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以苯或甲苯及三个碳以下的有机物为原料，合成下列化合物：
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以苯或甲苯及三个碳以下的有机物为原料，合成下列化合物：
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1写出乙胺、二乙胺、苯胺、N-甲苯胺与乙酐反应的生成产物的构造式。2分子式为C7H7NO2的化合物A，A与Sn+HCl反应，生成分子式为C7H9N的化合物B，B和NaNO2+HCl在0℃下反应，生成分子式为C7H7ClN2的一种盐C；在稀盐酸中C与CuCN(或KCN)反应，生成分子式为C8H7N的化合物D；D在稀盐酸中水解得分子式C8H8O2的有机酸E；E用KMnO4氧化得到另一种酸F；F受热时生成分子式C8H4O3的酸酐G。试写出化合物从A到G的构造式。3重氮和偶氮化合物分子中都含有(&&)官能团，其中(&&)官能团的一端与(&&)相连，另一端与(&&)相连的化合物叫做重氮化合物。&(&&)官能团两端与(&&)相连的化合物，叫做偶氮化合物。4写出下列化合物的结构式，并用中文命名。 (i)(S)-1-chloro-3-methylhexane (ii)(3R，5S)-3-bromo-5-methylheptane (iii)trans-1-chloro-4-chlommethylcyclohexane(iv)(2R，3S)-2-chloro-3-ethylhexane (v)ethyl-2-methylidene valerate (vi)acetonitrile (vii)N-methyl-N’-vinylbutanediamide (viii)propenenitrile (ix)heptanedioyl dichloride (x)glycol diacetate (xi)monoethyl oxalate (xii)3-benzoyloxypropionic acid (xiii)1-methoxy-4-(1-propenyl)bemene (xiv)1，2，3-triethoxypropane (xv)1-ethoxy-4-methoxybenzene (xvi)1-ethoxymethyl-4-methoxynaphthalene请帮忙给出正确答案和分析，谢谢！
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A.A中合成ATP的部位是在基粒类囊体薄膜上& B.B中的ATP用于还原三碳化合物? C.A、C中合成ATP所需的能量来源相同?&&&& &D.D中能量的去向是用于耗能的生命活动?
试题及解析
学段：高中 学科：生物 浏览：8
下图是绿色植物体内能量供应及利用的示意图，下列说法不正确的是（& ）
A.A中合成ATP的部位是在基粒类囊体薄膜上& B.B中的ATP用于还原三碳化合物?
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答案不给力由二氧化三碳单元制成的大环化合物的制作方法
专利名称由二氧化三碳单元制成的大环化合物的制作方法
技术领域本发明涉及具有生物调节活性的大环物质，它们的合成方法，以及从多种原料中分离它们的方法。本申请还描述了这些活性物质本身或与其它活性物质结合在酶调节和生物调节方面的应用。
背景技术生物化学过程的某些途径和生物免疫机理的最佳功能是由大量生物调节活性物质来保证的(Rompp Lexikon，《调节(Regulation)》，3826页)。从化学观点来看，至今所知的生物调节活性物质有肽类，碳水化合物，甾类化合物或脂类，而且这些结构单元可以同时出现(例如，糖肽，脂蛋白)。而且，生物调节活性物质在治疗一种或多种这些调节机理功能紊乱引起的疾病方面的应用是已知的。甾类荷尔蒙，皮质甾类和强心苷类，以及生长荷尔蒙或血凝固因子的治疗用途是这种情况许多实例中的几个。但是，采用这类物质的药物疗法常常伴有破坏性副作用，因此，其应用受到很大限制。这方面的细致研究详见Goodman和Gilman的《治疗的药理学基础(The PharmacologicalBasis of Therapeutics)》，第8版，New York，1991。例如，用强心苷，增强收缩力这样有用的治疗作用会伴有心脏中毒副作用，结果，治疗剂量必须非常严格地限制。作为其它例子可以提及皮质甾类的应用，但由于其一系列非常严重的副作用如肌病，骨质疏松，精神紊乱，感染的敏感性增加等，所以只建议在非常严重的情况下进行治疗使用，而且只能用有限的时间。
尽管在用免疫调节活性物质治疗免疫学引起的病症方面作出了很大努力，但以前的临床试验仍不能使人信服。这种免疫治疗应用的目的是要实现对自身免疫疾病如类风湿性关节炎和多发性硬化等疾病的根本性治疗，因为至今还没有发现根治的办法。根据E.Sercarz和S.K.Datta的“自身免疫性(Autoimmunity)”，《现代生物学(Current Biology)》，6，pp.875-881(1995)所述，这些自身免疫疾病几乎都是由免疫调节紊乱引起的。为了战胜这些以免疫系统相当脆弱为特征的严重病症如癌症或AIDS，以前的免疫调节物质的治疗作用收效甚微。
一些生物调节肽和蛋白质已经在M.J.Clemens的《细胞因子(Cytokines)》，Oxford 1991的专题著作中报道过其特征。在不同癌症，自身免疫疾病和病毒感染(包括AIDS)中起着重要作用的细胞因子已经被报道过多次。尽管如此，这些物质和其它生物调节蛋白和肽的广泛治疗应用仍缺乏向更大范围推广。其中原因之一某种程度上常常是因为非常费力的生产技术从只存在非常少量生物调节活性物质的人或动物组织液中提取然后纯化生物调节活性物质完全不适于提供治疗所需的量。用基因技术生产生物调节多肽或糖蛋白对于人类治疗意味着过敏性副作用和/或过敏反应(尽管它们很少出现)的相当冒险因素的危险仍然存在。几种“体外”高活性多肽因子的治疗应用的根本问题由事实证明它们在“体内”完全不同，几乎只有非常弱的活性。一方面，大量生理和酶的障碍妨碍了外部给药的肽和蛋白质到达病理作用发生部位(炎症的病灶，癌症的溃疡部位等)。另一方面，它们很快被内源性酶和那里存在的其它因素中和和代谢掉。用活性物质天然肽，糖肽和糖苷口服给药，事实证明经过几次降解过程这些物质对肠胃系统实际上是无效的。
但是，生物调节活性物质天然肽或糖肽相对快的降解过程也必须考虑到其“口服”传递。为了在病理作用发生或出现的部位如在炎症的病灶或在癌症的溃疡部位完全达到治疗有效的浓度，例如，已经采用了活性物质隐蔽传递的方式。R.Collier和D.Kaplan的《免疫毒素(Immuntoxine)》，Heidelburg 1988中对最终可能用来结合单克隆抗体(药物打靶)的毒素的用途已有类似的描述。但是，治疗技术仍然非常复杂，而且只能限制性地用于某些特定的情况。对于调节活性物质，生物可利用度不仅依赖于稳定性，而且依赖于纯物理过程如溶解性和膜的渗透性。这就要考虑使亲油物质在血浆中有水溶性或使亲水活性成分如Na+或K+离子有膜渗透性。例如，钾离子正常情况下不能渗透线粒体膜。大环抗生素如无活菌素或真菌霉素使其能透过相应离子的有机膜。
