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植物体内可溶性蛋白和非可溶性蛋白含量的测定
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蛋白质工程内容总结_new要点.doc 15页
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蛋白质工程试验项目实验一聚丙烯酰胺凝胶电泳制备实验二豌豆植物可溶性总蛋白提取及电泳实验三豌豆蛋白凝胶电泳后染色、脱色及观察实验四含目的蛋白ERAF17菌种活化及药品配制实验五BL21-ERAF17目的蛋白基因的检测实验六目的蛋白ERAF17的诱导表达及蛋白处理实验七目的蛋白质电泳、染色、脱色及对比观察实验一聚丙烯酰胺凝胶电泳配制【实验目的】：通过本实验熟悉聚丙烯酰胺凝胶的配置技术。【实验原理】：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在加速剂TEMED和催化剂过硫酸铵的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，可以根据蛋白质带电荷、分子量大小等将蛋白质分离，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE。【实验设备及药品】：垂直板凝胶电泳设备、移液器、烧杯、单体丙烯酰胺、交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺、加速剂TEMED和催化剂过硫酸铵。【实验步骤】SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液配制溶液成分 总体积5ml 总体积10ml 总体积15ml 总体积20ml 总体积25ml 总体积30ml
水 1.1ml 2.3ml 3.4ml 4.6ml 5.7ml 6.9ml
30%丙烯酰胺 2.5ml 5.0ml 7.5ml 10.0ml 12.5ml 15.0ml
1.5MTris(pH8.8) 1.3ml 2.5ml 3.8ml 5.0ml 6.3ml 7.5ml
10%SDS 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml
10%过硫酸胺 0.05ml 0.1ml 0.15ml 0.2ml 0.25ml 0.3ml
TEMED 0.002ml 0.004ml 0.006ml 0.008ml 0.01ml 0.012ml
2．迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液,留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层无水乙醇（异丙醇或水）（约2~3mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。3．分离胶聚合完全后（约30分钟），倾出覆盖水层，再用滤纸吸净残留水。4制备浓缩胶：按下表给出的数据，在另一小烧杯中制备5%浓缩胶溶液4ml，一旦加入TEMED，马上开始聚合，故应立即快速旋动混合物并进入下步操作。不同体积5%聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶制备溶液成分 总体积3ml 总体积4ml 总体积5ml 总体积6ml 总体积8ml
水 2.1ml 2.7ml 3.4ml 4.1ml 5.5ml
30%丙烯酰胺 0.5ml 0.67ml 0.83ml 1.0ml 1.3ml
1MTris(pH6.8) 0.38ml 0.5ml 0.63ml 0.75ml 1.0ml
10%SDS 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml
10%过硫酸胺 0.03ml 0.04ml 0.05ml 0.06ml 0.08ml
TEMED 0.003ml 0.004ml 0.005ml 0.006ml 0.008ml
