基因重组蛋白包涵体的分离和复性；1.重组蛋白的生产；生物技术地发展，特别是基因重组技术、蛋白质组学的；基因重组技术中需要考虑的有以下因素：；（1）宿主细胞的选择；（2）质粒的选择；（3）基因调控；宿主细胞包括细菌（大肠杆菌E.coli），酵母（；表各种宿主细胞的比较[1]；表达质粒对不同的宿主细胞也有很多不同质粒；融合基因表达方法对蛋白质的分离纯化十分有效，
基因重组蛋白包涵体的分离和复性
1. 重组蛋白的生产
生物技术地发展，特别是基因重组技术、蛋白质组学的发展，使人们可以生产许多过去无法生产的基因重组蛋白，如白细胞介素，干扰素等。开辟了一个新的领域。
基因重组技术中需要考虑的有以下因素：
（1） 宿主细胞的选择
（2） 质粒的选择
（3） 基因调控
宿主细胞包括细菌（大肠杆菌E.coli），酵母（如酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae），真菌（如黑曲霉Aspergillus sp）,昆虫细胞（Baculoviru vector），哺乳动物细胞等。各种宿主细胞的比较如表所示：
表 各种宿主细胞的比较[1]
表达质粒对不同的宿主细胞也有很多不同质粒。对质粒可分为3种：简单表达；分泌表达和融合表达。如对原核细胞融合基因的表达，质粒有pGEX-2T,pGEX-3X,pMC1871等。对原核表达的质粒有pTrc99A,pKK223-3等。对真核细胞表达的质粒有pSVK3,pBPV,pSVL,pCH110等。
融合基因表达方法对蛋白质的分离纯化十分有效，它可以将一个亲和尾如金属离子亲和作用的6个组氨酸或将可表达Protein A的基因融合加入表达蛋白质的基因中，表达的蛋白质含有这些基团，使后续的分离纯化工艺简化。融合蛋白质的优点核缺点如表所示：
除了融合质粒外，融合基因也是经常采用，如GST融合基因，可以表达和谷胱甘肽－S-转移酶融合的蛋白质，而这个融合蛋白可以很方便地用谷胱甘肽Sepharose 4B层析介质纯化。
2. 包涵体地分离纯化和蛋白质复性
在外源基因表达系统中，大肠杆菌以其周期短、操作方便、遗传背景较清楚等优点而得到了广泛的应用，多重真核基因已成功的在大肠杆菌中获得高效表达。但是由于外源蛋白常以非活性方式在细菌细胞质中聚集成不溶性的包涵体（inclusion bodies），使利用大肠杆菌生产活性蛋白受到了一定的限制。而且虽然目前所观察到的包涵体大多形成于大肠杆菌中，但有证据显示在其他表达系统中，当蛋白表达量高至与大肠杆菌中相当时，也有形成包涵体的趋势。虽然包涵体由于其不溶性易于其他可溶性蛋白分离，有利于下游的分离，但是这些非活性蛋白必须经过变性、复性等处理后才能部分恢复其天然活性。因而研究包涵体蛋白的复性对于大规模生产基因工程重组蛋白是十分必要的。
2． 1包涵体形成的机制及其影响因素
2.1.1涵体形成的机制
包涵体在相差显微镜下常有折光性，故又称“折光小体”（refractile bodies）。包涵体的大小可以达到微米级，在电镜下观察到的包涵体的形态依其在细胞中的位置不同而有较大的差异，如细胞质中的包涵体形状规则，有清晰的边界，而周质间隙中的包涵体则为无定形蛋白聚集物。由于其不溶性，用差速离心机可将包涵体与其他可溶性蛋白分开。
形成包涵体，可以使重组蛋白免受蛋白水解作用，也使宿主细胞免受重组蛋白带来的毒性作用。关于包涵体的形成，可以认为是重组蛋白在折叠过程中由于部分折叠的中间体之间的特异性错误聚合而发生聚集而形成的；也就是说包涵体不是由成熟的天然态或完全解链的
蛋白形成的。这一假设是建立在蛋白质折叠的基础上的。
蛋白质的折叠可以分为两步：
U是指完全去折叠的状态，I是指折叠中间体（也称融球态 molten globule state），N是指天然的成熟的状态。第一步为去折叠态U向折叠中间体I的转化，在毫秒级时间内快速形成特异性二级结构。第二步为限速反应，为中间体I形成特异性空间结构而达到天然状态N的过程，这是一个慢反应与协同作用的过程。第二步反应伴随着大量的热焓及热容的变化，表明与天然态相比，有较多的疏水基团暴露于中间体分子表面，因而推测这些疏水性区域之间的相互作用是促进分子发生聚集的主要原因。这种非生产性（non-productive）反应可以在体外得到控制，从而增加具有天然构象的蛋白的生成。
Ajit Sadana提出了以下包涵体的形成模型[2]：
?IPf←→IPm←→天然态
这里，IPf为可溶的、部分折叠的早期中间体，IPm未可形成单体的中间体，IPf*为形成包涵体的形式。可以看出，IPf既可以进入产物生成途径，又可以进入包涵体形成途径，而这两条途径的选择则受诸如蛋白性质、温度、伴随蛋白等条件的影响，而且，重组蛋白与宿主的异源性可能对折叠中间物的聚集有影响。异源性可能会使聚集反应的级数变高（大于二级），从而使聚集反应的速度大于正确折叠反应的速度（一级反应）。
2.1.2包涵体形成影响因素[3]
2. 1.2．1 蛋白性质对包涵体形成影响
研究表明，肽链的氨基酸残基组成对包涵体的形成影响很大。脯氨酸含量低的蛋白质较易溶解，这是由于脯氨酸、天冬氨酸、甘氨酸等氨基酸残基在肽链中有较强的形成转角的趋势，而转角是蛋白折叠过程中最难形成的结构，其形成过程是蛋白折叠的限速反应，所以这些氨基酸的含量对蛋白形成包涵体的影响是显而易见的。另外，带电荷氨基酸残基较多时容易形成可溶性蛋白。电荷平均数和转角形成残基含量与包涵体的形成有强相关性，即电荷平均数小，转角形成残基含量较高的蛋白有强烈的形成包涵体的趋势。