1967年(即发现“冠醚”的那年)以来已经生产出大量新的化合物，这些化合物具有大环结构，并形成了可能套住无机离子或较小分子的冠状或穴状结构。但是，这种隐蔽形成的大环物质的直接治疗应用的重要前提条件是低毒性和良好的生物同化作用，而这一点很难由合成的穴状配体试剂完成。
许多基本的生物调节机理是由所谓钠泵控制的。酶有将钠离子从细胞内泵送到细胞外部同时将钾离子向相反方向传送的能力。能量消耗是由三磷酸腺苷(ATP)的偶合水解传递的。该泵与被称作Na+，K+-ATP酶(ATPase)的酶一致，而且其分布无处不有。几种重要的细胞功能都受Na+，K+-ATP酶控制，如细胞体积，热量的产生，细胞内游离Ca2+离子浓度，神经元的传导，肌肉收缩或膜电位。
在大量免疫调节过程中一些重要的相也是由Na+，K+-ATP酶控制的，因此，钠泵在免疫调节中也起重要作用。尽管对这种酶的总体分布，意义和调节机理还不是很清楚。人们认为该酶的所谓“强心苷受体部位”是钠泵生物调节所在功能位置。几种植物中存在的强心苷以高亲和力连接在该部位，不仅发挥它们的强心剂作用，而且也有使心脏中毒。但是，它们的毒性证明它们与该酶的内源性配位体不一致。W.Schoner在《药物研究的进展(Progress in Drug Research)》，41，249-291(1993)上发表论文“内源性毛地黄类因子(Endogenousdigitalis-like factors)”称尽管已经作了大量的研究，但还不能建立这些内源性生物调节物质的化学性质和结构。至今，还没能从动物组织和体液中分离出充足数量的内源性因子来确定其准确的特性和结构。Na+，K+-ATP酶活性以及几种生物调节机理可由与这些内源性配位体一致或结构上相似的因子有效地控制。
近来，已经发现了几种参与生物调节过程的简单的无机物。但是，值得注意的是所有这些无机物仅被用作简单的信使物或效应物。它们主要缺乏发挥生物调节作用所必需的三维结构和与其偶合所需的结构特殊作用的能力。S.Snyder和D.Bredt在《美国科学(ScientificAmerican)》，1992(5)，22-29上发表论文“一氧化氮的生物作用”说这种气体化合物是控制非特定免疫反应的功能效应物。在有机体中，一氧化氮的寿命非常短，为的是发挥其定位和最大毒性作用，而且总是“当场”生成。如果免疫系统的吞噬细胞即所谓巨噬细胞被细菌毒素或细胞因子活化，数小时内它们可以产生相当大量的一氧化氮，因此这被用作免疫武器。假设更简单的气体化合物也参与生物调节过程，例如，已知乙烯是植物生物学中的重要因素。A.Verma在《科学(Science)》，259，381(1993)中发表论文称一氧化碳也参与鸟苷一磷酸(GMP)环化的生理调节过程。
迄今为止，很少有关其它碳氧化物生物作用的报道，关于C3O2的更是少得可怜。现在只知道这种化合物在室温是气体(bp 7℃)，它刺激粘膜，有芥末油和丙烯醛气味。二氧化三碳代表相当强的不可逆结血红蛋白的血液毒素；对于小鼠，干空气中C3O2浓度可以忍受的极限是0.2-0.4％。C3O2与水反应形成丙二酸。但是，如果没有痕量无机酸，该反应就不能进行得象前面所述的那样快。从一氧化碳这方面考虑，人们认为原始还原的地球大气中也含有大量C3O2。而且最近H.Huntress等人在《自然(Nature)》，352，316-318(1991)中提供了在星际空间可能存在C3O2的证据。但是，直到现在，还没有人提供在生物体液中可能存在C3O2的确凿证据。考虑到单体气体以及非晶态聚合物对水的敏感性，事先几乎已经排除了其可能具有生物作用。如果水反应性非晶态聚合物是简单无机化合物原始合成可能的原料的话，则可以认为H.Yanagawa和F.Egami在《前寒武纪研究(Precambrian Research)》，14，75(1981)中的假设基本上是可能的。
气态C3O2或多或少很快地变成由黄转深红棕色的非晶态聚合物。人们对这些聚合物结构的了解非常有限。总之，它们被描述为早期被命名为“红碳”的非均匀非晶态物质。二氧化三碳及其聚合物的化学性质见T.Kappe和E.Ziegler在《Agnew.Chem.》，86，529(1974)上发表的论文。聚合产物部分溶于水或稀碱液，形成深黄色到深棕色溶液。已经给这些非晶态不规则聚合物提出了几个理想方程式，但它们没有一个能用实验证明。由于概率最大的石墨类六方晶格结构被认为在周边是不饱和的，而且必须相应的不稳定。该假设在N.S.Smith和D.A.Young在《无机化学(Inorganic Chemistry)》，2，829(1963)上发表的论文中有详细的描述。
人们还知道，在血浆中还没有象发现螯合物那样发现什么生物高效物质。例如，甾类荷尔蒙在血浆中以它们的硫酸盐或葡糖醛酸盐螯合物形式存在，它们的降解产物也是降解成螯合物。这些螯合的甾类常常表现出比纯活性物质更好的治疗性能，正如US 2,565,115和US2,720,483所描述的螯合的雌激素甾类或硫酸脱氢表雄甾酮(DHEAS)。上述螯合作用调节这些甾类活性物质的生物可利用度和同化作用，同时可以解释改进的治疗性能。关于通过形成相应的螯合物来调节多肽活性物的生物可利用度我们知道的还相对较少。蛋白质与遍及在蛋白的酶螯合也有调节功能，如《生物化学科学的趋势(Trends Biochemical Sciences)》，15，195(1990)中所述。多肽物质的适当螯合可以使这些活性物在治疗应用方面有所突破。查找迟钝作用胰岛素是要提及的已知范例。已知添加锌盐或硫酸鱼精蛋白可以大大延长胰岛素的治疗作用时间。但是，这些添加物可以引起不同的副作用。很多发明者都试图提供能够确保延迟胰岛素释放的适当螯合物，但至今还未能实现。
本发明说明发明领域本发明的目的是提供具有生物调节活性的新大环物质，它们没有上述缺点并且使人们发现疾病对生物调节机理干扰。此外，该活性物能明显改善治疗效果和已知药物的生物可利用度。
本发明目的由权利要求1-39中39个特征实现。
图的简单说明附图说明
图1水中com-(C3O2)6的电离质谱。
图2com-(C3O2)6·(NH3)2和com-(C3O2)6·(NH3)6胺复合物的电喷质谱。
图3n＝558的com-(C3O2)n的多电荷单元的LC偶合电喷质谱。
图4com-(C3O2H)60和com-(C3O2H)72的MALDI质谱。
图5com-(C3O2)10的KBr粒的红外光谱。
图6水中com-(C3O2)6的UV-VIS吸收谱。
图7活性物混合物的HP胶渗透色谱和柱的分子量标准曲线。
结构说明本发明物质是通过环齐聚合作用从简单无机二氧化三碳C3O2建立起框架结构的化学化合物。虽然二氧化三碳O＝C＝C＝C＝O本身和由它形成的非晶态聚合物是已知的反应性水敏感性物质，但发明者还是惊讶地获得了特别的水稳定性环齐聚物二氧化三碳的结构。它们的水稳定性的基本前提条件是这些结构中不再含有二氧化三碳反应性积累的C＝C和C＝O双键。这可以根据本发明解决，使得几个，优选4，6，8或10个二氧化三碳分子被环化成缩合的4-吡喃酮或2-吡喃酮环，并且，这些结构还以双株大环紧密相连。
本质上这些结构不是由环齐聚二氧化三碳构成的，而且不是有机化合物。可以认为这些结构及其二氧化三碳属于无机化学范畴。
与大环紧密相连的环齐聚物二氧化三碳的结构的化学式如下com-(C3O2)n其中n代表C3O2环齐聚合作用的度，com表示上述连接这些单元的具体的环齐聚物和大环(cyclooligomeric andmacroring)。