5.聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶,立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。实验二豌豆植物可溶性总蛋白提取及电泳【实验目的】：学习植物可溶性总蛋白提取原理及方法，熟悉蛋白质电泳操作步骤，熟悉蛋白质分离的原理。【实验原理】：多数蛋白质都溶于水、盐溶液或有机溶液，分离纯化某一蛋白质首先要求把蛋白质从组织或细胞以溶解的形态释放出来，并保持原来的天然状态。在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中由于SDS带有大量的负电荷，由于不同的SDS-蛋白质复合体具有相同的荷质比和相同的构象，因此迁移率不受原有的电荷、分子形状的影响，只取决于蛋白质分子量，因此经过一段时间电泳后蛋白质混合物会按其分子量大小分离。【实验设备及药品】：高速离心机、移液器、蛋白质电泳仪、微量移液器、恒温水浴锅、Tris-甘氨酸电极缓冲液、液氮、豌豆苗。【实验步骤】：1.豌豆种植，8-10天后全株植物可作为实验材料提取可溶性蛋白2．提取缓冲液（PBS）研钵取各样品叶片分别约100mg，注意取材后要立即称量。将叶片放入研钵，加入液氮进行充分研磨。将研磨所得的粉末转移到Eppendorf管中,加入冰冷的PBS溶液200μl,颠倒混匀,立即置于冰上静止3-4小时（使其充分溶解）。12000转／分在4℃条件下离心5分钟。100℃加热8-10分钟使蛋白质预变性。11.待浓缩胶聚合完全后（30分钟），小心移出梳子。把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris-甘氨酸电极缓冲液，必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡。12.按顺序加样，加样量通常为30μl（1.5mm厚的胶）。13.将电泳装置与电源相接，凝胶上所加电压为8V/cm。
正在加载中，请稍后...产品导购指南中心生物帮产品使用指南手册为广大科研爱好都提供便利平台该指南的快速浏览目录&当前位置： 蛋白抽提与纯化>蛋白抽提>详细内容蛋白抽提试剂——MERCK最后修改日期： 16:20:02作者：wulili■ 蛋白抽提试剂选择指南细胞类型产品起始材料应用注释总培养物细胞沉淀高通量1D电泳2D电泳等电聚焦质谱WB活性检测纯化大肠杆菌BugBuster& Protein　&　&&&　&&&从大肠杆菌中高效抽提可溶性蛋白（非变性条件）。加入rLysozyme&溶液及Benzonase&核酸酶增加裂解效果。可用于任何规模培养所得细胞沉淀的裂解。Extraction ReagentBugBuster HT Protein　&&&&&　&&&快速蛋白抽提及核酸降解。适于同时处理多个样品。裂解缓冲液中已提前加入Benzonase核酸酶。加入rLysozyme&溶液可增加抽提效果。Extraction ReagentBugBuster Master Mix　&&&&&　&&&BugBuster Master Mix是BugBuster蛋白抽提试剂、Benzonase核酸酶及rLysozyme溶液的混合配方，用于高效裂解细菌及消化核酸，操作最方便。BugBuster　&　&&&　&&&不含伯胺，抽提的蛋白适合用于下游金属离子依赖的蛋白纯化、固定或交联。加入rLysozyme&溶液及Benzonase&核酸酶增加裂解效果。(primary amine-free)Extraction ReagentBugBuster 10X Protein　&　&&&　&&&BugBuster蛋白抽提试剂的浓缩形式。某些蛋白抽提时需要增加某些特别试剂或缓冲成分以稳定蛋白时，利用浓缩型BugBuster方便地进行稀释、配制。加入rLysozyme&溶液及Benzonase&核酸酶增加裂解效果。Extraction ReagentPopCulture& Reagent&　&&　　　&&&直接裂解培养基中的菌体，不需离心收集菌体。尤其适用于小量、高通量抽提菌体。