标准曲线_中国百科网
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?ELISA标准曲线 一般来说作直线回归的话，每次检测的R2最好达到0.98，即R达到0.99，否则需要复测。 如果需要做几次检侧，那么每次的斜率和截距相差不要超过百分之20，R是相关系数，x与y的相关性。一般用R2表示，更加精确。R2...
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共有&51&人回复了该问答大家现在是如何做标准曲线的？
在分析化学实验中，常用标准曲线法进行定量分析。现在做标准曲线的方法是五花八门，有坐标纸绘制法，计算器算法，电脑软件绘制法和分析仪器自动计算的。你在分析中一般都使用的是什么方法，在绘制曲线时有什么好的经验，诀窍和感受，在这里和大家分享下吧！
回复于： 9:06:52我们一般都用Excel，挺方便的，回归方程和图都能给出，想改哪个数据也很方便
回复于： 9:05:05告诉大家一个秘密,我们买了ARL直读光谱仪后,划曲线的工作就用它的MVR(多变量回归)代劳了,真是方便.原来用过坐标纸做图,用最小二乘法回归求系数,人工算的数比较多且烦.真是解放了,做曲线成了一种享受.
回复于： 9:03:00　　现在一般都是通过计算机拟合来绘制标准曲线，这样得出的曲线能更合理。
回复于： 9:00:34我司是直接使用仪器自带软件分析.
回复于： 8:46:44现在都是仪器自带的，当然如果你的数学好的话可以自己算
快速回复【花三五分钟，帮别人解决一个问题，快乐自己一天！】
回复于： 8:25:15
我送大家个软件
回复于： 8:32:31
可以先配制不同浓度的标准溶液，要测的样品在浓度范围内，再用比色法、或者发射光谱法测其吸光度或者强度，在绘制曲线，这就做成标准曲线。
回复于： 8:36:17
我们一般使用仪器自带软件分析，如果软件没有这个功能，那我们就使用Excel来进行；当线性范围很大时，我们会使用加权最小二乘法进行回归计算。
回复于： 8:46:44
现在都是仪器自带的，当然如果你的数学好的话可以自己算
回复于： 9:00:34
我司是直接使用仪器自带软件分析.
回复于： 9:03:00
　　现在一般都是通过计算机拟合来绘制标准曲线，这样得出的曲线能更合理。
回复于： 9:05:05
告诉大家一个秘密,我们买了ARL直读光谱仪后,划曲线的工作就用它的MVR(多变量回归)代劳了,真是方便.原来用过坐标纸做图,用最小二乘法回归求系数,人工算的数比较多且烦.真是解放了,做曲线成了一种享受.
回复于： 9:06:52
我们一般都用Excel，挺方便的，回归方程和图都能给出，想改哪个数据也很方便
回复于： 9:21:52
用Excel很方便，
回复于： 9:25:42
原文由 zydhzdx 发表:用Excel很方便，同意
回复于： 9:58:33
标准曲线制备可分为两种方式：一、溶液逐级稀释的方法，即先配制一定浓度的浓溶液，之后依次逐步将该溶液稀释至不同浓度，分别进样测定。好处是这样作数据的准确度可以保障，但稀释溶液时的系统误差将无法克服；二、仅配制一份浓溶液，进样时仅通过进样体积的不同加以区分，测定。好处是将溶液配制时的系统误差降至最小，但是要求仪器进样针一定要精密准确，或者要求操作人员手动进样水平及进样重现性较好。真正到了计算的时候，就没多麻烦了～大家都有Excel吧，用的很方便的。而且报告一次成型，节省了大量的时间。也不用再找什么专门的软件了～
回复于： 10:06:23
一般用仪器自带的软件，有些也用excel做，很方便呢
回复于： 10:07:03
偶用的是word，也很方便啊！
回复于： 10:20:55
两种方法，一种是仪器自带的，一种最常用的EXCLE，然尔我发现仪器和EXCLE算出来的线性方程和相关系数、斜率都不一样，有时还差别很大，我实在想不通，请高人指点。
回复于： 10:23:01
如果仪器软件可以计算当然最简单，要是不能我们一般都用Excel来计算。计算标准曲线一般都用一次方程，但对于一些线性范围比较窄的用二次方程则更为准确。
回复于： 10:28:07
在以前用坐标纸绘制法，现在用分析仪器自动计算的.