另外，发明者发现，在与大环紧密相连的环齐聚物的无数原则上可能的结构中，只有很少几个n值是特别稳定的。这些环齐聚物大环结构中优选n等于4，6或10，或者在式com-(C3O2)n中n是4，6或10的倍数。
具有较大优选n值的本发明活性物质也可以认为是多个较小的式com-(C3O2)n环齐聚物二氧化三碳单元的集合。这里定义的由二氧化三碳构成的一系列环齐聚物和大环的第一个成员有下面详述的非常重要的性质环六聚物二氧化三碳com-(C3O2)6用质谱仪实验测定的摩尔质量M＝408.19对应于式C18O12，同时对应于二氧化三碳摩尔质量M＝68.032的六倍。至于结构，几种可能的异构体是可以想象的，例如，缩合的2-吡喃酮环或头对头缩合的4-吡喃酮环，或下面指出的有6种变化形式的头对尾缩合的4-吡喃酮环结构，提出该假设最大的可能性是基于谱和其它性质。
推测实际的电子分布位于这里用PYRON(吡喃酮)和PYRYLIUM(吡喃鎓)表示的有限结构之间，但可以使溶剂和介质依赖其它或多或少极化的互变异构电子结构。羟基-吡喃和吡喃鎓盐衍生物一些通式为(C3O2)6·H1-6的环六聚物二氧化三碳的还原衍生物可以在质谱中见到(图1)。在水溶液中本发明活性物质还可以羟基-吡喃衍生物形式存在。由添加几倍的氢形成的还原的羟基-吡喃衍生物的通式为com-(C3O2)n·Hm其中，键合氢原子的数量m受环外氧原子数量n的限制，即m≤n。
如果完全还原的羟基-吡喃衍生物为式com-(C3O2)6环六聚物其摩尔质量M＝414.24，对形成无机和有机衍生物特别重要，而且，与com-(C3O2)6一起是形成自缔合物和不同衍生物的环六聚物中的基本单元。假设的环六聚物二氧化三碳com-(C3O2)6的4-羟基-吡喃结构如下
总之，强离子试剂象酸或碱以及几种容易离解的盐的存在使人们认为可以形成有阴离子An和阳离子Ka的吡喃鎓盐化合物。由本发明活性物质与酸，碱和通式Ka·An的盐化合物形成吡喃鎓盐衍生物的化学式是com-(C3O2)n·KanAnn其中Ka和An是阳离子和阴离子平衡离子，这些离子中和吡喃鎓结构上的2n个两性电荷。吡喃鎓盐化合物的结构可以表示如下，其中平衡离子不一定位于水溶液中。
阴离子An和阳离子Ka平衡离子可以下列形式存在-单个和均一的无机或有机阳离子和阴离子，例如，所有Ka＝Na+和所有An＝Cl-，-无机或有机阳离子和阴离子的混合物，例如，相互关系对应于这些离子的生理浓度，或-本身含有平衡离子如氨基酸，甜菜碱，离子皂的两性离子化合物。
在水中，本发明活性物质的吡喃鎓盐衍生物几乎完全溶解。具有阴离子如硫酸盐的氯化物的吡喃鎓盐在丙酮或乙醇中的溶解性较低，但也可用于本发明所述活性物质的分离。在生理流体中活性物质的两性电荷被那里存在的阴离子和阳离子中和。因此，平衡离子的统计分布比某些离子的化学统一的盐化合物更适合所说情况。
与金属离子，优选过渡金属离子如Fe(III)，Sb(III)，Cd(II)，Pt(II)，Au(III)，Pb(IV)形成的某些复合物可用于本发明化学物质的分离和检测。与复合无机或有机阴离子如SCN-，BF4-，Cr2O72-，MnO4-，苦味酸根，雷纳克酸根形成的化合物也可用于分离和检测。加合物，螯合物具有无机元素或有机化合物的分子加合物的形成是由本发明二氧化三碳构成的环齐聚物和大环的强缔合能力促成的。具有有机化合物的化学计量的或非化学计量的加合物被称为螯合物。二氧化三碳构成的环齐聚物和大环可以与下列几种情况形成稳定的加合物-优选2-6个环六聚物，-氨分子，有机胺，氨基酸，肽类或其它有胺功能的物质。天然氨基酸，生物胺和它们有胺功能的衍生物尤其属于本发明范围。这些胺加合物的通式为com-(C3O2)n·(R1R2R3N)m其中R1，R2和R3分别是氢原子或有机基团，m是1-n的数，n的定义如上。
实验上，式com-(C3O2)6·(NH3)2表示的环六聚物的二胺加合物的摩尔质量用ES质谱仪测定结果为M＝442.2，式com-(C3O2)6·(NH3)6表示的六胺加合物的摩尔质量为M＝510.4(图2)。对于二胺加合物，两个氨或胺分子极可能由氢键连到吡喃酮环的羰基上。由于在六胺复合物情况下已经涉及到大环结构的内部空腔，所以，也可以认为它们是主-客复合物。主-客复合物本发明活性物质第二个特别重要的结构性质是由这种方式实现的，即缩合的吡喃酮或羟基吡喃环另外形成本发明大环，优选圆筒形大环。该环结构的分子维数适合于形成本发明主-客这种发明。作为“客”，较小分子的元素或分子片断被认为在空间上要适合圆筒形空腔，和/或由特定的结合力连接到它们周围的分子上。圆筒形大环结构的环六聚物二氧化三碳的形式和维数如下图所示。
阳离子如钾，铵，银或铷，或阴离子如氟，氯，甲酸根或硫氰酸根非常合适内径2.9-3.2埃，高4.9-5.2埃的环六聚物大环的内部圆筒形空腔。在本发明申请中，离子或天然元素或分子存在于com-(C3O2)6单元的圆筒形大环结构的空腔中，并且被它包围。质谱仪测量的摩尔质量对应于各部分之和，证明这些主-客复合物是独立的化合物。发明者实验证明了环六聚物二氧化三碳与较小无机或有机化合物，一般指与Y如氨，羟基胺，甲醇，乙醇，丙醇，丙酮，二氯甲烷，氯仿，乙酰胆碱，甲酸，乙酸以及几种氨基酸和碳水化合物形成的主-客复合物的存在。根据本发明，物质Y或其结构的一部分在本发明活性物质的内部空腔中是以“客”的身份存在的，如下图所示。
通过这种“包围”使物质Y的某些性质被“罩住”，从而可以获得新的本发明性质如膜的传输性和生物利用度有所改善。不同摩尔量的活性物质M≤2,000道尔顿上述式com-(C3O2)n表示的环齐聚物二氧化三碳或式com-(C3O2H)n表示的羟基-吡喃，其中n是4，6，10，12或18，以及它们的所有衍生物，加合物，摩尔量低于上述限制的主-客复合物都属于这类低摩尔量物质。由2-4个环六聚物单元形成的自缔合物也被认为是低摩尔量活性物质。因此解释了由发明者测定的摩尔量为M＝816 D的com-(C3O2)12和摩尔量为M＝1,224 D的com-(C3O2)18的存在。M＞2,000道尔顿首先，这里分类的活性物质表现为多种摩尔量化合物的混合物。但是，更深入地分析证明，虽然原则上可以有无限多化合物，但实际上只有非常少量，即有特殊分子量的化合物能被得到和被测定。
水-乙腈溶液中的活性物质的LC-MS，电喷质谱(图3)说明存在一系列多电荷离子(m/z)。所测最密部分A31的m/z＝1,225.7 D，精确地对应于式为com-(C3O2)18的质子化分子。借助式M＝n[m/z-1](J.R.Chapmann的《实用质谱仪(Practical MassSpectrometry)》，第202页，J.Wiley，New York，1993)测定相应聚合物的实验摩尔量为M＝31×1,224.6＝37,962.6 D。
一些测定的化合物的摩尔量列于下面表中。
注释*已知标准作为对比**用MALDI得到的三个实验测量的平均值测量借助于MALDI质谱仪(MS)，凝胶渗透色谱(GP)或聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行。MALDI质谱(图4)的结果证明，存在的相应n＝60，特别是n＝72的化合物其浓度明显大于所有其它化合物。用这种方法测定的摩尔量精度上与n＝60和n＝72的式com-(C3O2H)n羟基-吡喃低聚物符合地非常好。这些化合物既可以认为是n＝60和n＝72的环齐聚物，也可以看成是s＝10或s＝12个环六聚物基本单元{com-(C3O2H)6}s的自缔合物。这些化合物com-(C3O2H)60和com-(C3O2H)72的生理化学和分光性质表明了结构高度对称，这些可以用，例如，10，12或更多个com-(C3O2H)6单元的球形排列说明。五角形或六角形对称的夹层排列也可以说明大量两性电荷的中和作用。