可加入rLysozyme&溶液及Benzonase&核酸酶增加裂解效果。RoboPop&&　&&　　&&&&96孔形式的蛋白抽提、纯化试剂盒。适用于手动、自动高通量处理多个样品；GST&Tag&-或His&Tag&融合蛋白通过亲和磁珠或过滤纯化。包含rLysozyme&溶液及Benzonase&核酸酶。Purification Kits(magnetic- orfiltration-based)酵母细胞、植物、真菌YeastBuster& Protein　&　&　　　&&&从酵母中高效抽提可溶性蛋白（非变性条件）。可加入0.5 M THP溶液(包Extraction Reagent含)及Benzonase核酸酶用于增加裂解效果。可用于任何规模培养所得细胞　沉淀的裂解。昆虫细胞CytoBuster& Protein　&　&&&　&&&温和裂解细胞，保持抽提蛋白的活性用于后继的检测及纯化。可用于单层或收集的悬浮细胞。Extraction Reagent+****Reportasol&　&　&&&　&&　优化用于最大程度抽提具活性的报告酶（如&-gal, firefly, and Renilla luciferases）。不适用于单层细胞裂解。Extraction Buffer+****RInsect PopCulture&&　&&　　　&&&直接裂解无血清培养基中的昆虫细胞。尤其适用于同时处理多个小体积样品的细胞裂解和表达筛选。可配合亲和树脂用于高通量纯化。Reagent注释：WB: Western Blot **:等电聚焦前必须除去盐R:报告基因检测+：细胞糊或粘壁细胞■ 大肠杆菌蛋白的提取BugBuster&大肠杆菌蛋白提取试剂BugBuster&蛋白抽提试剂用于温和破碎大肠杆菌细胞壁并释放活性蛋白，可以代替传统的机械方法，如弗氏压碎或超声处理等激烈处理，具有简单、快速、低成本等特点!抽提的蛋白可直接用于纯化或其他后续实验。该专利配方采用去污剂混合物，能够使细胞壁穿孔，同时保持蛋白活性。PopCulture&试剂一种浓缩去污剂配方试剂，可以不需要离心收集细胞，直接加入大肠杆菌培养物并高效抽提蛋白。重组蛋白在粗提物中即可分析，也可以加入亲和树脂，洗基质&目的蛋白复合物以去除培养基和细胞残片，接着从基质上将纯化的蛋白洗涤下来。整个培养，抽提和纯化步骤都可以在原来培养管或多孔板里进行。这种直接在培养基体系中进行蛋白检测和纯化操作特别适合蛋白质组学研究和其他高通量操作要求，它使整个过程变得省时而方便。PopCulture&试剂以即用型Tris--缓冲试剂形式提供，室温条件下很稳定。细菌裂解其他相关试剂货号名称规格说明价格70584-3100 ml1×即用型溶液，室温保存95570584-4BugBuster(R) Protein Extraction Reagent1×即用型溶液，室温保存378970921-310 ml10×浓缩型溶液，可根据需要自由控制pH，溶液浓度等。87170921-4Request Info10×浓缩型溶液，可根据需要自由控制pH，溶液浓度等。386270921-5Request Info10×浓缩型溶液，可根据需要自由控制pH，溶液浓度等。722870750-31kit包含提取试剂和核酸酶530470922-3Request Info核酸酶混合于蛋白提取试剂中，使用简便，可应用于高通量蛋白纯化168370922-4Request Info核酸酶混合于蛋白提取试剂中，使用简便，可应用于高通量蛋白纯化656770922-5Request Info核酸酶混合于蛋白提取试剂中，使用简便，可应用于高通量蛋白纯化1140570923-3Request Info无一级胺的配方，用于蛋白抽提中一级胺干扰的情况，如蛋白固定化或交联99270923-4Request Info无一级胺的配方，用于蛋白抽提中一级胺干扰的情况，如蛋白固定化或交联393771370-3Request Info包含有溶菌酶，可以从革兰氏阳性菌和阴性菌中最大限度地获取活性可溶蛋白237471370-4Request Info包含有溶菌酶，可以从革兰氏阳性菌和阴性菌中最大限度地获取活性可溶蛋白745371092-3Request Info64771092-4Request