回复于： 10:43:46
配置好标准溶液，直接用电脑软件进行绘制
回复于： 11:10:23
现在的仪器都自带做曲线的程序的，直接做出来了
回复于： 11:47:57
目前多用电脑仪器自带绘制
回复于： 12:34:14
以前是手工在纸上绘制，现在一般使用excel
回复于： 12:55:59
原文由 maddog 发表:标准曲线制备可分为两种方式：一、溶液逐级稀释的方法，即先配制一定浓度的浓溶液，之后依次逐步将该溶液稀释至不同浓度，分别进样测定。好处是这样作数据的准确度可以保障，但稀释溶液时的系统误差将无法克服；二、仅配制一份浓溶液，进样时仅通过进样体积的不同加以区分，测定。好处是将溶液配制时的系统误差降至最小，但是要求仪器进样针一定要精密准确，或者要求操作人员手动进样水平及进样重现性较好。真正到了计算的时候，就没多麻烦了～大家都有Excel吧，用的很方便的。而且报告一次成型，节省了大量的时间。也不用再找什么专门的软件了～我也是这样的。excel操作是这样的：.cn/bbs/shtml/2893/
回复于： 13:11:50
我用origin制作标准曲线，还可以进行平滑、外推，甚至三维图。
回复于： 13:22:39
有时我一天要做几条曲线，侧几百个样品，手工的话估计图都画不完，所以幸运的是仪器软件有此绘图功能。
回复于： 13:24:25
算法软件怎么有个大美女....我用卡西欧的计算器算
回复于： 13:52:01
原文由 chemistryren 发表:算法软件怎么有个大美女....我用卡西欧的计算器算是用最小二乘法吧！以前在学校时老师教过不过都忘了，具体怎么按计算器都不记得了，能不能教一下？先谢谢！我们实验室也是先制备标准曲线，以吸光度与标准物质质量为纵、横坐标，用Excel绘制曲线计算的。
回复于： 15:08:47
仪器自带，另外还有很好很强大的origin
回复于： 15:12:18
我还是喜欢使用仪器自带的软件,一般在选购仪器时都将考虑着一点
回复于： 17:14:30
仪器自带的软件！
回复于： 17:24:38
我觉得用电子表格来做标准曲线挺好的
回复于： 23:06:12
我一般都是用origin& 功能很好~~简单,有点像傻瓜机,呵呵~~最近也用execl来画标准曲线,也OK~~
回复于： 23:21:54
现在一般电脑分析和自动分析的偏多不过学校里老师还是从基础教的，主要是锻炼大家的动手能力
回复于： 0:23:00
原文由 dickwang2008 发表:我们一般使用仪器自带软件分析，如果软件没有这个功能，那我们就使用Excel来进行；当线性范围很大时，我们会使用加权最小二乘法进行回归计算。我们做的跟3楼一样
回复于： 8:13:33
做标准曲线实际就是线性拟合,个人理解用坐标纸对数据相关程度的要求比较高,现在手工都是用科学计算器,一般很多仪器软件上都能提供这样的功能.好像EXCEL也能实现的.我们是用仪器软件上的,只要把数据输入就行了,这样省事,不用动脑子验证了.