2.1．2．2温度的影响
外源蛋白在高温下生长的细菌容易包涵体，在低温下则容易以溶解形式合成。这通过对噬菌体P22尾棘蛋白的研究得到了充分的证明。Sturtevant等人在实验中发现，在细菌生长温度较高（37-42℃）时，温度敏感突变体的肽链不能形成天然的尾棘蛋白，而在较低温度（25-30℃）下则能折叠成天然的、有活性的蛋白，而且如果将在高温下合成的肽链及时的移至低温也可使之重新进入天然产物生成途径。
2.1．2．3分子伴侣的影响
分子伴侣是参与协助新生肽链体内折叠的一类蛋白质，包括四个家族：Nucleoplasimin，Chaperonin，Stress-90。分子伴侣对新生肽链折叠的促进作用可能有两方面：一方面是使前体蛋白处于一种松散折叠的构象而具有跨膜、折叠或组装能力。另一方面是在肽链折叠过程中通过与折叠中间体上暴露的疏水区域结合而防止肽链分子间发生反应，阻碍肽链进入错误折叠途径。因此，为了克服包涵体的形成，可采用表达外源基因的同时，共表达分子伴侣的策略。例如，GroES和GroEL可显著提高D-核酮糖-1，5-二磷酸加氧酶/羧化酶（rubisco）
的折叠、组装效率，从而提高可溶性重组蛋白的产量；也能提高可溶性乙酰辅酶A脱氢酶的产量和组装效率；对可溶性β-葡萄糖苷酶的表达也有提高。也有研究证明，共表达分子伴侣没有明显效果，这是由于分子伴侣对“底物蛋白”具有一定的特异性，说明共表达分子伴侣可能只在某些情况下有效，其经验性很强。
2.2 包涵体的提取、溶解与纯化
2.2．1 包涵体的提取：
含有包涵体的细胞通常用机械破碎（如French pressing、高压匀浆、超声波破碎、超声波结合溶菌酶破碎以及反复冻融）。细胞破碎后经过g离心15分钟即可得到包涵体沉淀。
2.2．2 包涵体的洗涤：
包涵体除了含有目标蛋白外，还含有其他杂质，如RNA聚合酶的四个亚基，膜蛋白、质粒DNA和其他酶，这些杂质在复性过程中可能会诱导聚集。实验也证实这些杂质对目标蛋白的复性是有影响的。因此对包涵体的洗涤是必要的。对包涵体用Tris-HCl缓冲液反复洗涤几次，缓冲液通常含有Triton-X100、脱氧胆酸盐、尿素、PMSF等。对包涵体中含的杂蛋白的洗涤最高可采用5M的尿素。
2.2．3 包涵体的溶解
包涵体的溶解一般采用强的变性剂，使蛋白溶解并去折叠，如5-6M的盐酸胍或6-8M的尿素，同时还要加入还原剂，打开错配的二硫键，如二硫苏糖醇（DTT）、2-巯基乙醇、DET或半胱氨酸等，pH一般维持在8左右，这样可使蛋白保持去折叠、还原的状态。另外，加入蛋白酶抑制剂PMSF（苯基甲基磺酰氟）防止蛋白水解。
对于某些蛋白来说，特殊溶解变性条件会提高正确折叠的产率在重组BDNF（脑神经营养因子）的包涵体复性研究中，BDNF在用尿素溶解、DTT还原后，会自身或与脂质结合形成复合物，在纯化时很难吸附到阴离子交换树脂上。为了使BDNF从上述复合物上解离下来，对半胱氨酸残基进行了可逆的衍生作用。用TAPS-sulphonate（trimethylammonioproplymethanethiosulphonate）获得了好的解离效果，超过50%的BDNF中可以吸附到阳离子交换树脂上。TAPS-sulphonate可以快速安全的修饰半胱氨酸残基，使其不能相互交联形成分子内的二硫键，同时由于具有四分之一氨基三甲基化氨基酸基团的性质，其所带的正电荷能有效的降低分子间的相互作用，提高被衍生化的蛋白的溶解性。
随着越来越多的实验证明，一些蛋白质在变性条件下仍然具有有序的结构而非随意的卷曲，所以将蛋白质完全去折叠和还原并非是最有效的方法。在对绵羊生长激素（oGH）的包涵体复性研究中，研究者认为大肠杆菌产生的包涵体中通常有具有类似天然二级结构的多肽紧密压缩而成，如果包涵体中的蛋白质被溶解但保留其二级结构，总的蛋白活性酒会提高。为此，他们采用2M尿素缓冲液在pH12条件下溶解包涵体，结果包涵体中90%的r-oGH被溶解。在另一项对重组凝乳酶原（prochymosin）的研究中，研究者发现凝乳酶原的六个半胱氨酸残基中，N端的两个Cys没有与别的Cys发生错配，而是被限制在天然的二级结构中，因此在溶解时没有必要加入还原剂。如果把部分还原的凝乳酶原转变成完全还原的状态，随机的卷曲取代了天然的二级结构，二硫键错配的几率会增加，从而降低复性率。另外还发现在pH8条件下（8M尿素），包涵体不能全部溶解，而把pH升高到11显著提高了溶解性，复性率从20%提高到了40%。
2.2．4 包涵体的纯化
一般认为蛋白质的折叠不受其他蛋白的干扰，但是实验表明如果在包涵体溶解后进一步纯化会提高复性率。这可能是因为未纯化的的包涵体由于还残留有异常的三级结构和四级结构，可能会对复性率产生影响。在对重组人巨噬细胞集落因子的复性研究发现，在相同的复性条件下，经过纯化的包涵体最后形成二聚体的得率为93%，而未经过纯化的包涵体最后
的得率为65%。
包涵体溶解后可以通过膜过滤、RPLC、RP-HPLC、凝胶过滤、离子交换层析或金属亲和层析等方法实现，但要注意维持蛋白质变性、还原的状态。包涵体的纯化也可以在洗涤后先进行SDS-PAGE或离心，然后进行凝胶过滤来实现。
2.3 重组蛋白得体外复性
2.3．1 蛋白在体外的折叠机理：
变性蛋白的再折叠同时受热力学和动力学的控制。与在体内的情况一样蛋白质在体外的折叠也不是一部从完全去折叠的状态折叠成天然的分子的，而是经过一系列中间态逐步完成的。为了便于分析，在体外蛋白质的折叠过程可以用一个简化的模型来表示： Intermediate
