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【实验求助】tunel染色和DAPI染色检测细胞凋亡
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这个帖子发布于3年零10天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大神：
本人最近在做药物诱导肝细胞调往，分别用了tunel和DAPI两种方法进行染色，请问下图中DAPI染色如何区分凋亡的细胞呢？tunel染色是不是只要发绿色荧光的就是已经凋亡的细胞呢？谢谢大家的帮助！！！！
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看上去都是tunel阳性，不大可能啊
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我是做脑组织凋亡的，做出来的片子也是这样，都是Tunel阳性细胞求教！万分感谢！
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凋亡的话，核会皱缩 有时候分区
我觉得应该再放一张HE染色的片子。还需要做阴性对照
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我做出来的细胞凋亡的比例也很高，重复了三次。但是从1H-12H细胞凋亡的比例都很高，也很奇怪。不知道大家有做过这种状态的，怎么解释呀？
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关于丁香园Hoechst33342/PI双染法和TUNEL染色技术检测神经细胞凋亡的对比研究--《癌变.畸变.突变》2014年03期
Hoechst33342/PI双染法和TUNEL染色技术检测神经细胞凋亡的对比研究
【摘要】：目的:利用Hoechst33342/PI双染法和原位末端标记法(TUNEL染色检测纳米二氧化硅(nm-SiO2)对神经细胞凋亡的影响,比较两种检测方法的优缺点。方法:以体外培养的人神经母细胞瘤SK-N-SH为研究对象,15和30 nm粒径的nm-SiO2(剂量为2.5、5、10μg/mL)分别处理细胞24 h,另设1~5 m SiO2组和溶剂对照组,采用Hoechst33342/PI双染法和TUNEL染色检测各处理组对SK-N-SH细胞凋亡的影响。结果:与对照组相比,两种检测方法分析均显示了nm-SiO2处理组SK-N-SH细胞凋亡率显著增加(P0.05),且具有尺寸、剂量依赖性,而微米级SiO2对凋亡的影响不显著(P0.05)。结论:nm-SiO2能诱导SK-N-SH细胞凋亡。Hoechst33342/PI双染法特异性高,简单易行;TUNEL法灵敏度高,能检测少量的细胞凋亡,但成本较高,两种方法可结合使用以便更加准确的检测神经细胞的凋亡。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R318.08【正文快照】：
纳米二氧化硅(nm-SiO)作为典型的纳米材料,已经2广泛应用于工业、食品添加剂、化妆品和生物医学等各
个领域。随着人们接触纳米材料的机会增多,其对人类健康的影响也受到了广泛关注。然而,目前国内外对纳
米材料的毒性和生物安全性,特别是进入机体后对神经PBS缓冲液洗涤细胞
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【参考文献】
中国期刊全文数据库
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郭晓红;刘立新;;[J];山西医科大学学报;2008年05期
【共引文献】
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丛明;吕家森;吴惠丰;赵建民;;[J];Chinese Journal of Oceanology and L2013年05期
佟俊杰;苗清;王志国;徐全臣;;[J];口腔医学;2014年S1期
宋富强;郭文琼;郭鑫;李昆;冯亚星;李薇;呼永河;;[J];西南军医;2015年04期
Pratikkumar SQiaoli YXuena ZFangcheng Xu;Huai-Sheng WChen-Zhong Li;;[J];Science China(Chemistry);2015年10期
孙悦;莫满芳;戴卫平;张玉英;梁楚婷;王淑美;;[J];分析测试学报;2013年08期
高秋;杨松;陈燕春;季燕妮;周维;;[J];山东医药;2014年16期
王苗;董坚;李秋恬;吕加令;武治国;毛剑锋;;[J];中国医药生物技术;2010年02期