回复于： 8:24:20
曲 线 无 论 是 专 门 软 件 还 是 手 绘 其 原 理 都 为 y=kx+b如 无 软 件 手 绘 也 可 如 线 性 波 动 大 精 度 不 高 可 加 权 了最 小 二 乘 回 归 计 算 或 多 变 量 回 归 MVR
回复于： 8:46:09
一般仪器操作系统自带的软件都会自动绘制曲线的。
回复于： 8:57:05
原文由 lylsg555 发表:我送大家个软件这个软件不能进行加权回归计算呀，要是再有这个功能就完备啦
回复于： 8:57:12
分析仪器自带软件绘制 效果也可以
回复于： 9:56:34
现在用excel做标准曲线比较方便
回复于： 10:31:16
用仪器自带软件或者EXCEL
回复于： 10:36:48
用Excel很方便
回复于： 10:45:12
原文由 lylsg555 发表:在分析化学实验中，常用标准曲线法进行定量分析。现在做标准曲线的方法是五花八门，有坐标纸绘制法，计算器算法，电脑软件绘制法和分析仪器自动计算的。你在分析中一般都使用的是什么方法，在绘制曲线时有什么好的经验，诀窍和感受，在这里和大家分享下吧！计算器算和仪器自动计算！但涉及到有效数位的问题，一般还是选择计算器自行计算的方式！
回复于： 14:03:25
其实不管用哪个方法算标准曲线的公式和系数，最后的结果都应该一样。关键是配标准液不要出错，设备要稳定。
回复于： 14:17:05
用仪器自带功能的计算
回复于： 14:53:26
我们现在一般的仪器自带软件，很方便的。记得最早的时候测磷时用721分光光度计，使用型号为FX-3600的计算器进行曲线回归运算，再后来有了电脑OFFFICE软件，用Excel表格将浓度和测定值两列做“散点图”，然后在图中添加“趋势线”和公式就可以了，很方便。
回复于： 20:17:28
直接用Excel做吧，简单、方便、安全、放心啊
回复于： 22:00:08
工作站有标准曲线回归算法功能，有时某个点浓度点的检测值有异常，可以直接观察到并做处理，很方便。
回复于： 9:15:30
根据行业要求不一样，标准曲线的要求也不尽相同的。我是公路工程试验检测中心的，有用线性回归，有直角坐标系的等，根据规程要求去做就没有问题了。
回复于： 15:25:37
电脑自带的
回复于： 15:39:47
原文由 paigu064 发表:原文由 zydhzdx 发表:用Excel很方便，同意同意
回复于： 17:28:32
回复于： 21:09:29
我们用坐标纸绘制法和分析仪器自动计算的方法较多!
问答用户推荐 回答数：0
未解决问题细胞库/细胞培养
ELISA试剂盒
实验室仪器/设备
原辅料包材
体外检测试剂
蛋白质的定量法与标准曲线的制备
蛋白质的定量法与标准曲线的制备
来源：互联网
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Western Blot技术专题 LOWRY法蛋白定量专题
A. Folin-phenol(lowry method)定量法
此法以Biuret方法反应为基础发展而起，因此会严重干扰Biuret测定方法的因子都会影响此测定法的准确度。这些干扰因子包括：含-CS-NH2，-CH2-NH2，-CRH-NH2，-CH2-NH-CHNH2-CH2OH，-CHOH-CH2NH2等基团的物质以及缓冲剂如Tris、蔗糖、低浓度的酚类、柠檬酸等，但低浓度的尿素、硫酸胺可以增加碳酸钠-氢氧化钠的浓度来校正显色结果。1951年Lowry对于 Folin-Ciocalteu 试剂在不同的 pH值条件下得到此试剂作用的最佳反应条件，此法的灵敏度较Biuret方法高约100倍，反应时间只要约15分钟即可显色，颜色的稳定度可达数小时，故目前多用Folin-phenol法测定待测样本的蛋白质浓度。
原理：蛋白质与Folin试剂作用分成两个阶段：
1.蛋白质 先与碱性铜离子作用
Cu2+ + Protein- Cu-Protein
当碱性的铜离子试剂和蛋白质中的 peptide bond反应时会产生biuret test 的初步呈色反应，此蛋白质铜复合物会再由Phosphomolybdic-phosphotungstic试剂(Folin-Ciocalteu Reagent)作用形成蓝色物质。
