱Diagnosis of inborn errors of metabolism using tandem mass spectrometry and gas chromatography mass spectrometry& HAN Lian-shu, YE Jun, QIU Wen-juan, GAO Xiao-lan, WANG Yu, JIN Jing, GU Xue-fan.& Department of Pediatric Endocrinology and Genetic Metabolism, Shanghai Institute for Pediatric Research, Xinhua Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200092, ChinaCorresponding author: GU Xue-fan, Email: guxuefan@[Abstract] Objective &To investigate the effects of tandem mass spectrometry (MS/MS) combined with gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) in the diagnosis of inborn errors of metabolism in children. Methods Amino acids and acylcarnitines in the dry blood filter papers were tested by MS/MS, and the organic acid profiles in urea were tested by GC-MS among 4981 children suspected to be with inborn errors of metabolism from more than 100 hospitals in China. A few pediatric patients underwent analysis of activity of enzyme and gene mutation analysis too. Results 319 of the 4981 children (6.4%) were diagnosed as with 24 kinds of diseases: 155 of the 319 cases (48.9%) with 8 kinds of amino acid diseases (97 &with hyperphenylalaninemia, 14 with maple syrup urine disease 13 with ornithine transcarbamylase deficiency, 13 with citrullinemia type II, 5 with citrullinemia type I, 10 with tyrosinemia type I, 2 with homocystinuria, and 1 with arginasemia); 150 of the 319 cases (47.0%) were diagnosed as with 10 kinds of organic acidemias (81 with methylmalonic acidemia, 17 with propionic acidemia, 17 with multiple CoA carboxylase deficiency, 11 with glutaric acidemia type I, 8 with isovaleric acidemia, 6 with b-keto thiolase deficiency, 5 with 3-methylcrotonyl-CoA carboxylase deficiency, and 3 with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase deficiency); 14 cases (4.4%) were diagnosed as with 6 kinds of fatty acid disorders (5 with medium chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, 3 with very long chain acyl CoA dehydrogenase deficiency, 2 with short chain acyl-CoA dehydrogenase deficiency, 2 with multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency, 1 with carnitine palmitoyl transferase type II, and 1 with carnitine palmitoyl transferase type I). Conclusion MS/MS is specific for amino acid diseases and fatty acid disorders. GC-MS is specific for detect organic acidemias. And the diagnoses of part of amino acid diseases need the combination of both methods.&[Key words] Tand Gas chromatography mass spectrometry；Inborn
A Acylcarnitine遗传性代谢病包括氨基酸、有机酸、脂肪酸和糖代谢异常及溶酶体贮积病等。既往由于检测方法的限制，使这类遗传性代谢病患儿不能够得到及时确诊，认为是“罕见”的疾病。近年来国际上开展的串联质谱技术(tandem mass spectrometry, MS/MS)，能够检测干血滤纸片中的氨基酸谱和酰基肉碱谱，为临床诊断氨基酸、有机酸和脂肪酸代谢性疾病的诊断提供了技术支持，结合气相色谱-质谱（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）尿有机酸检测，使诊断更加可靠，推动了遗传性代谢病的筛查、诊断和治疗[1-2]。上海交通大学医学院附属新华医院内分泌、遗传代谢病研究室于2002年在中国大陆率先建立了串联质谱技术用于遗传代谢病的筛查和诊断[3]，并于2005年建立了气相色谱-质谱尿有机酸检测技术，至2007年10月，共检测来自全国100多家医院4981例患儿，现将结果分析报道如下。对象与方法一、对象来自全国各地100余所医院的疑似遗传性代谢病高危儿童4981例，主要来自属于三级甲等医院的儿童医院或儿科（包括澳门仁伯爵和镜湖医院），其中男3206例，女1775例，年龄中位值1.1岁(1 d～18岁)。临床表现包括反复呕吐、、昏迷、生长发育迟缓、智力落后、肌张力异常、、肝脾肿大等。实验室检查提示代谢性酸中毒、低血糖、高血氨、高乳酸血症、高苯丙氨酸血症和尿酮体阳性等。标本采集用干血滤纸片法，手指采血，滴于专用采血滤纸上，凉干后送检。尿为新鲜尿或尿滤纸片。所有检测均经过本院伦理委员会批准并取得家长的知情同意。二、方法1.串联质谱检测方法：串联质谱检测干血滤纸片中酰基肉碱和氨基酸的方法参考文献[3,4]报道的方法，干血滤纸片经含酰基肉碱和氨基酸内标的甲醇萃取，盐酸正丁醇衍生后，利用串联质谱进行检测。2.气相色谱-质谱检测方法：气相色谱-质谱尿有机酸检测方法参考文献[5]报道的方法，尿样经尿素酶、盐酸羟铵、氢氧化钠和盐酸处理，除去尿素及蛋白质，并加入17烷酸作为内标，用乙酸乙酯两次萃取，再用双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷混合物进行甲基硅烷化衍生后，进行气相色谱-质谱检测。3.疾病诊断：疾病的诊断主要依据各种疾病的发病机制，由串联质谱和气相色谱-质谱检测的相应特异指标，参考文献报道进行判断[6-8]，结合临床表现、常规的实验室检查及相应的治疗效果进行综合诊断。串联质谱检测正常上、下限值分别取10 000例足月新生儿和1000例健康儿童的第99.5百分位和0.005百分位值，正常上限值为正常均值的2～5倍，并结合文献报道[8-10]及确诊患者的检测值进行确定。部分患儿进行了酶活性测定、基因突变分析予以确诊。三、统计学方法由于患者的检测结果非正态分布，具体检测值用中位数(M)表示，结果比较用SPSS软件进行秩和检验。结&&& 果一、检测结果及临床资料分析在4981例患儿中，串联质谱检测阳性1323例（26.6％），复查 462例，诊断319例（6.4%）共24种疾病，其中氨基酸代谢病8种155例（48.6％），有机酸血症10种150例（47.0％），脂肪酸b氧化代谢病6种14例（5.4％）。男204例，女115例，年龄中位数为1.0岁（1天~15岁）。对其中临床资料相对齐全的170例患儿进行分析，发病年龄1岁以内155例（91.7％），但1岁内确诊者仅104例（67.1％），发病至确诊间隔时间平均1.1年。临床资料分析显示：运动发育落后（70例，41.2％）、智力落后（69例，40.6％）、（55例，32.4％）和肌张力低下（56例，32.9％）较常见。除上述异常外，部分疾病具有相对特异性表现，如高苯丙氨酸血症患儿均有智力低下、头发黄和皮肤色素减少。