Info273671092-5Request Info816671113-3Request Info884771114-3Request Info491771110-3Request Info49171110-4Request Info116271110-5Request Info470771412-3Request Info96471230-3Request Info169971230-4Request Info5263■ 酵母蛋白的提取YeastBusterTM 蛋白提取试剂用于快速，高效而温和地抽提可溶活性蛋白。采用试剂处理，可以避免激烈的机械处理造成的氧化和热度升高对目的蛋白的破坏作用;蛋白产量高;与Ni-NTA His&Bind 和GST&Bind 亲合纯化方法兼容。这种Novagen的专利配方包括性质温和的去污剂，蛋白稳定试剂，tris磷酸(THP)还原试剂(THP浓缩液单独提供)。这种使用方便的试剂可以避免采用玻璃珠研磨细胞，超声波处理或压榨法等传统机械式操作或用&-1，3-葡聚糖酶裂解酶消化。该试剂已在saccharomyces cerevisiae, pichia pastoris, p.stipidis, schizosaccharomyces pombe 酵母细胞及植物细胞中进行了测试。货号名称规格说明价格71186-3Request Info温和，快速，高效地从酵母细胞抽提蛋白107671186-4Request Info温和，快速，高效地从酵母细胞抽提蛋白107671194-3Request Info还原剂，比DTT更稳定和更有效45171194-4Request Info还原剂，比DTT更稳定和更有效1699■ 哺乳动物细胞和昆虫细胞蛋白的提取CytoBusterTM 蛋白提取试剂CytoBuster&蛋白抽提试剂是优化用于从哺乳动物细胞和昆虫细胞中高效提取可溶性蛋白的去污剂专利配方。CytoBuster&温和的非离子成分可以分离有功能活性的内源或表达蛋白，而不需要诸如超声处理或冻融等二级处理。CytoBuster&配方独特，抽提产物可用于Western Blot、免疫沉淀和激酶/磷酸酶分析。该试剂与蛋白酶抑制剂、激酶抑制剂和磷酸酶抑制剂兼容。室温保存。货号名称规格说明价格71009-3Request Info温和，对目的蛋白无害；高效；使用简单，快速82471009-4Request Info温和，对目的蛋白无害；高效；使用简单，快速312271296-3Request Info专门用于从哺乳动物或昆虫细胞中抽提可溶性蛋白同时确保相关蛋白的磷酸化状态；产物可用于激酶分析、蛋白相互作用分析、免疫印迹等其他分析113371296-4Request Info专门用于从哺乳动物或昆虫细胞中抽提可溶性蛋白同时确保相关蛋白的磷酸化状态；产物可用于激酶分析、蛋白相互作用分析、免疫印迹等其他分析458670909-3Request Info从哺乳动物和昆虫细胞中抽提报告酶（如β-gal, firefly luciferases），并保持其最大活性。79670909-4Request Info从哺乳动物和昆虫细胞中抽提报告酶（如β-gal, firefly luciferases），并保持其最大活性。309371187-3Request Info直接从昆虫细胞培养物中抽提蛋白，不需要离心收集细胞。这种方法能同时获得细胞内的和释放到培养基中的蛋白，纯化蛋白的操作更加简单，与蛋白酶抑制剂兼容。174471187-4Request Info直接从昆虫细胞培养物中抽提蛋白，不需要离心收集细胞。这种方法能同时获得细胞内的和释放到培养基中的蛋白，纯化蛋白的操作更加简单，与蛋白酶抑制剂兼容。685771183-3Request Info从哺乳动物细胞中快速抽提核蛋白组分，尤其适用于凝胶阻滞分析（EMSA）及转录因子检测。2721■ ProteoExtract(R) 系列蛋白抽提试剂盒u ProteoExtract& 系列抽提试剂盒适用范围广、操作简便、结果可靠、重复性好u 所有试剂盒中包括： 蛋白质组学级别超纯试剂、缓冲液非特异性Benzonase&核酸酶，高效降解核酸，降低样品粘稠度S-PEK和P-PEK包含蛋白酶抑制剂混合物ProteoExtract& 全蛋白质组抽提试剂盒C-PEK试剂盒可快速简便地抽提哺乳动物细胞的总蛋白。