从变性态到折叠中间态是一个非常短暂的过程，在极短的时间内其整个结构坍塌形成折叠中间体，随后再缓慢的折叠成天然的构象，后一步所需的时间比前一步要高出几个数量级。因此，蛋白在体外折叠的时间很长，从十几个小时到上百个小时不等。
蛋白在折叠过程中发生聚集的机理是因为折叠中间态（融球态molten globule sate）是一个易变的结构，虽然它形态上与天然态N一样紧密，二级结构已经形成，但还没有如天然态N的紧密的侧链的叠加，三维结构尚未形成，氨基酸侧链还有很大的摆动性。由于折叠中间态有更多的疏水残基暴露于分子表面，因而通过这些疏水残基的相互作用而发生聚集，这一过程是不可逆的。
通过对P22尾刺蛋白的研究发现，聚集既不是以单体分子逐一加入的方式也不是先形成一个母核然后再迅速扩增形成，而是聚合体以集簇对集簇的方式聚合（cluster-cluster polymerization）形成更大的聚集体。这与实验中观察到的随时间的延长，聚集体的大小而不是浓度在变大相符合。
2.3．2 蛋白质在体外再折叠的方法
绝大多数蛋白质在体外通过去除变性剂就可以自发的再折叠。通常去除变性剂的方法有稀释、透析和透过滤。稀释法就是直接将变性的蛋白溶液稀释到复性缓冲液中，这是最简便的一种方法。稀释可采用一步稀释或梯度稀释的方法。稀释法的缺点是处理的体积大，蛋白质浓度很低，一般在10-100ug/ml，而且变性剂浓度降低会导致聚集。透析法是将变性蛋白溶液对复性缓冲液进行透析。对工业规模的生产来讲，透析时间长而且易发生聚集。透过滤即超滤是通过跨膜的压力差去除变性剂，耗时郊少，更具有实用性。但是，膜会媳妇蛋白而造成污染和堵塞，使压力下降，并且复性率降低。
2.3．3 蛋白质体外折叠的影响因素[3]
2.3．3．1 浓度
在蛋白质再折叠过程中，正确折叠与聚集相互竞争。前者是分子内一级反应，后者是分子间的二级或高级反应。因此，增加蛋白质的浓度有利于聚集的进行。为了抑制聚集反应，应当尽量降低折叠中间体的浓度，减少其分子间的相互作用，一般在较低的浓度下（10-100ug/ml）进行复性。但是如果用于工业生产的话，过低的浓度需要庞大的设备并消耗大量体积的缓冲液，这无疑会增加生产成本。以为引起聚集的只是折叠中间体而非天然的蛋白，所以可以采用分批或连续进料的方式进行复性。采用这种方法需要控制好变性蛋白的加入的时间间隔或速度，以保证折叠中间体一直处于低浓度。Nicholas Kotlarski等人还设计出了用于工业规模生产的分批式、分批进料式和连续搅拌釜式反应器（CSTR）。通过模拟计算和分析，认为分批进料式和连续搅拌釜式反应器的经济性比较好。
2.3.3.2温度
蛋白质的复性一般在室温下进行，温度过高（&40℃）蛋白质的聚集将十分严重。低温
三亿文库包含各类专业文献、中学教育、幼儿教育、小学教育、外语学习资料、各类资格考试、文学作品欣赏、专业论文、10第十章
基因重组蛋白包涵体的分离和复性等内容。　
　含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、 质粒DNA和其 它...在包涵体的溶解和复 性过程中可导致重组蛋白质的...另外,对于含有半胱氨酸的蛋白质,分离的包涵体中通常... 　第八章 工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物...就可以与可溶性蛋白分离,有利于分离纯化; 包涵体对...的蛋白质其复性方法也各不相同, 因此基因重组蛋白... 　等在复性 过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率...1.3 包涵体破菌,分离,洗涤及溶解 1.3.1 基因工程菌发酵液,经离心浓缩后,... 　包涵体复性方法:一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点:活性蛋白质的回收率高;正确复性的产物易于与 错误折叠蛋白质分离;折叠复性后应得到浓度较高... 　基因重组蛋白质的体外复性摘要 基因重组蛋白在大肠杆菌中表达时,由于表达量高,...包涵体的分离及溶解 对于生物制药工业来说,包涵体的形成也是有利的,不仅可获得高... 　复性产 物易于与错误折叠蛋白质分离; 折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白;折叠...包涵体中主要含有重组蛋白, 但也有一些杂质, 如一些外膜蛋白、质粒 DNA 等,这些... 　并进行蛋白质的复性.包涵体的 主要成分就是表达产物...DNA,脂类及糖类物质,所以分离包涵体后,还要采用适当...1. 包涵体的形成 重组蛋白不论在原核细胞还是真核... 　包涵体蛋白的纯化和复性_医药卫生_专业资料。包涵体蛋白...未加 IPTG 和加 IPTG 诱导 的重组子全提取物、...包涵体蛋白的分离和色谱... 6页 免费 包涵体蛋白质... 　IFN-α 重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性一、 表达产物处理 1、 表达菌液 8000rpm 4℃离心 10min 2、 菌体沉淀按 10:1(菌重 5g,加 50ml)裂解缓冲液,冰...pTrc99a大肠杆菌表达载体说明_百度文库
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不同免疫佐剂对丙肝核酸疫苗效果