万彬彬;何浩;江维;赵宇侠;金京娥;金惠;;[J];中国药理学通报;2013年11期
苏育南;颜醒愚;;[J];医学综述;2013年23期
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孙玉芹;[D];吉林大学;2012年
吕银娟;[D];湖北中医药大学;2013年
李丽;[D];南京理工大学;2013年
唐科;[D];华中科技大学;2013年
谢勇;[D];中南大学;2012年
高春艳;[D];南开大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库
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董晶;[D];湖北中医学院;2009年
伍丹;[D];天津科技大学;2009年
朴哲;[D];延边大学;2009年
王苗;[D];昆明医学院;2010年
饶澄;[D];福建医科大学;2010年
曾春;[D];广西医科大学;2012年
程煜;[D];华东师范大学;2012年
崔轶斌;[D];华东师范大学;2013年
苏育南;[D];福建医科大学;2013年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
赵俊;王明丽;陈敬贤;;[J];安徽医科大学学报;2007年02期
赵振军,张丽杰,易小兵,李燕群;[J];医学综述;2003年07期
【相似文献】
中国期刊全文数据库
杨细飞;贺春娥;汤瑞华;田生礼;刘建军;;[J];癌变.畸变.突变;2014年03期
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京公网安备75号请各位老师看看我的TUNEL图片可以吗(荧光显微镜,细胞凋亡,浓缩,凋亡细胞) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 请各位老师看看我的TUNEL图片可以吗(荧光显微镜,细胞凋亡,浓缩,凋亡细胞)
摘要: [请各位老师看看我的TUNEL图片可以吗(荧光显微镜,细胞凋亡,浓缩,凋亡细胞)] 各位老师好，我是一位本科生，毕业论文做细胞凋亡(Apoptosis)，用TUNEL法，用的是Roche公司的In Situ Cell Death Detection Kit, POD 50T，细胞同时用DAPI染色，这是我用荧光显微镜100倍油镜拍的凋亡细胞的图片，大家帮我看看，对吗？细胞中间的亮点是浓缩的核吗？这样的亮度会不会太亮了，染色过度了？
关键词:[细胞凋亡 荧光显微镜 凋亡细胞 浓缩]……
各位老师好，我是一位本科生，毕业论文做细胞凋亡(Apoptosis)，用TUNEL法，用的是Roche公司的In Situ Cell Death Detection Kit, POD 50T，细胞同时用DAPI染色，这是我用100倍油镜拍的凋亡细胞的图片，大家帮我看看，对吗？细胞中间的亮点是浓缩的核吗？这样的亮度会不会太亮了，染色过度了？
回复荧光下 回复荧光下 回复图片上传后好像有点失真，但还是请老师们帮忙看看，因为一直做不好，而且做一次又很贵，现在都不敢继续做，想先把情况弄清楚了以后再做，谢谢了！！回复不能用这图片，显色液用的过多，周围的全部都有荧光，这怎么可能，正常来说，只有凋亡的细胞才能发光回复谢谢老师的指点，我把显色液稀释一下看看，只是我总是控制不好染色的时间和浓度。
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【经验】分享一下细胞爬片TUNEL测定凋亡的操作和经验。
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这个帖子发布于2年零30天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
TUNEL assay 的操作经验1.
caution:有毒，且强致癌性。应避免吸入。我们使用的试剂盒是罗氏的试剂盒。2.
试剂盒包含：cap1:蓝色：酶溶液：末端脱氧核酸转移酶 5x50μl。
Cap2:红色：标记溶液：核酸混合反应缓冲液。5x500μl.3.
另外需要的试剂：PBS、4%多聚甲醛、通透液（0.1%triton X-100+0.1%枸橼酸钠，现配）。4.
染色原理：1.用TdT标记DNA断裂带，2.TMRred标记核苷酸。5.
特异性：可以区分凋亡和坏死。6.
材料准备：adherent cells 培养在暗室载玻片。7.
检测时间：1-2h，不包括细胞培养、固定、通透等。8.
注意：该试剂盒需要现配现用，配置好后不能保存，配置过程在冰上操作。9.
流程：贴壁细胞—固定—通透—标记—显微镜分析。10.