操作简单快速，一支离心管、两步操作;不需超高速离心;获得的总蛋白组分可直接用于2D电泳，不需额外浓缩;蛋白溶解性好。每个试剂盒可用于20次样品处理。ProteoExtract& 分步蛋白质组抽提试剂盒P-PEK试剂盒可高效标准化地分步抽提哺乳动物细胞蛋白质组的四个组分。根据蛋白质溶解度不同，连续分步抽提，获得四个组分：易溶蛋白、中等可溶蛋白、不可溶蛋白和最难溶蛋白。有利于检测低丰度蛋白;得到的蛋白可直接用于1D、2D电泳、免疫印迹及ELISA等。ProteoExtract& 亚细胞蛋白质组抽提试剂盒全新的S-PEK试剂盒按细胞定位、亚细胞组分不同，利用亚细胞组分在四种选择试剂中的溶解度不同，获得四个组分：细胞质组分、细胞膜组分、细胞核组分和细胞骨架蛋白组分。适用于贴壁培养和悬浮培养的哺乳动物细胞。重复性好，不需超高速离心;所制得的样品适于功能研究。ProteoExtract& S-PEKTM对照抗体试剂盒提供4种对应ProteoExtract& 亚细胞蛋白质组抽提试剂盒获得的亚细胞蛋白组分的标志性蛋白单抗，采用这些单抗作阳性对照做WB，可确定亚细胞蛋白组分分离效果。 盒内每种单抗包装均为15ug，包括anti-HSP90，anti-vimentin，anti-calnexin，anti-PARP。ProteoExtract& 天然膜蛋白抽提试剂盒l 适用于哺乳动物细胞及组织l 3-5 倍富集天然膜蛋白，抽提出的膜蛋白保持生物活性l 可平行处理多个样品产物可用于：单向电泳，双向电泳，免疫共沉淀，免疫印迹，酶活分析，ELISA，膜蛋白的芯片检测及其他分析等ProteoExtract& 跨膜蛋白抽提试剂盒是创新研发的非去污剂化学试剂盒，用于温和、高效地从哺乳动物细胞和组织中抽提跨膜蛋白。可可臭和富集到的蛋白包括从很小的到很大的蛋白，单次跨膜至7次跨膜，甚至一些大的蛋白复合物。盒内含抽提试剂、两种增溶试剂盒蛋白酶抑制剂混合物。适用于下游1&2D电泳、IP、ELISA、WB、酶活分析和质谱。ProteoExtract& 糖肽富集试剂盒采用默克公司专有的ZIC& Glycocature Resin和配套缓冲液从高含量非糖基化多肽背景体系中选择性富集糖肽(高甘露糖型、复杂型和杂合型)，不会因对某些多糖结构的偏爱性而丢失其他多糖。在富集糖肽的同时去除所有非糖肽成分，产物下游可做位点特异性多糖结构及肽段平行质谱分析。ProteoExtract& TiO2磷酸肽富集试剂盒ProteoExtract& SCIMAC磷酸肽富集试剂盒TiO2磷酸肽富集试剂盒采用新型TiO2材料从复杂蛋白混合物中识别各磷酸化分子，即使在大量的非磷酸化肽存在的情况下也能非常特异地选择磷酸肽。SCIMAC磷酸肽富集试剂盒采用串联的2步层析操作(SCX强离子交换树脂和MagPrep Phoshpbind树脂)，优化的操作流程与缓冲液保证磷酸肽获得高产。ProteoExtract& 福尔马林固定组织蛋白抽提试剂盒l 从FF或FFPE组织切片中抽提全长的、可溶性蛋白，重现性好l 成分中不含去污剂l 染色及非染色的组织标本均可抽提得到的蛋白可直接用于Western Blot, ESI LC/MS及MALDI MS分析ProteoExtract&胶原酶套装以套装形式提供4种冻干粉形式的胶原酶(I，II，III和IV型，每种100mg)。本试剂盒与ProteoExtract& 组织解离试剂盒的缓冲液配套使用，便于获得特定样本最优化的解离效果。ProteoExtract& 组织解离试剂盒ProteoExtract& 组织解离试剂盒提供了一系列试剂，可高效地从新鲜组织中分离出活细胞。下游可配套蛋白质抽提试剂盒以实现对新鲜组织蛋白抽提操作。(可与791和444810试剂盒配套使用)。