借助于聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)的实验结果表明在M≈5kD区域和摩尔量约为10kD，12.5kD，15kD，30kD，60kD和120kD的其它任意地带有很强的带。这些符合低聚合作用度n＝72，144，180，216，432，864和1,728的可接受精度。特别奇怪的是，这些数字代表数字6和12的倍数。用16.5％聚丙烯酰胺浓度的凝胶，绝大部分最强的带在M≈5kD范围。但是，如果相同的样品被用于不同的凝胶，例如，聚丙烯酰胺含量较低的凝胶，则主带可能出现在两倍以上的区域(≈10kD)。这种异常可以用活性物质具体的缔合-解离平衡解释。缔合平衡和膜转运发明者还测定了有较高分子量的化合物的透析和超滤中的特别异常之处。在透析一段时间之后在膜的两侧可以探测到较大的正常的不透过膜的活性物质。这可以解释为下列方程1的较高缔合物解离成较小可渗透膜的形式，而且在向外的透析液中重新构成较大的自缔合物。长时间透析之后膜两侧逐渐平衡。{com-(C3O2)n}s_{com-(C3O2)n}s-p+{com-(C3O2)n}p(1)其中s＝2，3，4，5，6，10或12以及这些数的倍数，且p＜s。简单环齐聚物和它们成倍缔合的有较高摩尔量的衍生物之间的平衡取决于多种因素，或者受，例如，溶剂性质，pH值，碱金属和其它离子的浓度，温度和与溶液中存在的其它物质螯合等因素的影响。平衡方程式(1)使本发明具有较大摩尔量的活性物质能够穿透细胞内空间，这种情况通常情况下是被阻断的。在膜外空间本发明活性物质可以较大com-(C3O2)n化合物存在。通过方程式(1)的解离这些活性物质可以穿透膜，进而达到膜的内部空间，在这里，它们经过缔合作用重新形成较大化合物。
由于它们的稳定性，较大自缔合物也可以为活性物质的生理储存和转运服务，进而到达病理表现的位置。它们在此显示它们的生物调节和治疗效果，或与其它活性物质螯合后表现这种效果。不穿透膜的物质Y在被“罩住”的膜之间的转运过程可以根据本发明以“藏”在活性物质圆筒内空腔中的方式进行。分光特性一般地，本发明活性物质的分子光谱相对贫带(band-poor)，这符合相应结构高度对称的情况。在KBr颗粒上得到的红外光谱(图5)说明了在cm-1，cm-1，cm-1，1210cm-1，1100cm-1，和830-600cm-1之间的几个特征吸收带，其中在1660cm-1的强带被称为4-吡喃酮环的“环呼吸频率”。在1720cm-1处没有IR吸收带说明不可能有2-吡喃酮结构。
UV-VIS光谱的最强吸收的最大值位于约190nm处，其肩部约在220nm和265nm处(图6)。证据表明，在约320nm处没有所希望的螯合双带的强吸收(峰)，而只在240-400nm处有弱的非特定倾斜吸收存在。但是，发明者发现了由于310-340nm放射性激发使一些加合物发射400-450nm范围的荧光。这表明较强但对称地禁止迁移行为存在。分析反应式com-(C3O2)n的活性物质可以通过与五氯化锑或与Liebermann-Burchard试剂以薄层色谱方式进行的阳性反应测定。分离中使用硅胶60备用板(Merck)，洗脱混合物为1-丙醇∶乙酸乙酯∶20％乙酸(60∶10∶30)。作为喷洒试剂，可用在四氯化碳中的饱和五氯化锑溶液或在20mL绝对乙醇中的2mL乙酸酐和2mL浓硫酸混合物。喷洒之后，将该板在120℃加热约10分钟，在λ＝365nm处检测UV光。荧光点表明有本发明活性物质的存在。
以胺加合物形式存在的活性物质表现出阳性水合茚三酮反应，这一点可用来对它们进行分析检测或分光光度计测定。由于大多数氨基酸和肽也表现这种反应，因此，该分析只适用于色谱分离之后。对于薄层色谱分离，硅胶60备用板(Merck)和1-丙醇∶乙酸乙酯∶20％乙酸(50∶30∶20，v/v)混合物被用作洗脱剂。作为喷洒试剂，使用含有0.1％水合茚三酮溶液和2％(v/v)冰醋酸和0.5％(v/v)对称可力丁的乙醇。在Rf＝0.32-0.45区域的黄点表明有一些本发明活性物质存在。
本发明活性物质的羟基-吡喃基团表现出与Folin-Ciocalteu试剂稍微有阳性苯酚反应，这一点可用于测定。由于用于蛋白质测定的已知的Lowry法也基于这个反应，所以必须首先对蛋白质或苯酚物质进行色谱分离。
对于根据本发明物质的分子量进行的分析分离，可用HP-GP(高效凝胶渗透色谱)法。分离优选在TSK G-2000SW(Toso-Haas)柱(600×7.5mm)中进行，用50mM硼酸盐缓冲液(pH＝8.1)作洗脱剂。混合物中活性物质成分的摩尔量借助于标定图(图7A)通过测量残留体积来测定(图7)。用已知分子量的聚乙二醇标准作标定曲线。
对于根据组分的极性进行的色谱分离，可用反相HPLC法，优选用Nucleosil 5 C18柱(Macherey Nagel)作为固相，优选用梯度为10-90％乙腈的水作为洗脱剂。
本发明吡喃鎓盐衍生物的特征是它们表现出平衡离子已知的分析反应，例如，卤化物与银离子或硫酸离子与钡的沉淀反应。
本发明活性物质表现出与强心甾类糖苷如哇巴因，地高辛等的抗体的高敏感性交叉反应。由于这些有机化合物本身不是致免疫的，而是首先与较大的蛋白分子如BSA或抗生物素蛋白进行化学偶合。通过用这些螯合物给兔子几次给药可以得到具体的抗哇巴因或抗地高辛抗体。这些抗体与本发明活性物质的交叉反应可以用酶联免疫测定(ELISA)法或放射免疫测定(RIA)法检测。这些方法允许对非常少量的活性物质(pg量级)进行高敏感性测定。对人体液的这种测定可能会由于强心苷的存在而受到破坏，但强心苷只出现在对心脏病的特殊药物治疗中。
具有较大摩尔量(M＞2.0kD)的本发明活性物质表现出与免疫球蛋白有值得注意的特殊反应。这些与人或动物免疫球蛋白的免疫特定沉淀反应是在琼脂糖胶中用分光光度法和Ouchterlouny法或用Laurell免疫电泳法检测。与正常血清中的免疫球蛋白的反应和与病理血清中的免疫球蛋白的反应之间的显著差别使这些反应可以用于各种免疫病理的诊断。O-烷基和O-酰基衍生物通过R表示的无机或有机分子基团与基本结构中的氧原子结合，形成通式com-(C3O2)n·Rm无机和/或有机衍生物或螯合物，其中R＝无机或有机分子和/或有机基团，优选甲基，乙基，乙酰基，苄基，且m≤2n。制备根据本发明，自从二氧化三碳被认为可以用已知方法制备以后，它就能被用作合成本发明大环物质的起始原料。
根据本发明，可以用光化学方法或使用适当助剂将用分馏方法纯化的C3O2转化成环齐聚物衍生物。二氧化三碳的合成是用已知方式进行，即在五氧化磷存在下和/或通过加热从少量二羧酸如丙二酸或其衍生物中除去两倍的水。但是，用这种方法会形成不需要的二氧化三碳非晶态聚合物。与此相反，发明者发现在非质子传递溶剂中进行所说酸或其酯的热脱氢反应更适合本发明活性物质的形成。根据本发明，将所说酸或其相应衍生物溶解于非质子传递溶剂，优选二甲基甲酰胺，加热并搅拌。将混合物加热到120-150℃，几分钟后已经明显形成C3O2。对于将这种方式产生的二氧化三碳转化成本发明环齐聚物活性物质，要用光化学活化反应和/或根据本发明加入适当助剂。发明者发现那些对大环结构的形成起样板作用的物质是有效的助剂。优选那些离子的稳定的盐化合物，离子的半径对应于内径为2.9-3.1埃的com-(C3O2)6大环的内部空腔。优选的离子有铷(2.94埃)，钾(2.66埃)，氨(2.86埃)和氟(2.72埃)。