贴壁细胞的准备：1：室温下使用固定液固定爬片1h（15-25℃）。2：PBS漂洗。3：用通透液冰上孵育2min（5-8℃）。11.
TUNEL试剂准备：一对管可以染10个片子，每个样本50微升和2个阴性对照。步骤1.移除100微升的红管2做阴性对照。
2.加50微升蓝管1,进入剩下的红管中，获得了500微升TUNEL反应混合物。
注意保持冰上操作，和冰上留置。12.
阴性对照组：使用标记溶液红管2作为阴性对照
阳性对照组：使用微球菌核酸酶或者DNA酶1重组体13.
正式染色过程：
1PBS漂洗玻片2次。
2样品周围干燥
3加50微升TuNEL混合液在样本上。注意：确保均一覆盖样品，避免孵育过程中蒸发（样本要封口或者加盖盖破片）
4.潮湿环境中孵育1小时37°（保持暗室环境）
5.PBS漂洗3次。
6荧光显微镜下观察。14.
如果出现高背景需要用TUNEL稀释缓冲液洗液标记溶剂或者酶。DAPI的双染：1.
强致癌物。2.
即用型染色剂3.
先进行免疫荧光染色：2.
加入适量的DAPI染色：5-10分钟。3.
吸出染液，用PBS洗涤2-3次，每次5分钟。4.
荧光显微镜下观察。如果需要复染，拍片时注意只换激发光，不调焦距。TUNEL的染色竟然拍的亮点，DAPI尽可能暗点，这样后期处理后合出的颜色非常漂亮。
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丁香园准中级站友
准备做TUNEL，先前没做过，请问你的贴壁细胞是从培养瓶中消化下来接种到玻片上让它贴壁后再用药物处理使之凋亡后再固定，还是在培养瓶中加了药物使之凋亡然后消化后离心，将细胞沉淀涂抹在玻片上？
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请问怎么区分凋亡和坏死
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感谢楼主分享，比较细致
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关于丁香园（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染；（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％；（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5×；2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应；3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立；4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片；5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤；6、组织切
（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。 （2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。 （3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。 2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。 3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。 4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。 5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。 6、组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。 7、用PBS洗4次，每次5min。 8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。 9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。 10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。 11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。 （三）注意事项 一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1μM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。 用流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡各有何优缺点 xiaobang1979：请教：用流式细胞仪检测细胞凋亡结果可靠吗？是不是还需要做TUNEL法检测证实吗？还是二者结合更好？ midas：细胞凋亡的金标准是电镜。 其他方法如TUNEL法、流式等都是可靠的方法，但是最好是两种以上结合验证凋亡。 两种TUNEL检测应如何选择 hongbin9179：现在我手头上有两种TUNEL的方法（我要观察的是贴壁动物细胞）， 一是用荧光素标记d-UTP,TdT介导酶反应，然后用AP或POD作为报告酶标记的荧光素抗体结合已结合在DNA上的荧光素，最后用光线显微镜观察结果； 二是冷泉港细胞实验手册介绍的方法，用地高辛标记d-UTP，酶反应结合上DNA后用辣根过氧化酶偶联的抗地高辛结合地高辛，在加入DAB底物和过氧化氢。 请哪位大侠说一下哪个方法较灵敏，而且除了能用光线显微镜观察结果外，假如要用流式细胞仪时在试剂上无需改动太大的？本人第一次做这一类实验，经验不足，请有识之士帮帮忙。 midas：两种方法灵敏性均可以，第一种更方便一些。 流式细胞仪检测凋亡时的试剂一般是：PI-hoechst，或 PI-Annexin-V liufaquan：第一种方法较好，因为荧光照片比较漂亮，容易简单。第二种方法主要地HRP的DNA染色，背景不好控制容易出现假阳性。 TUNEL假阳性高怎么办 jingr: 家兔主动脉血管石蜡切片，做TUNEL,DAB染色，有的片子阳性率竟然达到50％，不可能的。 woozson: 假阳性高是TUNEL检测的一个主要缺点。观察TUNEL阳性片是应对照HE切片。结合细胞HE染色来判断阳性的细胞究竟是假阳性还是真正发生了凋亡。凋亡细胞HE形态：细胞固缩，核染色质边集，但细胞膜完整，形成凋亡小体。 为什么我的TUNNEL做出来都是阳性 milaosul：我做了TUNNEL方法测凋亡,结果出来两组皆很强的阳性,与预期不一样,请问为什么 zmy1114：能不能把图附上，把你的实验步骤简单的描述一下。同时应该做一下空白对照和阳性对照，这样才能分辨你做的是真阳性还是假阳性。我们实验室一开始有人做免疫组化的时候就没有做空白对照，DAB显色后是有棕色颗粒，以为出来了，结果实验快做完了，补了一张空白对照，和自己的阳性结果一样。空白对照片就是不加一抗，而用PBS代替，其他步骤都一样。阳性对照片就是找几张肯定有你这种抗体表达的组织片来做一下。再有就是你在洗涤的过程中应该时间长一些。 milaosul：我的图片实验室拍照片程序有点麻烦,没有现成可以拍照片的地方.我 已经电话博士得公司,说这次TUNNEL加抗体标记后37度只能孵育一小时,我照着说明书处理两小时 中共党员：你的试剂盒可以买promage 的40人份2800元左右，可能效果会好一点。国产的，呵呵，有点不可靠 Nevin：我也正好在用tunel作有关apoptosis的研究，体会如下： 事实上，tunel的假阳性是很多的，因素也是很多的，如： 1) 固定液的性质和成分；2）组织块的大小和固定时间；3）AR的方法与你的处理时间等等 另外，一些有基因转录活性的非@亡细胞也会呈tunel阳性。 所以，tunel检测apoptosis最好要结合形态学特征才比较可靠。 最后，假阳性特别要提一下固定液，固定液的浓度过高可造成组织边缘的迅速固定，从而影响液体的穿透，致使待固定组织的中心固定不佳－－－－－可以导致组织中心的cell自溶、DNA链不规则断裂，这就能致假阳性。 关于TUNEL试剂盒 zyj12321:
E-Mail: yu. For Technical QuestionsOnline Questions
Apoptosis Product Name：in Situ Cell Death Detection Kit, AP Description Catalog # Pack size Price Qty Options
kit (50 tests)
电话021- In Situ Cell Death Detection Kit, AP 原位细胞凋亡(程序死亡)检测试剂盒，碱性磷酸酶 规格价格￥ 50~100T 5,016.00
内容介绍：