发布时间： 12:27
【摘要】 目的：观察不同佐剂对hcv?dna疫苗效果的影响。方法：雌性balb/c小鼠分别用脂质体ddab/epc和dc?chol/dope、montanide isa 720和氢氧化铝为佐剂的hcv?dna疫苗免疫3次，elispot法观察脾淋巴细胞受hcv核心、e2、e1/e2、ns3和ns5b蛋白刺激后细胞因子的产生。结果：ddab/epc组产生ifn?γ较多，在大部分情况下，显著高于其它组。该组il?2的产生也显著高于其它4组。该组il?4的产生，在某些情况下也高于其它组。用ns5b刺激，氢氧化铝组il?4的产生显著高于其它4组(p&0.05)。裸dna和两种脂质体组ifn?γ的产生高于il?4，而montanide和氢氧化铝组il?4的产生高于ifn?γ。结论：在4种佐剂中，ddab/epc效果最好，montanide和氢氧化铝可将dna疫苗th1为主的免疫特性转换为以th2为主。 【关键词】 核酸疫苗 丙型肝炎病毒 免疫佐剂　　immunological effects of different adjuvants on hcv?dna vaccine　　jin bo, richard yan?hui wang，cheng liu?fang, qiu qi, james wai?kuo shih.　　department of digestive diseases, naval general hospital, beijing 100037, china　　［abstract］ objective:the immunological effects of hcv?dna vaccine with different adjuvants were detected by elispot in mice.methods:female balb/c mice were primed with naked hcv?dna, hcv?dna encapsulated by liposome ddab/epc or dc?chol/dope, hcv?dna mixed with montanide isa 720 or aluminum hydroxide, respectively, and boosted twice accordingly in a four?week interval. cytokine production by splenocytes was assessed by elispot.results:in most cases, splenocytes from mice vaccinated with ddab/epc liposome produced more ifn?γ. these splenocytes also have significant higher il?2 production compared with the other groups. in expansion with ns5b, splenocytes from alum group have significance in il?4 production compared with other groups. the profile of cytokine production revealed that the inf?γ overwhelmed il?4 in naked dna, ddab/epc, and dc?chol/dope groups while il?4 surmounted ifn?γ in alum and montanide groups.conclusion:encapsulation with liposome ddab/epc has the strongest adjuvant effect in inducing th1 dominated immunity. alum and montanide can convert the th1 nature of dna vaccine to th2?biased immunity. 　　［key words］ dna vaccines；hepatitis c virus(hcv)；immunologic adjuvants 　　丙型肝炎病毒(hepatitis c virus, hcv)感染是一个严重的全球性健康问题。据世界卫生组织在1999年的调查结果表明，全世界有大约一亿七千万人感染丙型肝炎病毒，占全世界人口总数的3%［1］。 　　在丙型肝炎病毒感染后，虽然机体可以产生很强的体液免疫反应，但仍有75%～85%的急性丙型肝炎病毒感染者不能清除病毒而成为慢性感染者。抗?hcv的中和抗体虽然在一定情况下有助于病毒的清除, 但由于丙型肝炎病毒在患者体内可以不断发生演变，从而产生对中和性抗体有抗性的突变株。　　因此, 虽然有hcv的中和抗体存在，但细胞免疫反应在防止和清除hcv感染过程中显得更为重要。因此，诱导产生针对hcv的特异性细胞免疫反应就不可避免地成为hcv疫苗研究的重点［2］。 　　dna疫苗可诱导以i型辅助性t细胞(t helper cell type ⅰ, th1)介导的细胞免疫。为观察不同类型免疫佐剂对hcv?dna疫苗免疫效果的影响，我们比较了小鼠接种几种不同佐剂辅佐的hcv?dna疫苗后免疫反应的改变。　　