发明者发现，一些酶，优选那些属于“聚酮化合物合酶(PHSs)”类的酶，可用于本发明二氧化三碳环齐聚物和大环相关衍生物的合成。可以使用几种羧酸衍生物，优选丙二酸，优选以丙二酸单酰-辅酶A形式。这种丙二酸单酰-辅酶A可以在生物素存在下由乙酰-辅酶A和CO2很容易地制备。
根据本发明，也可以从一氧化碳制成的一些大规模产物的副产物中分离出本发明生物调节活性物质。发明者惊喜地发现几种已知的由一氧化碳或合成气体经过工业化生产制成的有机合成产物可以含有少量但是可检测量的本发明活性物质。这可以用CO和合成气体含有少量二氧化三碳解释。为了增加这些大规模产物中极低含量的本发明活性物质，使用了分馏方法。将2-60份(“份”表示“重量份额”，除非另有说明)，优选20份，水或水性缓冲液加到100份原料(优选由合成气体制成的工业甲醇)中，然后先用蒸馏塔从该混合物中蒸馏出甲醇。残余的水相表现出本发明活性物质的含量有所增加。加入新鲜甲醇相并反复重复蒸馏过程，得到所要浓度的本发明活性物质。采用分馏或固相(优选活性炭或反相氧化硅)吸收方法从该溶液中分离出本发明活性物质，然后加入溶剂混合物，优选水-乙醇，进行解吸。
根据本发明，本发明活性物质也可以从植物提取物，植物细胞培养物或细菌培养物中分离。检测发现，大量植物种类中不存在本发明活性物质本身，但存在未定义的其它螯合物，优选毒性植物成分。优选的粗原料是那些含有毒性成分如生物碱或心脏毒性糖苷(cardiotoxic glycoside)。而且，皂草苷或鞣酸含量相对较高的植物种类也可以作为分离本发明活性物质的适当原料。根，根茎，茎，叶，皮或种子，或最初用已知方式经过细胞形成得到的相应的植物细胞培养物都是合适的植物原料。
如果需要制备小分子量二氧化三碳衍生物，优选com-(C3O2)n，可采用本发明下列方法将10份萃取剂，优选30％醇-水混合物，加到1份用己烷脱脂的干燥植物原料中，并在光加热下浸泡24小时。重复该过程几次，优选2-3次，然后浓缩合并的醇萃取物。在沸腾浓缩的酊剂之前加入酸，优选乙酸或盐酸，相对于酊剂的量为0.01-5％，优选1％，并在短时间内(优选10-30分钟)保持在80-100℃。用碱，优选NH4OH，中和冷却的溶液，每100份液体用1-20，优选5-10份活性炭处理。滤出的活性炭再用水洗涤并过滤。真空干燥的活性炭用沸腾的萃取剂(优选1∶1乙醇-水)处理，并将该过程重复两次。这样得到的本发明活性物质的溶液是稳定的并适于长期保存。也可以将合并的溶液浓缩和冻干。重复重结晶，优选从醇-醚混合物中重结晶，将产生的固体残余物纯化。这样分离的加合物是长期稳定的。
如果需要制备大分子量二氧化三碳化合物的环齐聚物，可采用本发明下列方法在每1份重量用己烷脱脂的干燥植物原料中加入5-20，优选8份甲醇，并在光加热下浸泡1-36，优选16小时。重复该过程几次，优选两次，然后浓缩合并的萃取物。将浓缩的溶液倒入可混水的有机溶剂，优选丙酮或乙醇中，比例为1∶20-1∶2，优选1∶8。通过过滤或离心分离形成的沉淀，并将其溶解于最少量的水或缓冲液中。全部过程重复1-5次，优选2次。将这样得到的粗产物溶解于最少量的用pH 9-10.5缓冲液碱化的水中，优选用排出限为3kD的膜对用pH 9-10.5缓冲液碱化的蒸馏水进行渗析。长时间(优选3-4天)渗析后，经过几次更换膜外水量，滤出膜内溶液，细心地浓缩并冻干。
根据本发明，有离子交换作用的天然吸收剂或离子固相，如树脂，凝胶或改性多糖类可用于不同摩尔量的本发明活性物质的分离。由于本发明活性物质的两性离子属性，可以使用阴离子交换剂和阳离子交换剂或混合床交换相。首先，用离子交换相处理植物或其它原料的萃取物。当该成分附着在固相上之后用过量中性或弱酸性洗脱剂，优选水或缓冲液洗涤该塔，直到洗脱液中探测不到常见成分(碳水化合物，氨基酸)。用稀无机酸，优选盐酸，或有机酸，优选甲酸或乙酸对阳离子交换剂相进行解吸。用稀碱，优选0.1-0.3摩尔氢氧化铵或氢氧化钾溶液将附着在阴离子相或混合床相上的本发明活性物质释放出来。用溶剂，优选用甲醇或乙腈水溶液从反相氧化硅解吸。
根据本发明，用0.2-5％，优选1.2％十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，或1-12摩尔，优选8摩尔脲溶液从中性相如硅胶，聚酰胺或各种多糖类中解吸。
根据本发明，本发明不同摩尔量的活性物质的分离和纯化采用凝胶过滤或膜透析和超滤方法进行。对于本发明活性物质的分离，根据它们的分子量，借助于合成的固相，优选用Sephacryl 200，SephadexLH-200或TSK HW-60，进行凝胶色谱分离。可用弱碱缓冲液，优选乙酸铵或碳酸氢铵，或0.01-0.3摩尔，优选0.15摩尔NaCl或KCl溶液作为洗脱剂。用这些分离方法首先是将较高分子量的化合物洗脱，然后，较小的化合物如com-(C3O2)6或com-(C3O2)10才从塔中流出。
根据本发明，由从植物成分得到的本发明活性物质形成的几种螯合物可以直接分离。采用有机溶剂，优选乙醚的丙酮，可使这些几乎粘稠的黄棕色螯合物从浓甲醇植物萃取物中沉淀。经过几次，优选3-5次，沉淀，这样得到的螯合物已经相对均匀。根据本发明，下列盐析方法可用于本发明螯合物的裂解。将螯合物溶解于水，其中溶有相对于最终溶液含量为5-50％(w/w)，优选15％的无机盐，优选硫酸铵。将有机溶剂，优选正丁醇或2-丙醇，倒入该溶液，并将其剧烈摇动，该相被分离。重复这一过程2-5次，优选3次，同时用酸将水相的pH值调至1。根据本发明方法进一步裂解之后，将螯合物溶解于水，用氨将pH值调至10，倒入氯化物溶剂，优选二氯甲烷或氯仿(比例为1∶0.5，优选1∶2)，搅拌。用力摇动之后分离出非常稳定的泡沫状乳液，然后，减压除去有机溶剂。
也可以从细菌原料中分离本发明活性物质。为此，根据本发明可用各类细菌培养物，优选BCG(卡介菌)，小棒杆菌(Corynebacteriumparvum)或大肠埃希氏杆菌。首先进行物理处理，优选用超声波处理，然后用稀无机酸，优选盐酸，水解。任意中和过滤的水解物，并将其用于固相，优选正常或反相硅胶。用各种中性洗脱剂处理固相直到在洗脱液中探测不到氨基酸，碳水化合物和其它简单的水解产物。用稀碱，优选0.1-0.2摩尔氢氧化铵，或用甲醇或乙醇水溶液或乙腈对反相进行本发明活性物质的解吸。
动物组织和组织液中可能含有少量未定义螯合物的本发明活性物质。根据本发明，首先对小心冻干的有机液(优选尿)组织进行有机萃取，然后用选择性亲和力色谱法从浓缩的有机萃取物中分离和纯化本发明活性物质。为此目的，将已知强心苷，优选哇巴因或嚏根草因，共价连接到固相(优选Sepharose)上。这种亲和相滞留浓缩的粗原料溶液中的本发明活性物质。用弱酸或中性缓冲液洗涤塔多次后，借助于碱性缓冲液，得到本发明化合物。生物调节应用发明者发现本发明活性物质有效地控制了已知作为钠泵的Na+，K+-ATP酶活性。通过所谓的主动膜转运这种广泛分布的酶调节了最重要的碱金属离子的细胞外和细胞内浓度。为此所必需的能量由ATP水解传送，它直接偶合该酶的活性。本发明活性物质可以控制该酶的复合活性。控制的方向和强度取决于浓度和本发明活性物质的摩尔量。所说碱金属离子和其它无机离子的性质和浓度主要影响该控制效果。在红细胞悬浮液中加入本发明活性物质可以观察到细胞外Na浓度即钠泵的活化程度有所增加。相反，用本发明较小摩尔量的活性物质的具体浓度实现体外Na+，K+-ATP酶的抑制。