蛋白质分子
中可和Folin – Ciocalteu 试剂作用的团基有：Histidine的Imidazole Group、Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group、Cysteine的Sulfhdryl Group、Arginine的Guanidino Group。在这些团基中，Tyrosine的Phenolic Hydroxyl Group最为重要，碱性蛋白质与Folin-Ciocalteu Reagent复合物的颜色强度与蛋白质中的芳香族官能基 (aromatic group) 成正比。
值得注意的是当Folin-Ciocalteu 试剂在强碱的环境中易使 phosphomolybdate解离而丧失作用的能力，所以此剂须新鲜配制并避免与蛋白质中的 Tyrosine 及 Tryptophan 反应前置于强碱的环境中，依比色的方法测其吸亮度，换算蛋白质的量。
Folin-Ciocateu phenol 试剂在酸性环境中才稳定，但 Lowry method 必须在 pH=10 才会发生，所以 Folin - Ciocalteu Reagent 一加入碱性的硫酸铜-蛋白质溶液中(alkaline cooper protein )必须马上混合均匀，以确保还原反应在phosphomolybdic- phosphotungstate 分解之前发生。
以上两种蛋白质显色定量法均会破坏样本中的蛋白质，故当蛋白质样本量少又需要回收时，不可以使用此种方法定量。
B.紫外线吸收值测定法
由于蛋白质分子
中多含有芳香族胺基酸(如苯丙胺酸(phenylalanine)、色胺酸(tryptophan)、酪胺酸(tyrosine) )残基，这些残基含有具共轭电子的苯环团基，故在紫外线波长280nm、260nm会有吸光值。在波长280nm之吸光值与蛋白质的浓度具正相关性，故可以利用280nm的吸光值做为蛋白质的定量工具。此法的优点是迅速、简便，不消耗样品及不受低浓度的盐类干扰。但此种测定方法的缺点是，许多其它物质在此波长附近亦有吸光现象，如核酸虽在260nm会有最大吸光值，但在280nm处仍会有吸光的现象。一般而言，纯的蛋白质之280nm/260nm比值约1.75，但此数值会依蛋白质含方香族胺基酸含量而变，因此利用此方法测定蛋白质的浓度最大的缺点是，对于测定那些与标准蛋白质中色胺酸(tryptophan)、酪胺酸(tyrosine)含量差别大的蛋白质，测定的浓度会有一定的误差;再者，样品中如果又含有核酸等吸光物质时亦会出现大的干扰。因此待测样本或标准液在作适当的稀释并在波长280nm及260nm测得吸光值后，可以利用下列的公式以校正蛋白质的浓度。
蛋白值浓度(mg/ml) = 1.45A280 - 0.75A260
Folin-phenol(lowry method)定量法
A. 试剂与仪器：
1. reagent A：100g NaCO3 1L 0.5N NaOH 。
2. reagent B： 1g CuSO4?5H2O 100mL ddH2O。
3. reagent C： 2g NaKC4O6?4H2O 200mL ddH2O。
此三溶液分别储存。
4. bovine serum albumin solution 300 ug/mL ( W/V)
5. 平口试管13支
6. 试管振荡器
7. Spectronic 20光电比色计
8. 安全吸球
9. 玻璃刻度吸管
10. 微量吸管辅助器
B. Lowry method 操作步骤：
1. 将 Spectrophotometer 温机。
2. 取 bovine serum albumin solution 0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1mL 及未知蛋白质样本 1mL 置于已标好的试管中。
3. 在上步骤的试管中加入蒸馏水使试管中的体积为 1mL 。