1 材料与方法　　1.1 hcv?dna重组质粒的构建 将hcv1a型h株核心、e1、e2蛋白基因(1～746位氨基酸，核酸342～2 579)插入pvax1质粒(美国invitrogen corp.)bamh ⅰ限制酶切点，转化大肠杆菌增殖，用endofree plasmid giga kit(美国qiagen)纯化。将重组质粒转染cho?k1细胞，裂解细胞做western blot，确定可表达hcv核心和e1、e2蛋白。hcv?ns3、hcv?ns5b重组质粒的构建方法同上，插入片段分别为hcv?ns3基因(1 027～1 657位氨基酸，核酸3 420～5 312)和hcv?ns5b基因(2 421～3 011位氨基酸，核酸7 602～9 374)。　　1.2 hcv重组蛋白抗原的制备　　1.2.1 hcv?ns3重组蛋白［3］ 将hcv?ns3基因(1 027～1 657位氨基酸，核酸3 420～5 312)插入pqe?11质粒(美国qiagen)的限制性内切酶bamh ⅰ位点，转化大肠杆菌dh5αf’iq，western blot选择阳性克隆增殖。溶菌酶溶解细菌，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化蛋白(分子量69 000)，鲎实验检测内毒素含量&0.02 eu/μg。同样方法表达hcv?ns5b基因(2 421～3 011位氨基酸，核酸位点7 602～9 374)和hcv?e2基因(384～746位氨基酸，核酸1 491～2 579)，制备hcv?ns5b重组蛋白(67 000)及截短型(truncated)hcv?e2重组蛋白。虽然插入hcv?e2全长基因，且加入蛋白酶抑制剂，但表达的hcv?e2蛋白仍为29 000而非40 000，因此该蛋白为截短型。　　1.2.2 hcv核心蛋白［4］ hcv核心基因(1～164位氨基酸)插入ptrc99a质粒(美国pharmacia)nco ⅰ位点，转化dh5α株大肠杆菌表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化(分子量18 000)。　　1.2.3 hcv?e1/e2重组蛋白 用bac?to?bac baculovirus expression systems(美国invitrogen)。hcv核心、e1和e2基因(1～746位氨基酸，核酸342～2 579)插入供体pfastbac1质粒，转化大肠杆菌dh10bac，供体质粒将目的基因转位至菌体中的bacmid质粒，提取重组bacmid质粒转染sf9细胞株，提取培养液中重组杆状病毒(baculovirus)用于感染sf9细胞。溶解细胞，离心取上清过galanthus nivalis lectin亲和柱层析纯化hcv e1/e2蛋白，过滤除菌。　　1.3 佐剂与hcv?dna疫苗的混合　　1.3.1 ddab/epc脂质体?dna的制备［3］ 将3.96 μmol溴化二甲基二八癸胺(dimethyldioctadecylammonium，ddab)与3.96 μmol卵黄卵磷脂(egg yolk phosphatidylcholine, epc)(美国avanti polar lipids)氯仿溶液混合，氮气流吹干，加入0.6 ml注射用水，超声匀浆，再加入dna溶液(1 mg/ml)0.6 ml，充分震荡后于-70℃过夜。次日离心冻干，加入0.1×pbs 60 μl水合1小时，再加入1×pbs 600 μl混匀。　　1.3.2 dc?chol/dope脂质体?dna的制备 将0.72 μmol l?α?磷脂酰乙醇胺(l?α?phosphatidylethanolamine, dope)与1.26 μmol和氢氧化胆甾醇基3β?n?二甲胺乙基氨基甲酸［cholesteryl 3β?n?(dimethylaminoethyl) carbamate hydrochloride, dc?chol］(美国sigma)氯仿溶液混合，氮气流吹干，加入0.6 ml注射用水，超声匀浆，再加入dna溶液(1 mg/ml)0.6 ml，充分震荡后于-70℃过夜。次日离心冻干，加入0.1×pbs 60 μl再水合1小时，再加入1×pbs 600 μl混匀。　　1.3.3 氢氧化铝dna混悬液 将0.35 ml的imject alum(含45 mg/ml氢氧化铝和40 mg/ml氢氧化镁)(美国pierce)逐滴加入3 mg/ml的dna溶液0.35 ml中，同时震荡，然后持续震荡30分钟。　　1.3.4 montanide isa 720与dna混悬液 将0.35 ml的montanide isa 720(法国seppic)逐滴加入3 mg/ml的dna溶液0.35 ml中，同时震荡，然后持续震荡30分钟。　　1.3.5 裸dna溶液 将dna溶于1×pbs中，调整dna浓度为1.5 mg/ml。　　1.4 动物免疫 2月龄balb/c雌性小鼠50只(美国harlan)，随机分为10组，每组5只，按所用免疫佐剂分为hcv?dna疫苗组和载体质粒dna对照组，见表1。疫苗组每鼠接种的dna由hcv结构区dna、ns3dna和ns5bdna各100 μg混合, 对照组每鼠接种pvax1?5质粒dna 300 μg。初次免疫后间隔4周再次免疫，再间隔3周行分析前免疫，1周后处死。免疫方法为肌肉注射。　　