当将本发明活性物质与哇巴因或其它强心苷一起使用时可以观察到这些苷的毒副作用有所降低。以0.02-2/1，优选1∶1摩尔苷的摩尔比加入本发明活性物质后嚏根草苷的LD50值明显升高，说明急性毒性有所降低。而且，如果实验成立，本发明活性物质就能控制其它几种主要酶如胶原酶，透明质酸酶，磷酸激酶等的活性。根据上面所述，本发明活性物质可用作Na+，K+-ATP酶的内源性配位体。免疫调节作用发明者已经发现了本发明活性物质的几种免疫调节作用。这些机理可以部分地用上述Na+，K+-ATP酶的控制解释，因为这些酶主要参与大量免疫过程。
另外，本发明活性物质在对Fc受体有特殊亲和力的那些受体中呈现新的免疫调节作用。这些受体固定在多种免疫细胞上，它们的占据或非占据在控制这些细胞的活性方面起着根本性的作用。在临床试验中本发明活性物质导致病理活化杀伤细胞(K细胞)和抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)中的其它淋巴细胞的活性明显降低。相反，在自发细胞毒素(SCMC)中的天然杀伤细胞(NK细胞)的活性受到本发明活性物质不同程度的影响对于风湿病患者，生理超刺激自生细胞毒性明显被抑制。对于健康的试验者，自发细胞毒性只受到不明显地影响。因此，临床数据证明，通过抑制自攻击过程，本发明活性物质适合于常见风湿病的治疗，或预防组织或器官移植产生的排斥反应。值得注意的是所有这些效果都是用异常少量(μg/kg范围)的活性物质得到的。换句话说，本发明化合物的毒性极低。因此，本发明最重要的药物毒性先决条件是完成对人类的治疗应用。本发明活性物质的风湿病治疗用途还有另一个显著优点。优选n＝6的com-(C3O2)n小环齐聚物及其加合物表现出异常强的止痛和解痉效果。局部给药之后立即表现出止痛和解痉效果是风湿病治疗应用中重要的优点。迅速缓解疼痛和解痉是通过正常免疫调节功能的重新建立长期维持的。本发明较大分子量的活性物质能够发挥显著的模仿免疫刺激的非特定效果。这是在动物实验中用细菌感染明确证实的。用活性物质治疗使用了致命铜绿假单胞菌剂量的动物，其存活率明显比对照组动物的更高。
本发明有生物调节功能的活性物质既可以作为纯物质或混合物质分别给药，也可以药物组合物形式给药，因此，药物组合物除包含本发明物质外还包含一个和/或几个药物上安全的赋形剂和/或载体。这些物质包括0.9％氯化钠溶液，1-5％葡萄糖或果糖溶液，羧甲基纤维素，马铃薯淀粉，乳糖，羊毛脂，甘露糖醇，硬脂酸镁，1，2-丙二醇，甘油，十六烷基十八烷醇，对羟苯甲酸甲酯，月桂基硫酸钠和滑石。在这样制备的药物组合物中还可以任意加入其它治疗用活性物质或赋形剂。这些草药配方还包括适于下列方式给药的所有制剂胃肠外，肌肉内，静脉内，皮下，动脉周围或动脉内注射，口服给药如用片剂，胶囊剂或滴剂，或外部给药如用软膏，乳膏，凝胶或栓剂。
下列实施例将进一步说明本发明。实施例1由二氧化三碳合成制备在装有回流水冷却器的玻璃反应器中将15份丙二酸溶解于80份乙酸酐，油浴(80℃)加热并搅拌。在回流冷却器延伸部分接上另外两个干冰冷却阱，目的是收集挥发的化合物。全部酸溶解之后加入0.2份氟化铷，并用250W日光灯进行光化学照射。将油浴温度升至130-150℃，反应混合物逐渐变成深棕色。在强真空下挥发的二氧化三碳及其衍生物被冷凝在用干冰和丙酮冷却的阱中。冷凝物经过真空分馏纯化。用已知色谱法纯化和分析这样得到的活性物质。实施例2从工业甲醇中分离将pH为9的250份0.1摩尔乙酸铵缓冲液加到1000份由合成气体制成的甲醇中。首先用蒸馏塔从混合物中蒸馏掉甲醇，再在残留的水相中加入1000份甲醇，并重复蒸馏甲醇3-4次。将最后残留的水相小心浓缩并用活性炭处理。将50份过滤分离并在空气中干燥的活性炭用含有80％(v/v)乙醇的400份水在80-90℃处理，浸渍30分钟后加温过滤。重复此萃取过程2次。将合并的乙醇萃取物细心浓缩并冻干。实施例3从嚏根草类中分离将数份淡紫色嚏根草(Helleborus purpurascens)(毛茛科)的干燥和粗糙切碎的根和根茎用120份己烷脱脂，然后80份二氯甲烷进行预萃取。除去萃取剂后用200份含有30％(v/v)乙醇的水在室温浸渍干燥残余物24小时。重复萃取过程两次，然后将合并的萃取物过滤并真空浓缩。将这样得到的250份萃取物加到3份浓盐酸中并在95℃加热20分钟。中和之后用少量活性炭处理溶液并过滤。将真空浓缩的滤液倒入8倍体积的丙酮中，将离心所得沉淀溶解于最少量的水中，并用丙酮重复沉淀2-3次。将沉淀溶解于最少量的0.1摩尔的氯化钠溶液中，并从充有TSK HW-60的凝胶柱上方引入该溶液。用0.125摩尔的氨水溶液(还可以含有10％(v/v)2-丙醇)以5cm/h的流速进行洗脱。在230nm处测量光密度。实施例4从葡萄种子中分离活性物质将25份干燥和研磨的葡萄种子加到pH＝9.6的150份0.5摩尔硼酸盐缓冲液中，并在90℃加热和浸渍30分钟。浓缩过滤的溶液，并将其倒入搅拌的8倍体积冷乙醇中。离心产生沉淀，将沉淀溶解于最少量的水中，并每次用6倍量的冷乙醇沉淀两次。将溶解于稍微有点儿碱性pH的最少量的乙酸铵缓冲液中的沉淀用分子排阻限为30，10，3和1kD的膜进行超滤分离。将这样分离的馏分的pH重新调节到弱酸性pH值并冻干。实施例5从美国商陆中分离活性物质将100份干燥的美国商陆根切碎成0.5-1.2mm颗粒，并用600份己烷进行24小时的处理进行脱脂。首先挤掉己烷，然后空气干燥植物原料直到闻不到己烷气味。用800份含有5％(v/v)乙酸的水在室温浸渍干燥的植物原料4小时，并将该过程重复两次。过滤合并的萃取物并真空浓缩。在该水溶液中分批加入15-50份硫酸铵并使之溶解。通过离心和过滤除去盐析过程沉淀出的蛋白质。在50份上清液中加入50份1-丁醇并将之剧烈摇动。一段时间后分离有机相，并重复丁醇萃取过程两次。合并的丁醇溶液再用0.1％氨水萃取一次。真空浓缩水相，凝胶过滤纯化。实施例6从大肠埃希杆菌制备在含有20份胰胨，10份酵母提取物，20份NaCl和30份琼脂并补充有适当营养添加物的2000份体积高压灭菌后的培养基中以1∶100的稀释程度接种大肠埃希杆菌K-12。培养保持在37℃直到达到2×109细胞/mL的饱和密度。用超声波处理反应混合物，并将反应混合物与1.0N乙酸一起在90℃加热20分钟。冷却后过滤并真空浓缩。将150份浓缩溶液吸附在反相氧化硅(RP18)上进行柱色谱(Merck)分离，固相首先用2％(v/v)乙酸水溶液洗涤，然后用1000份由正丙醇∶乙酸乙酯∶20mM硼砂/硼酸盐缓冲剂(600∶100∶300％(v/v))组成的缓冲混合物洗涤，最后用水洗涤。固相只有用这些中性洗脱剂洗涤直到洗脱液中测不到有氨基酸，碳水化合物和其它简单的水解产物存在。本发明活性物质的解吸用乙腈进行，真空浓缩除去过量乙腈。最后，浓缩这样得到的本发明活性物质的溶液。实施例7从动物体液分离将10,000份猪尿冻干，固体剩余物用600份甲醇萃取三次。将甲醇萃取物浓缩成20份。