*此时取 15mL 的 reagent A 与 0.75mL reagent B 及 0.75mL reagent C 混合均匀成为 reagent D。
4. 取 1mL reagent D 加入步骤 3 之各试管中，马上以试管振荡器混合均匀。
5. 将混合液置于室温 15 分钟。
*此时取 5.0mL 2N Folin-phenol reagent 加入 45mL ddH2O，混合均匀。
6. 取 3mL 稀释的 Folin-phenol reagent 加入步骤 5 之试管中，马上以试管振荡器混合均匀。
7. 将混合液置于室温 45 分钟。
* 呈色后之产物 45~60 分钟颜色稳定。
8. 在波长 540nm 及 750nm 下分别测其吸光值。
9. 分别以 A540、A750 浓度 ug/mL 作表、作图。求得线性回归方程式，并由方程式求出未知蛋白质的浓度。
还原糖标准曲线的制备与a-amylase 活性测定
还原糖的定量测定与糖浓度标准曲线的测定：
3,5-dinitrosalicylic acid定量法
利用葡萄糖作为还原糖的单位：
以3,5-dinitrosalicylic acid法碱性的环境下会被还原成3-amino-5- nitrosalicylic acid，来检测还原糖的存在。
材料与仪器：
1. 3,5-dinitrosalicylic acid (DNSA) 试剂(此药剂必须新鲜配制)：
(1). 先将Sodium potassium tartrate 300g溶于500ml的蒸馏水中。
(2). 取 3,5-dinitrosalicylic acid 10g溶于200ml 2M的NaOH溶液中。
(3). 将(2)之碱性3,5-dinitrosaliylic acid溶液慢慢加入(1)之溶液中。加蒸馏水至 体积1000ml。
2. 1M NaOH
3. 1000mM之glucose。
4. 试管震荡器
5. 螺旋试管20支
8. 安全吸球
9. 玻璃刻度吸管
10. 光电比色计
1. 取不同糖试液3ml置于螺旋试管中。(如表一)
2. 加入DNSA试剂1ml，混合均匀。
3. 在95OC水浴中加热3分钟。
4. 取出试管冷却，观察其颜色变化。
5. 用光电比色计测波长540nm下之吸光值。
6. 反应之废液倒入指定的废液筒。
表一：依下表配制不同浓度的glucose溶液：
Glucose(ml)
☆ 算出glucose mmole与540nm下吸光值之线性回归方程式。
a-amylase 活性测定
1. 0.1M Na,K-phosphate buffer pH=6.7 ( 0.1M Na2HPO4 与 0.1M KH2PO4 以43.5：6.5(V/V)混合即可。
2. 0.01%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%.、0.5%、1%、2% Glycogen溶于内含0.01% NaCl的0.1M Na,K-phosphate buffer中。
3. 2N NaOH(停止反应)。
4. 60% Na,K-tartrate。
5. 1% dinitrosalicyclic acid 溶液(DNSA)。
6. 5U/ml a-amylase溶液。
1. 0.5% Glycogen基质之配制。
5克Glycogen溶于500ml蒸馏水，搅拌均匀加缓冲液加至体积一升。(Glycogen溶解速度慢需于实验前配制好)
2. DNSA之配制：
5%之3,5-dinitrosalicyclic acid(溶于2N NaOH)以水作5倍稀释或以60% Na,K-tartrate溶液作 2：5(V/V)稀释及即可。
1. 取Glycogen基质3ml置于 25oC 水浴槽中预热3分钟。(可在室温操作)。
2. 取出加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5&l a-amylase溶液(或是纯化步骤中稀释之收集液)加入各管，混合均匀后置于25oC 水浴槽3分钟。(酵素液应储放于冰上)
3. 将反应液取出加入 1N NaOH 1ml后加以混合以停止酵素反应。
4. 待最后一管完成后，全部之反应的试管加入 1ml DNSA，混合均匀。