表1 动物分组（略）　　tab.1 animal group　　1.5 脾淋巴细胞分离及elispot测定 脾淋巴细胞分泌il?4、il?2和ifn?γ的斑点形成单位(spot forming unit, sfu)数量用elispot方法检测。小鼠处死后用70%乙醇浸泡灭菌，用无菌剪刀顺序剪开皮肤、肌肉和腹膜，取出脾脏，放入细胞过滤器(cell strainer，100 mol/l nylon, bd labware, bedford, ma)，将细胞过滤器放入已加入5 ml完全rpmi1640培养基的6孔培养板内，用3 ml注射器的内芯在细胞过滤器上将脾脏研碎至无肉眼可见的组织块，用5 ml完全rpmi1640培养基冲洗研磨棒及细胞过滤器，吹打孔内细胞形成均匀的细胞悬液，然后缓慢加入已加有5 ml ficoll?paque plus(amersham pharmacia biotech ab, sweden)的15 ml离心管内，1 500 r/min离心20分钟，吸取淋巴细胞层，用10 ml完全rpmi1640培养基洗涤细胞2次，然后行细胞计数，调整细胞浓度至1×107 ml-1。在24孔培养板上，每孔加入10 μg/ml的rns3抗原溶液0.9 ml，然后加入淋巴细胞悬液0.6 ml，细胞终浓度为4×106 ml-1。将培养板放入co2孵箱，在5%co2、99%湿度、37℃条件下培养40小时。elispot反应板采用以孔径0.45 μm的混合纤维素覆底的maha s45型96孔过滤平板(millipore, bedford, ma)。elispot反应板每孔用50 μl浓度为10 μg/ml纯化的大鼠抗小鼠il?4或大鼠抗小鼠il?2或大鼠抗小鼠ifn?γ抗体(bd pharmingen)包被过夜，次日用5%小牛血清白蛋白100 μl/孔再包被90分钟，用pbs洗板2遍，然后每孔加入经抗原刺激培养后的淋巴细胞悬液100 μl（4×105个细胞），放入co2孵箱内继续培养过夜，使细胞产生il?4、il?2或ifn?γ，并被膜上的相应抗体俘获。第3天弃去细胞悬液，用pbs洗板6遍后，加入50 μl浓度为1 μg/ml的生物素标记的大鼠抗小鼠il?4或il?2或ifn?γ抗体(bd pharmingen)，37℃培养90分钟，以检测被包被抗体所俘获的细胞因子。弃去抗体后，再用pbs洗板6遍，然后加入1∶4 000稀释的sa?hrp 100 μl，37℃培养90分钟，再经pbs洗板后，加入opti?4cn过氧化物酶底物(bio?rad laboratories, hercules, ca)显色30分钟，自来水洗板终止反应。反应板晾干后，用aid elispot reader system(aid autoimmun diagnostika gmbh, germany)以ifn?γ系统为标准，读取每孔的斑点数。所有的实验均有4个复孔，以4个孔的sfu平均值减去相应载体组sfu平均值作为特异性的sfu数值。　　1.6 处理 用stata 7.0统计进行单因素方差分析，并进行bartlett方差齐性检验，如方差不齐，则采用wilcoxon?mann?whitney秩和检验。p&0.05为相差显著。　　2 结果　　2.1 小鼠脾淋巴细胞对不同抗原的反应 见表2。　　2.1.1 对hcv?ns5b的免疫反应 ddab/epc组ifn?γ的分泌显著高于montanide组(p&0.05)，il?2的分泌显著高于montanide组、氢氧化铝组和dc?chol/dope组(p&0.05或p&0.01)，提示ddab/epc可诱导较强的细胞免疫。氢氧化铝组il?4的分泌显著高于其它4组(均p&0.05)，提示氢氧化铝与其它4种疫苗相比，可诱导更强的体液免疫反应。　　2.1.2 对hcv?ns3的免疫反应 ddab/epc组ifn?γ的分泌显著高于montanide组和dc?chol/dope组(均p&0.05)，il?2的分泌显著高于其它4组(均p&0.001)，而il?4的分泌显著高于裸dna组(p&0.05)。　　2.1.3 对hcv?e1/e2的免疫反应 ddab/epc组ifn?γ的分泌显著高于裸dna组、氢氧化铝组和dc?chol/dope组(均p&0.05)，il?2和il?4的分泌显著高于其它4组(p&0.01或p&0.05)。　　2.1.4 对hcv?e2的免疫反应 ddab/epc组ifn?γ和il?2的分泌显著高于其它4组(均p&0.01)，il?4的分泌显著高于裸dna组和dc?chol/dope组(均p&0.01)。　　2.1.5 对hcv核心蛋白的免疫反应 ddab/epc组ifn?γ和il?2的分泌显著高于其它4组(p&0.001)，il?4的分泌显著高于裸dna组(p&0.05)；dc?chol/dope组ifn?γ的分泌显著高于montanide组和氢氧化铝组(均p&0.05)，il?2的分泌显著高于montanide组(p&0.05)。　　图1 不同抗原刺激后，细胞因子il?4/ifn?γ的产生（略）　　fig.1 il?4/ifn?