用适当活化的嚏根草苷溶液处理100份溴化氰活化的Sepharose 4B直到80％的所用苷与固相共价结合。将10份浓甲醇溶液用到这样制备的亲和层析柱上并洗脱一段时间，直到在洗脱液中探测不到更多的化学化合物。经过用0.5-0.2摩尔甲酸的梯度洗脱从层析柱上洗脱出本发明活性物质，然后将其冻干。在填充Sephadex LH-20(Pharmacia)的柱上进行活性物质的纯化。首先将活性物质吸附在柱上，然后用20-60％(v/v)的丙酮水溶液梯度洗脱。实施例8免疫调节的应用通过对从100/1-10/1效应物/靶细胞比例的K562靶细胞放出的51Cr同位素进行的测定来测量NK细胞的自发细胞介导的细胞毒性(SCMC)。对于10个健康对象中的8个，本发明活性物质将溶解活性平均提高了15％。通过用本发明活性物质给药，生理活性平均增加141％的16个风湿病患者的生理SCMC活性明显趋于正常。抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)中的效应物细胞以更加一致的方式受到本发明活性物质的影响。下面图表1证明，在健康者和风湿病患者身上的ADCC活性减小。图表1
用和没用活性物质治疗的健康者和风湿病患者的细胞毒性
抗体依赖细胞SCMC
自发细胞介导的细胞毒性的细胞毒性这种活性的正常化作用可用活性物质对Fc受体的特殊亲和力解释。实施例9在器官移植中的免疫抑制应用本发明物质的免疫抑制作用可以明显地减轻器官移植时的排斥反应。对小鼠的一系列心脏移植实验从实验上证实了这一点。
Corry，R.，Winn，H.和Ressel，P.的同种(动物)心脏移植方法(《移植(Transplantation)》，16，343(1973))被用于无病原体的5-6周龄小鼠，Sprague Dawley DBA/2系作为供体，C57BL/6系作为受体。
用作供体的动物静脉内肝素化之后，它们的心脏被取出并保持在冰冷的Ringer乳酸盐溶液中直到准备好C57BL/6受体动物。供体主动脉和肺动脉与受体腹部主动脉和腔静脉之间的吻合术采用显微外科技术完成。
血液重新开始流动之后观察心跳的频率和强度，评判标准为0-+4。通过剖腹手术可以看到，脉搏停止后出现排斥反应。试验组中的小鼠经过皮下给药获得以下数量的活性物质-移植前3天，2.0mg/kg-手术当天，3.0mg/kg-手术后第三天，2.5mg/kg-以后每3天，1.5mg/kg对照组中的动物仅用安慰剂柠檬酸盐缓冲液处理。
移植实验所得结果如下动物编号
存活时间(天)1活性物质
242活性物质
313活性物质
184活性物质
215活性物质
426活性物质
187活性物质
68活性物质
339活性物质
9用安慰剂治疗的动物的存活率平均为8.2天。用活性物质治疗的动物的存活率平均为22.7天，显然几乎是安慰剂治疗动物存活时间的3倍。这个结果可以用对T淋巴细胞引起的排斥反应的特殊抑制作用解释。实施例10巨噬细胞的刺激作用将从10个正常小鼠提取的脾淋巴细胞悬浮于用HEPES缓冲的RPMI1640培养基，并补充10％胎牛血清。将悬浮液保持在37℃1小时使得巨噬细胞粘连。在试验组中给小鼠腹膜内给药5mg/kg活性物质，24小时后杀死小鼠。对照组动物不接受任何活性物质。将从两个组得到的淋巴细胞在盛有5×105个粘连巨噬细胞的试管中培养。
巨噬细胞的刺激指数LPS PHA对照组
165％活性物质组
1,346％试验数据证明，通过用活性物质处理的动物中的LPS(脂多糖)和PHA(植物血凝素)得到的刺激指数(SI)明显更大。实施例11表观免疫刺激作用的应用非特定表观免疫刺激作用是通过测定感染致命剂量的绿脓假单胞菌动物的存活率确定的。
在分别有30-100个小鼠的三个试验组中，每个动物都接受致命剂量的绿脓假单胞菌。I.在致命量假单胞菌感染之前的第7，14和28天给第一组施用2μg活性物质；在第21天施用0.25mL生理NaCl溶液，II.给第二组也施用与第一组同样剂量的活性物质，但在第21天施用0.06mg环磷酰胺，III.不给对照组任何活性物质。％致命假单胞菌感染后的存活率
I.＿×＿×＿×＿活性物质II.＿○＿○＿○＿活性物质+环磷酰胺III.＿#＿#＿#＿对照组本发明活性物质使存活率明显增加。虽然环磷酰胺已知的免疫抑制作用会降低存活率，但它们的存在仍然超过了对照组的值。相互作用指明本发明活性物质具有非特定表观免疫刺激作用，其中至今还没有阐明的新免疫机理也是可以想象的。最近已被证明，致命剂量的假单胞菌感染后细胞因子会立即爆炸似的释放。因此，病发细胞因子休克被认为是突然死亡的直接原因。本发明的免疫抑制作用可以防止这种细胞因子休克，并且不用真正的免疫刺激就可以惊人地增大存活率。实施例12用竞争ELISA法测定活性物质利用本发明活性物质与抗哇巴因(a-OU)抗血清的交叉反应进行测定。根据Harris等人的方法(《高血压(Hypertension)》，17，930(1991))由分析前(pro analysi)哇巴因(Sigma)和抗生物素蛋白(Fluka)合成哇巴因-抗生物素蛋白螯合物(OU-con)。将V.Dibartolo等人的改进方法(《生命科学(Life Sciences)》，57，))用于相应抗哇巴因血清的制备。
首先在每个ELISA微滴定板中加入0.1μg/50μL OU-con螯合物溶液，并在4℃培养过夜。用磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)洗去未结合的螯合物，用1％明胶溶液围住未占据的结合部位。
将50μL活性物质含量未知的样品溶液与固定量抗哇巴因血清(0.5μg/50μL)在聚丙烯试管中混合，并保持在室温2小时。然后，从每个活性物质抗血清样品中提取50μL加到各板中，并继续培养3小时。用PBS洗去未结合的抗血清之后用蛋白A碱性磷酸酶(Sigma)的1∶500溶液在室温处理该板2小时。除去未结合的酶之后，每块板用50μL对硝基苯基磷酸酯溶液(1mg/mL)处理，培养30分钟后自动记录405nm处的吸收值(埃)。
为了构造标定曲线，将范围在5ng/mL-0.1mg/mL的已知量的活性物质与常量抗血清混合，用上述方法处理，所测吸收值代表相应浓度的作用。
1.大环物质，其特征在于它的框架结构是由无机二氧化三碳C3O2经过环齐聚合作用构成的，形成缩合的4-吡喃酮或2-吡喃酮环另外连在基本化合物的堆积的C＝O和C＝C双键不再存在的大环结构上，这种框架结构对应于通式com-(C3O2)n，其中符号com表示连接上述C3O2单元的环齐聚物和大环，n代表二氧化三碳的环齐聚合作用的聚合度。
2.根据权利要求1的大环物质，其特征在于二氧化三碳环齐聚物结构表达式中的数字n等于4，6或10，或者4，6或10的倍数。
3.根据权利要求1和2之一的大环物质，其特征在于该物质具有吡喃酮，吡喃鎓或不同互变异构限结构代表的依赖介质的电子分布，其中这些物质可在溶液中的与其它物质相互配平。
4.根据权利要求3的大环物质，其特征在于由6个不同的头尾缩合的4-吡喃酮构成的二氧化三碳环六聚物com-(C3O2)6的溶液中存在吡喃酮-吡喃鎓平衡，可表示如下
5.根据权利要求1-4之一的大环物质，其特征在于该物质以通式com-(C3O2)n·Hm表示的羟基-吡喃衍生物形式存在，该衍生物是将氢加到框架环外的氧原子上形成的，其中m是结合的氢原子数且m≤n，H是氢原子，com和n定义如上。