酪氨酸血症患儿表现为、肝脏肿大、肝功能异常及甲胎蛋白显著增高。瓜氨酸血症1型表现为嗜睡或昏迷，血氨显著增高。瓜氨酸血症2型患儿类似于酪氨酸血症表现，同时伴有胆汁酸显著增高，血氨轻度增高。有机酸血症患者除多种羧化酶缺乏症外无特异性表现，以酸中毒和神经系统损害表现为主。多种羧化酶缺乏症患儿多伴有严重的皮疹、眼角、口角及肛周糜烂。常规实验室检测以酸中毒(74例43.5%)、高乳酸血症（74例，43.2％）和尿酮体阳性(45例，26.5%)为主，头颅CT或核磁共振检查表现为不同形式的脑损害。脂肪酸b氧化代谢病患儿主要为进行性的肌张力减退、行走、语言功能倒退、嗜睡或昏迷等，实验室检查肌酸激酶增高为其特点。二、氨基酸代谢病患儿串联质谱及气相色谱-质谱检测结果氨基酸代谢病患儿检测结果见表1，高苯丙氨酸血症最多见，其次为枫和鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症。瓜氨酸血症-I型和瓜氨酸血症-II型均表现为瓜氨酸增高，但瓜氨酸血症-I型高于瓜氨酸血症-II型，差异有统计学意义（z=-2.262, P=0.024），另外，瓜氨酸血症-II型伴甲硫氨酸增高。三、有机酸血症患儿串联质谱及气相色谱-质谱检测结果有机酸血症患儿检测结果见表2，甲基丙二酸血症（Methylmalonic Acidemias，MMA）最多见，其次为丙酸血症（Propionic Acidemia，PA)和多种羧化酶缺乏症。串联质谱检测MMA和PA均表现为丙酰肉碱(propionylcarnitine, C3)增高，两者比较PA高于MMA，差异显著(z=-3.503, P&0.01)。另外，PA患者伴甘氨酸增高，MMA患者甘氨酸浓度在正常范围（251.4 mmol/L），差异显著(z=-6.298, P&& i=&&&0.01)。有16例MMA患儿因营养不良，C3低于上限值，依据C3/游离肉碱或C3/乙酰肉碱比值增高诊断为MMA。表现为3-羟基-异戊酰肉碱增高的疾病检测到4种（多种羧化酶缺乏症、3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶缺乏症、3-羟-3-甲基戊二酸尿症和b-酮硫解酶缺乏症），其中部分多种羧化酶缺乏症患者伴C3增高，b-酮硫解酶缺乏症患者伴异戊烯酰基肉碱增高，这4种疾病尿气相色谱-质谱有机酸检测表现为不同的有机酸增高，可进行鉴别，具体异常参数见表2。四、脂肪酸b氧化代谢病患儿串联质谱检测结果脂肪酸b氧化代谢病患儿检测结果见表3。脂肪酸氧化代谢病相对氨基酸或有机酸代谢病少见。肉碱棕榈酰转移酶II缺乏症以棕榈酰肉碱增高为主，短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症以丁酰肉碱增高为主，中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症以辛酰肉碱增高为主，极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症以肉豆蔻烯酰肉碱和肉豆蔻酰肉碱增高为主。尿气相色谱-质谱有机酸检测短链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症患者显示乙基丙二酸增高，其他疾病患者表现为多种二羧酸增高。讨&&& 论串联质谱技术通过检测样品中物质的质荷比（相对分子质量），对物质进行定性和定量分析，可同时检测一滴血中70余种氨基酸和酰基肉碱，对30余种氨基酸、有机酸和脂肪酸氧化代谢病进行快速的筛查和诊断。目前已有许多国家利用串联质谱进行新生儿筛查及临床疑似患者检测，使相关疾病的患病率显著增加[7-8,10-13]。气相色谱-质谱技术主要通过检测尿液中有机酸对氨基酸和有机酸代谢病进行诊断。氨基酸代谢病主要是由于氨基酸代谢途径受阻导致体内相应氨基酸水平的增高或降低，其旁路代谢产物有机酸相应增加。串联质谱通过检测血滤纸片中氨基酸水平及相关氨基酸之间的比值对氨基酸代谢病进行检测。气相色谱-质谱则检测患者尿中有机酸辅助诊断。串联质谱对高苯丙氨酸血症、枫、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、瓜氨酸血症和精氨酸血症的检测具有特异性。由于氨甲酰磷酸合成酶缺乏症和鸟氨酸氨甲酰转移酶缺乏症(OTCD)均表现为瓜氨酸降低，故对于串联质谱检测血瓜氨酸降低需者，结合气相色谱-质谱检测尿乳清酸和尿嘧啶水平进行鉴别，升高者为OTCD，正常者为氨甲酰磷酸合成酶缺乏症。酪氨酸血症有3种类型，串联质谱均表现为酪氨酸增高，气相色谱-质谱检测琥珀酸丙酮、4-羟基苯丙酮酸、4-羟基苯乳酸增高者为I型,仅4-羟基苯丙酮酸和4-羟基苯乳酸增高者为II型或III型。不同的有机酸血症患者尿中相应的有机酸水平大量增加，气相色谱-质谱通过检测尿有机酸水平进行有机酸血症的检测。