γ production profile upon different antigen expansion　　表2 经hcv抗原刺激后elispot检测细胞因子的产生（略）　　tab.2 cytokines production upon hcv antigen expansion detected by elispot　　note:compared with ddab/epc, 1) p&0.05;compared with ddab/epc, 2) p&0.01;compared with imject alum, 3) p&0.05;compared with dc?chol/dope, 4) p&0.05. data expressed as the sfu of immunized mice minus the mean sfu value of the corresponding control group. the mean value of the control group(unimmunized) was presented in parenthesis. sfu: spot forming unit.　　2.2 不同佐剂对dna疫苗免疫反应特性的影响 见图1。经过5种不同的hcv抗原刺激后，裸dna组和ddab/epc组及dc?chol/dope组ifn?γ的分泌均高于il?4，表明这3种疫苗免疫后小鼠免疫反应是以th1为主；而montanide组和氢氧化铝组，il?4的分泌均高于ifn?γ，提示这两种疫苗诱导的免疫反应是以th2为主。　　3 讨论 　　将编码抗原的dna分子直接注射到体内，dna分子可被细胞摄取，进入细胞核转染成为核内游离基因，进而表达抗原分子，诱导体液和细胞免疫［5］。裸dna疫苗是将dna直接注射到肌肉，免疫效果依赖于肌细胞摄取dna的能力，有些dna分子可被局部抗原提呈细胞(antigen presenting cells, apc)吞噬，也有些进入淋巴系统，被局部淋巴结内的apc吞噬。研究表明，被apc摄入的dna分子，更有利于诱导免疫反应［6］。 　　裸dna疫苗免疫效果不理想的主要原因之一是dna分子在进入细胞前被间质核糖核酸酶所降解。脂质体的外层脂质可以保护内部的dna分子免受核糖核酸酶所降解。另外由于dna分子和细胞膜都带负电荷，静电的排斥作用也不利于dna进入细胞。阳离子脂质体由于其正电性，易与细胞膜接近，有利于dna进入细胞，更重要的是阳离子脂质体可能主要被apc摄取，诱导更强的免疫反应［7］。本实验结果表明，小鼠接种阳离子脂质体ddab/epc包被hcv?dna疫苗后，脾淋巴细胞在受到hcv核心、e1/e2或e2抗原刺激后，产生的ifn? γ显著多于裸dna组及其它3种佐剂组。受ns3刺激后，ifn? γ虽较裸dna组有所升高，但无统计学意义。我们前期研究用ddab/epc包被ns3 dna免疫小鼠后，ifn? γ的产生显著高于裸dna组［3］。其原因可能是不同序列dna混合后，诱导的免疫反应发生变化。dc?chol是一种阳离子性的胆固醇衍生物，它与中性脂质dope形成阳离子脂质体dc?chol/dope作为免疫佐剂，可提高单价分割灭活流感疫苗的免疫功效，小鼠皮下接种可诱导以th1为主的免疫反应［8］。用dc?chol/dope/epc脂质体作为流感病毒核蛋白dna疫苗佐剂，可显著提高疫苗的体液免疫活性［9］。我们的结果表明，dc?chol/dope脂质体对本实验的hcv?dna疫苗无明显佐剂效应，仅在受hcv核心抗原刺激后，产生的ifn?γ多于montanide isa 720或氢氧化铝组。 　　montanide为油包水乳剂型免疫佐剂，有montanide isa 720和51两型。montanide isa 720是由植物油和表面活性剂(单油酸二缩甘露醇)构成［10］。这种结构可延缓抗原释放，乳剂可引起局部免疫反应，使apc聚集，表面活性剂可与细胞膜作用，有利于apc摄取抗原，也可能与toll蛋白样受体作用，发挥免疫佐剂功能。montanide isa 720可增强寡核苷酸cpg和多肽疫苗诱导的细胞免疫，效果优于福氏佐剂［11，12］。本实验表明，小鼠接种以montanide isa 720为佐剂的hcv?dna疫苗，脾淋巴细胞受hcv?ns3或ns5b抗原刺激后，细胞因子的产生，尽管统计学上无显著性，但数值上明显低于接种裸dna疫苗鼠，提示montanide isa 720对dna疫苗无免疫辅佐效应，相反由于其制剂的高黏稠性，可能会延缓dna进入细胞表达，对dna疫苗可能会有抑制作用。另外，无论是用hcv结构抗原还是非结构抗原刺激， montanide组小鼠脾淋巴细胞产生的ifn?γ均低于il?4，说明montanide isa 720还会将dna疫苗th1免疫反应为主的特性转换为以th2免疫反应为主。 　　铝制剂作为免疫佐剂用于临床已有50多年的历史。水溶性抗原可在铝凝胶中缓慢释放，延长抗原与免疫系统的作用时间，还可与补体、酸性粒细胞和巨噬细胞相互作用，激活apc，增加apc摄取抗原的效率，为增强th2免疫反应的佐剂［13］。我们的结果表明，小鼠接种铝佐剂hcv?dna疫苗，受hcv?ns5b刺激时，淋巴细胞产生的il?4显著高于其它佐剂或裸dna组，提示在此种情况下，氢氧化铝可诱导较其它佐剂更强的th2反应。另外，接受铝佐剂hcv?dna疫苗的小鼠淋巴细胞受抗原刺激后，il?4的产生明显高于ifn?γ，说明铝佐剂可使dna疫苗的免疫反应从th1为主转为th2为主。这与peng等［14］报道相似。 　　因此，根据我们的实验结果，ddab/epc对hcv?dna疫苗的辅佐作用最好，可增强dna疫苗诱导的th1免疫反应，而dc?chol/dope辅佐作用不明显；氢氧化铝似可增强dna疫苗诱导的th2免疫反应，而montanide isa 720似可减弱dna疫苗免疫反应；氢氧化铝和montanide isa 720可改变dna疫苗的免疫反应特性，使其由th1为主转为th2为主。