货号名称规格价格KIT1 kit4656539789ProteoExtract Partial Mammalian Proteome Extraction Kit20 次5504KIT1 kit5482KIT1 kit541071771-31 kit4871KIT1 kit494171772-3Request Info5421QIA88ProteoExtract Cytosol/Mitochondria Fractionation Kit100 次501672103-3Request Info4734KIT1 kit12668KIT1 kit4445539721ProteoExtract Formalin Fixed Tissue Kit1 kit71777-3Request Info2165KIT10 Dissociation reactions, 1 g each3789■ 蛋白提取相关试剂-核酸酶Benzonase&核酸酶是来自Serratia marcescens,经基因改进的核酸内切酶。它可以降解所有形式(包括单链、双链和环状)的DNA和RNA而没有蛋白裂解活性，在广泛条件范围具有很高的活性和特异性。Benzonase&核酸酶能迅速水解核酸，从而成为降低黏度，节省时间，增加蛋白产量的理想工具。货号名称规格价格70746-310 ku150570746-42.5 ku50671205-325 ku233170664-310 ku185471206-325 ku4492Copyright (C)
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B-PER GST 融合蛋白纯化试剂盒
B-PER 细菌蛋白质提取试剂
固定用的谷胱甘肽柱子
Wash buffer 1
Wash buffer 2
Reduced glu
保存于四度
B-PER GST 融合蛋白纯化试剂盒可以有效纯化融合了GST标签的重组蛋白，这种重组蛋白表达于细菌中或是baculovirus-infect insect cells. .蛋白质首先由“B-PER 细菌蛋白质提取试剂”提取。 然后，GST融合蛋白 通过 包被了固定化的谷胱甘肽的柱子，而被纯化。
B-PER试剂可以有效地溶解细胞，从而提取可溶的重组蛋白质于BUFFER中，并且最大量最特异的绑定GST融合蛋白到谷胱甘肽柱子上。洗脱了其他非绑定蛋白后，GST融合蛋白才会被洗脱，存在于含有reduced glu 的buffer中。250ml的过夜的细菌培养物中可以纯化得到10ngGST融合蛋白。
重要信息：
为了得到最好的结果。首先进行一个小规模的提取实验来估计表达水平和GST标签蛋白的溶解度：根据标准实验方案表达蛋白，用适当 B-PER试剂溶解细胞，离心得到上清进行SDS-PAGE分析。只有澄清无颗粒的可溶性蛋白提取物才能成功通过亲和柱。
通常，以包涵体形式表达的蛋白不能通过B-PER试剂溶解，虽然 这试剂可以有效地把包涵体从其它细胞组份中纯化出来，从而通过变性剂来溶解包涵体。（B-PER试剂说明书，NO.78248，可从网上得到）通过尿素或胍基溶解的GST融合蛋白包涵体，必须通过透析方法除去变性剂和重新折叠蛋白，只有这样这种亲和方法才能用来进行纯化（GST必须具有功能性才能绑定谷胱甘肽）
谷胱甘肽-GST绑定 是一种特异性很高的反应，通过Wash buffer 1 和Wash buffer2 尽量减少了非特异性绑定。如果有非特异性绑定发生，那么可以考虑增加Wash buffer的盐浓度或是稍微改变PH.。
GST蛋白纯化步骤：
1. 使柱子和buffer到室温
2. 250ml细菌培养物（OD600=1.5-3.0）离心去除上清得到细胞颗粒，若用的冷冻细菌
则溶解至四度再开始提取蛋白
3. 通过涡流或是移液器上下吹打，用10mlB-PER试剂悬浮细胞，直至悬浮均匀，室
温轻柔的摇晃混合物10min
4. 27000*g(14000rpm)离心15min，得到可溶性蛋白，除去不可溶蛋白与细胞碎片。注
意：如果提取物太过粘稠可以加入DNAse 1 来消化过量的DNA.。（这种粘稠就是由于过量的DNA存在而导致的）
5. 转移上请（蛋白提取物）到新管。注意：通常大于99%的可溶性蛋白存在于此上清
中。如果有需要，可以用额外的B-PER试剂进行第二次蛋白提取从而得到剩下的
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