5. 将试管置95OC 3分钟，冷却之至室温后，在 540nm 读取吸光值。
☆ 计算a-amylase之活性单位：
☆ 酵素的活性单位表示法
表二：酵素活性单位(unit of enzyme activity)的表示
在一定条件下，每一分钟消耗一定量的受质或生成一定量的产物所需的酵素量称为一个单位。
每分中消耗或生成mmol(10-6 mol)；n mol(10-9 mol)；p mol(10-12 mol)的国际单位分别是mU，nU，pU。
(turnover number)
在一定的条件下，酵素分子
每一催化中心的催化产生产物的分子数即其转变数。
转变数=产物的分子
催化中心的数目
a. 转变数也称为催化中心活性(catalytic center activity)
b.一般一酶分子只有一活化位置，只有少数例外。所以一般来说：转变数=催化中心活性。
c.一般酶的转变数在102 ~106
(specific activity)
在一定条件下，每毫克(mg)蛋白质所含的酶单位数称之。
specific activity = 酶单位数/mg蛋白质
a. 适用于酶的纯化过程，可供酶在比较各纯化阶段的纯度之用。
b. 酶的纯度愈高其专一活性愈大。
相关实验方法
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&&&原子吸收光谱分析的定量方法（之标准曲线法)
原子吸收光谱法是一种相对的测定方法，不能由分析信号的大小直接获得被测元素的
含量。需要通过一个关系式将分析信号与被测元素的含量关系联系起来。校正曲线就是用来将分析信号（即吸光度）转化为被测元素含量（或浓度）的&桥梁&。
校准曲线的质量直接影响样品测定的准确度。因此，校正曲线设计合理。从校准曲线置信范围考虑，当实验点数目少于4点时，置信系数较大且变化速率快，置信范围较宽，由校准曲线求得的含量值或浓度值的不确定度较大。随着实验数目的增加，置信系数减小的速率很慢，置信范围变小的速率很慢，因此用4-6个实验点绘制校正曲线是很恰当的。在总测定次数相同的情况下，多设置实验点，减少每个实验点的测定次数，比少设置实验点，多增加每个实验点测定次数更有利。因为增加某个实验点的测定次数只能改变此点的精密度，而增加实验点数目却可以改变校准曲线的精密度。从测定误差考虑，校准曲线中央部分的精密度优于其两端，因此应让被测元素含量位于校准曲线的中间。
用&空白&溶液校正仪器零点，实际上就是用一个测定误差较大的点做为基准点校正仪器，这显然是不合适的；用空白溶液的测定值直接校正空白值也是不可取的，因测定值是随机变量，而且测定误差较大；用一次测定值作为基准对空白进行校正带来很大的偶然性，校正效果得不到有效的保证。正确的方法是用校准曲线的截距来校正空白，或者对&空白&溶液进行多次测定，取其平均值来校正空白（如下图所示，每次测定的空白是有区别的，且测定结果RSD很大）。
原子吸收光谱法分析是一种动态测量，测定值易受实验条件的影响，引起校正曲线转动或平移，或者既产生转动又产生平移。因此，应该随时或者定时检查校正曲线是否发生了变化。如何检查这种变动？不少分析人员采取的做法是重新测定个别实验点的吸光度，根据新测得的吸光度，将原来的校正曲线平移；或者通过新吸光度值和坐标原点重新制作标准曲线，重置标准曲线斜率。这两种做法都是有问题的。前一种做法将曲线平移，实际上是假定各实验点的偏移大小是固定的，不随被测元素含量而改变，是一个固定系统误差。后一种做法是将斜率重置，实际上是认为曲线的原点是不变的，不存在固定系统误差，只是随被测元素含量而改变的相对系统误差存在。而事实上，固定系统误差和相对系统误差经常是同时存在的，使校正曲线既产生转动又产生平移。校正曲线的正确校正做法是用原来制作校正曲线时不同含量或者浓度的标准样品，测定吸光度，将原有点的与新的实验点合并起来重新绘制校准曲线，既利用了原校准曲线的信息，又利用了新获得的信息。其所以用不同的含量或浓度的标样来检查校正曲线，是因为用原有的实验点与新实验点合并绘制校准曲线时，增加了实验点的数目，有利于提高新校正曲线的稳定性（原始结果如上图所示）。
这么多 正好系统的学习一下。多谢楼主。