【】 　　1 who and the viral hepatitis prevention board. global surveillance and control of hepatitis c ［j］. j viral hepat, ):35?47.　　2 berzofsky j a, ahlers j d, janik j et al. progress on new vaccine strategies against chronic viral infections ［j］. j clin invest, ):450?462.　　3 jiao x, wang r y, feng z et al. modulation of cellular immune response against hepatitis c virus nonstructural protein 3 by cationic liposome encapsulated dna immunization ［j］. hepatology, ):452?460.　　4 chen z p, berkower i, ching w m et al. identification of a murine cd4+t?lymphocyte response site in hepatitis c virus core protein ［j］. mol immunol, ?8):703?709.　　5 gregoriadis g, bacon a, caparros?wanderley w et al. a role for liposomes in genetic vaccination ［j］. vaccine, 2002;20(suppl 5):b1?b9.　　6 gregoriadis g, saffie r, de souza j b. liposome?mediated dna vaccination ［j］. febs lett, ?3):107?110.　　7 velinova m, read n, kirby c et al. morphological observations on the fate of liposomes in the regional lymphs nodes after footpad injection into rats ［j］. biochim biophys acta, ):207?215.　　8 guy b, pascal n, francon a et al. design, characterization and preclinical efficacy of a cationic lipid adjuvant for influenza split vaccine ［j］. vaccine, ?14):.　　9 perrie y, mcneil s, vangala a. liposome?mediated dna immunization via the subcutaneous route ［j］. j drug target, ):555?563.　　10 aucouturier j, dupuis l, deville s et al. montanide isa 720 and 51: a new generation of water in oil emulsions as adjuvants for human vaccines ［j］. expert rev vaccines, ):111?118.　　11 jones t r, obaldia n, gramzinski r a et al. synthetic oligodeoxynucleotides containing cpg motifs enhance immunogenicity of a peptide malaria vaccine in aotus monkeys ［j］. vaccine, ?24):.　　12 osorio y, cohen j, ghiasi h. improved protection from primary ocular hsv?1 infection and establishment of latency using multigenic dna vaccines ［j］. invest ophthalmol vis sci, ):506?514.　　13 petrovsky n, aguilar j c. vaccine adjuvants: current state and future trends ［j］. immunol cell biol, ):488?496.　　14 peng h j, tsai l c, su s n et al. comparison of different adjuvants of protein and dna vaccination for the prophylaxis of ige antibody formation ［j］. vaccine, ?6):755?761.
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