酰基肉碱是有机酸代谢的中间体，串联质谱通过检测血酰基肉碱水平对有机酸血症进行检测，由于不同的有机酸血症可表现为同一种酰基肉碱的增高，所以串联质谱检测有机酸血症不如气相色谱-质谱特异性高。在有机酸血症中MMA最常见，与其他国家报到的一致[14,15]。与有机酸血症类似，酰基肉碱是脂肪酸氧化代谢的中间体，故通过检测血游离肉碱和不同长度碳链的酰基肉碱水平可对脂肪酸氧化代谢病进行检测。脂肪酸b氧化受阻后，w氧化途径增强，故尿中出现二羧酸尿，但不具特异性。脂肪酸b氧化代谢病在欧美国家的患病率较高,中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症最多见，在高加索人群中的患病率达1:8 100~1:20 000[16]。本研究仅检测到14例，提示脂肪酸b氧化代谢病在中国较少见。临床资料分析结果表明除少数氨基酸疾病外，大部分氨基酸、有机酸和脂肪酸b氧化代谢病缺乏特异的临床症状和体征，新生儿期以喂养困难、呕吐、嗜睡、昏迷和为主，婴幼儿以运动发育落后、智力落后、、肌张力低下和反复呕吐较常见。常规实验室检查以酸中度、高血氨、乳酸增高和低血糖常见。故当遇到上述临床表现原因不明的患儿，应考虑到遗传性代谢病的可能，留取血样或尿样进行氨基酸、酰基肉碱和有机酸分析特异性检测，以免延误诊治。Dott等[17]利用串联质谱通过对793例3岁前不明原因死亡的患儿干血滤纸检测，8例确诊为脂肪酸b氧化代谢病和有机酸血症，本研究中26例(12.3%)患儿因病情较重，在明确诊断后不久死亡，进一步说明这些疾病及早诊断的重要性。综上所述，串联质谱联合气相色谱-质谱技术可以对氨基酸、有机酸和脂肪酸b氧化代谢病进行筛查和诊断，能够同时检测30余种遗传代谢病。至于首选那种方法，若临床表现疑似氨基酸代谢病，首选串联质谱检测；若临床表现为不明原因的酸中毒，疑似有机酸血症，首选气相色谱-质谱检测；若临床表现为肝脏肿大、肌酸激酶增高、肌无力或心肌肥厚，疑似脂肪酸代谢病，首选串联质谱检测；对难以判断的患者，为缩短患者检测等候时间，节省等候期间的住院或其他费用，可同时进行2种方法的检测。
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(除本人门诊患者外甲状腺疾病，糖尿病不再提供咨询，不代查化验结果)
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气相色谱质谱联用仪的工作原理
　　目前，在分析仪器中，色谱仪器具有重要地位。由于色谱仪的色谱柱具有高效的分离能力，把物质按保留时间大小进行分离，然后通过与标样保留时间进行对比的方法确定物质性质，因此对未知样品很难定性分析。而质谱仪是直接测定物质的质量数与电荷的比值（m/z）在定性分析方面既准确又快速。把色谱与质谱联合起来使用，气相色谱质谱联用仪气相色谱质谱联用仪型式试验实际上是把质谱仪作为色谱仪的一个通用检测器来使用。　　　　色谱仪有很多检测器，如TCD、FID、ECD、FPD、NPD等，每种检测器只有一定限度的适用范围，不能通用，造成使用不便。而质谱仪作为质量检测器可以取代色谱仪的多种检测器，通用性强，使用极其方便。所以说气相色谱质谱联用仪把色谱的高效分离作用与质谱计对未知样品的准确鉴别能力相结合，把分析仪器提高到一个新水平，凡是能使用色谱仪的地方，均可以使用色&质联用仪器。目前，国际上公认，色&质联用仪器在当前仪器分析中占有非常突出的地位。气相色谱质谱联用仪是色谱技术、质谱技术与计算机技术三种现代化技术紧密结合的产物。由于技术难度大，我国一直不能生产，每年要花大量外汇进口，据统计，2005年我国进口的各种色&质联用仪约600台。　　　　每台平均售价60~100万人民币。公司自行研制开发成功气相色谱质谱联用仪。这是我国第一台商品化色&质联用仪器，各项技术指标接近于当前国际先进技术水平。　　　　气相色谱质谱联用仪应用范围1、凡是需要气相色谱仪进行检测的场合，特别是对未知样品进行定性分析的地方2、应对各种突发事件，如有害物质泄漏、重大环境灾害等3、反恐斗争、禁毒缉毒、爆炸物品分析等气相色谱质谱联用仪基本工作原理为了质谱仪器的正常工作，必须要组成高真空系统的真空室。仪器使用了高性能的涡轮分子泵与前级真空泵构成两级真空机组以确保所需的真空。被分析样品经毛细管柱分离，进入离子源。采用电子电力标准配置（EI），产生正离子，在推斥、聚焦、引出电极的作用下将正离子送入四极杆系统。四极杆在高频电压与正负电压联合作用下形成高频电场，在扫描电压作用下，只有符合四极场运动方程的离子才能通过四极杆对称中心到达离子检测器，再经离子流放大器放大，产生质谱信号。得到了质谱图，通过解释谱图或进行谱库检索以识别未知样品的组成。
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