6.根据权利要求1-5之一的大环物质，其特征在于式com-(C3O2)n二氧化三碳环齐聚物或其式com-(C3O2H)n羟基-吡喃衍生物是构成加合物吡喃鎓盐，主-客复合物，自缔合物及无机或有机衍生物的基本单元，其中com和n定义如上。
7.根据权利要求1-6之一的大环物质，其特征在于环齐聚物基本单元具有带内部空腔的圆筒形大环结构。
8.根据权利要求1-7之一的大环物质，其特征在于存在式com-(C3O2)n·KanAnn的吡喃鎓盐，其中Ka是阳离子和An是阴离子平衡离子，这些离子中和吡喃鎓框架中的两性电荷。
9.根据权利要求1-8之一的大环物质，其特征在于其以式com-(C3O2)n·(R1R2R3N)m的胺加合物形式存在，其中R1，R2和R3分别是氢原子或有机基团，m是数字1-n，所说物质由二氧化三碳环齐聚物框架和1-n个氨，有机胺，氨基酸，肽或其它带有胺官能团的物质的分子组成。
10.根据权利要求1-9之一的大环物质，其特征在于无机或有机分子或有机基团R连接在基本框架的氧原子上，因此制成通式com-(C3O2)n·Rm的无机和/或有机衍生物或螯合物，其中R是无机或有机分子和/或有机基团，m≤2n。
11.根据权利要求1-10之一的大环物质，其特征在于存在基本单元com-(C3O2)n或com-(C3O2H)n以式{com-(C3O2)n}s或{com-(C3O2H)n}s的稳定自缔合物形式存在，其中s＝2，3，4，5，6，10或12，以及这些数的倍数。
12.根据权利要求11的大环物质，其特征在于对应于s＝12和n＝6且摩尔量为4,898或4,970的化合物有高度对称结构框架。
13.根据权利要求1-12之一的大环物质，其特征在于它以方程式{com-(C3O2)n}s_{com-(C3O2)n}s-p+{com-(C3O2)n}p的较小和较大化合物之间动态平衡的形式在溶液中存在，其中s有权利要求11给出的值，且p＜s。
14.根据权利要求1-13之一的大环物质，其特征在于所说物质具有由单个物质或它们的混合物产生的生物调节活性。
15.制备根据权利要求1-14之一的有生物调节活性的大环物质的方法，其特征在于在形成大环结构的条件下用半径适合于大环空腔的离子的盐形式的辅剂光化学活化和/或环齐聚合作用化二氧化三碳。
16.制备根据权利要求1-14之一的有生物调节活性的大环物质的方法，其特征在于用属于聚酮化合物-合酶(PKS)类的酶处理象丙二酸单酰-辅酶A这样的脂肪酸衍生物。
17.分离根据权利要求1-14之一的有生物调节活性的大环物质的方法，其特征在于-大规模使用由合成气体或通过氧合成制备的有机产物，-通过分馏富集所含生物调节活性物质，-通过真空蒸馏和低温浓缩分离这些活性物质，及-通过吸附在固相上并用各种溶剂解吸纯化。
18.分离根据权利要求1-14之一的有生物调节活性的大环物质的方法，其特征在于-将含有毒苷，生物碱或鞣酸的植物或植物细胞培养物用作粗原料，-用水溶液萃取这种粗原料中的未化学定义的螯合物，-通过用丙酮，醇或其它溶剂进行水解和/或沉淀裂解这些螯合物，-将所得混合物放入离子交换器或中性吸收物质中，洗去其它成分，-用碱性缓冲液或选择官能团溶剂的混合物将活性物质解吸，及-用渗析，滤膜，凝胶色谱或其它方法进行纯化，并根据分子大小选择性分离。
19.分离根据权利要求1-14之一的有生物调节活性的大环物质的方法，其特征在于活性物质是从细菌培养物中得到的，其中-培养液用超声波处理和/或在酸性pH值液体中水解，-用液-液萃取法初步分离活性物质，-将活性物质放到活性炭或其它吸收剂中，-选择性地加到含温醇-水溶液或其它溶剂混合物的溶液中，及-用色谱法或其它分离方法纯化。
20.分离根据权利要求1-14之一的有生物调节活性的大环物质的方法，其特征在于活性物质是从动物组织，组织液或组织培养物中提取的，其中-浓缩和/或冻干水提取物，-用液-液和液-固萃取法预纯化，-放入含共价结合的特殊苷或蛋白质的亲和固相中，及-用溶剂混合物选择性地释放。
21.根据权利要求1-14的大环活性物质在制备治疗剂中的用途，用于-生物调节Na+，K+-ATP酶和其它酶，或-抑制自身免疫病中的破坏性自身攻击过程，或-通过结合Fc受体进行免疫调节，或-通过连接神经受体治疗疼痛，或-缓解肌肉或血管痉挛。
22.用根据权利要求1-14的活性物质作为治疗剂的用途，用于-控制Na+，K+-ATP酶和其它酶，或-刺激免疫系统，或-控制吞噬作用。
23.根据权利要求21或22的用途，其特征在于使用加合物，吡喃鎓盐，环齐聚物的主-客复合物衍生物。
24.根据权利要求1-14之一的大环活性物质的用途，用来制备这些物质与已知药物活性物质构成的药物螯合物或加合物，用于-减弱强心苷，生物碱或其它药剂的急性和/或慢性毒性，或-改善甾类，肽或其它活性物质的生物利用度。
25.根据权利要求1-14之一的大环活性物质的用途，用来制备由不可透膜的离子或较小物质构成的主-客复合物并能使它们透过细胞膜的药物。
26.根据上述权利要求之一的活性物质的用途，用来治疗炎症，风湿病和自身免疫疾病。
27.根据上述权利要求之一的活性物质的用途，用来治疗类风湿性关节炎，多发性硬化，红斑狼疮，重症肌无力和其它自身免疫疾病。
28.根据上述权利要求之一的活性物质的用途，用来抑制器官或组织移植产生的排斥反应。
29.根据上述权利要求之一的活性物质的用途，用来治疗由于急性或慢性免疫防御能力减弱引起的疾病或细胞因子介导的休克现象。
30.根据上述权利要求之一的活性物质的用途，用来治疗由于Na+，K+-ATP酶系统生物调节功能缺陷引起的心血管疾病。
31.药剂，其特征在于它含有权利要求1-14的生物调节活性物质和生理上可接受的载体
32.根据权利要求31的药剂，其特征在于它可以口服，表面，静脉内或动脉内给药。
33.根据权利要求31和32的药剂，其特征在于它以片剂，囊剂，软膏，凝胶或注射形式给药。
34.根据权利要求31-33的药剂，其特征在于它还含有其它佐剂。
35.自身免疫病理疾病的诊断剂，其特征在于根据权利要求1-14之一的活性物质本身或其标记形式被用来检测血液或组织样品。
36.心血管病理疾病的诊断剂，其特征在于使用了根据权利要求1-14的活性物质本身或其标记形式，和/或通过凝胶色谱，ELISA或放射性免疫测定进行分析。
37.免疫学疾病的诊断剂，其特征在于根据权利要求1-14的活性物质的特定的沉淀反应用免疫球蛋白或其片断进行。
38.自身免疫病理疾病的诊断方法，其特征在于根据权利要求1-14之一的活性物质本身或其标记形式被用来检测血液或组织探针。
39.心血管病理疾病的诊断方法，其特征在于使用了根据权利要求1-14之一的活性物质本身或其标记形式，和/或通过凝胶色谱，ELISA或放射性免疫测定进行分析。
本发明涉及具有生物调节活性的大环结构框架物质,通过环齐聚合作用和其它形成大环结构的作用从二氧化三碳合成该物质。这些活性物质本身和/或它与其它已知物质的稳定的加合物的应用。本说明书描述了这些活性物质以及它们的有机和无机衍生物的特性,它们的合成制备,以及它们的分离和纯化方法。本说明书还描述了这些活性物质在酶调节和生物调节方面的用途,含有这些活性物质的药物组合物以及它们在诊断和治疗方面的应用。
文档编号A61P21/00GK180086
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者F·克勒克 申请人:克勒克博士多纳图尔股份有限公司