细胞死亡有两种不同的方式：凋亡和坏死。两者可根据死亡细胞的形态、生物化学改变等的不同而加以鉴别。程序性细胞死亡或凋亡，是真核细胞死亡最常见的形式，它是保持体内平衡的一种生理性自杀机制，是正常组织更新过程中自然发生的细胞死亡。一般说来，凋亡细胞出现胞核和胞浆结构上具有特征性的改变，包括胞浆膜的快速起泡和核裂解。核崩解与染色质的广泛损伤不伴随DNA的裂解的情况是极为少见的。凋亡在许多生理过程中包括免疫系统成熟和效应机制,组织、器官和四肢胚胎发育、神经系统的发育以及激素依赖的组织重塑等都是必需的。在诸如缺血、中风、心脏疾病、癌肿、AIDS、自身免疫病、中毒性肝病和中枢神经系统的退行性变等疾病中，凋亡的不适当的调节起着重要的作用。各种抗癌药物、放射和高温都可以触发凋亡；肿瘤细胞对凋亡的敏感性受几种癌基因表达的调节；凋亡可能是癌症治疗的一种预后标志，肿瘤学上所观察到的这些凋亡现象已引起人们广泛的兴趣。 已有许多方法可用来检测凋亡细胞。据认为核酸内切酶介导核溶解作用在细胞凋亡中是关键的生物化学事件，它引起核DNA的裂解，形成核小体大小的碎片。因此，凋亡在琼脂糖凝胶电泳表现为典型“DNA梯子”，不过这种方法不能提供有单个细胞凋亡信息，亦不能提供有关细胞凋亡与组织学定位或细胞分化的关系。 凋亡可以通过诱导DNA单链断裂、酶原位标记方法来检测。DNA聚合酶以及末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)将标记核苷酸原位掺入并结合到DNA断裂点上。与应用DNA聚合酶的原位缺口转移(ISNT)比较，TdT末端反应亦称为原位末端标记(ISEL)或称末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)技术，具有如下优点： 凋亡细胞的标记强度，TUNEL比ISNT更高，敏感性增加。 核苷酸掺入上，TUNEL比ISNT快得多。 TUNEL优先标记凋亡细胞而不是坏死细胞，因此可以识别(分清)哪些是凋亡细胞，哪些是坏死细胞或由抗肿瘤药物或放射诱导的DNA链断裂。 原位细胞凋亡检测试剂盒对于测定细胞和组织中凋亡细胞具有精确、快速、简单、非放射反应等优点，因此该试剂盒适用于许多不同检测系统，例如： 在基础研究和常规病理中的冰冻和福尔马林固定组织切片中检测单个凋亡细胞 在癌症研究和临床肿瘤学方面，检测癌细胞对凋亡诱导药物的敏感性 通过双重染色方法，在异质群体中，检测死亡细胞的类型 试剂盒成分： 1#瓶：酶溶液----末端脱氧核苷酸转移酶TdT(10x)
5 x 50ul 2#瓶：标记溶液----核苷酸反应液(1x)
5 x 550ul 3#瓶：酶标抗体----酶标记的抗荧光素抗体
ready to use，3.5ml yuhaibo:有谁用过北京中山的TUNEL试剂盒，不知效果怎么样? yanjingfeng519: 效果可以.是国外试剂分装的. yuhaibo: 那么它10人份的盒子，你们就只能用10次么，还是可以多用几次，我想做细胞，不太了解此盒子的特性，所以还没有决定用它。 cheungsober: 效果同国外的差不多,是进口分装的,10人份的,可以用8-9次,10次危险,不过有时后你发现不了典型的小体,复染很重要,作细胞的则应考虑设置阳性对照 yuhaibo:好象有些液体还要自己配备，是么？ newfish: 是的比如说据盐酸钠等我们10次的用了20次也没事 三亿文库包含各类专业文献、中学教育、应用写作文书、外语学习资料、幼儿教育、小学教育、高等教育、专业论文、各类资格考试、17TUNEL法检测细胞凋亡成功的经验与失败的教训总结等内容。　
　(四 )年级(下)册(科学)学科集体备课表 个案 篇二:研发项目成功和失败的经验教训总结 研发 项目成功和失败的经验教训总结 时间:2010 年 10 月 25-26 日深圳 ... 　TUNEL 法特异性检测细胞凋亡时产生的 DNA 断裂, 但不会检测出射线等诱导的 DNA 断裂 (和细胞凋亡时的断裂方式不同)。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开,另一方面... 　信息化集成失败案例分析 8页 免费如要投诉违规内容,请到百度文库投诉中心;如要提出功能问题或意见建议,请点击此处进行反馈。 信息化项目失败的经验和教训总结 隐藏&... 　TUNEL 法测凋亡操作步骤_天文/地理_自然科学_专业资料。TUNEL 法测凋亡操作步骤 一、TUNEL 检测原理 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过... 　年终总结经验教训_韩语学习_外语学习_教育专区。年终总结经验教训 篇一:总结经验教训 总结 经验教训 成功固然有方法, 失败必然有原因。一个人在追求成功的同时,免... 　TUNEL原理和方法_自然科学_专业资料。TUNEL 法检测细胞凋亡实验原理和方法 细胞凋亡中染色体 DNA 的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体 DNA 首先在内源性的 核酸水... 　创业失败经验及教训总结 我曾经运作过数个项目,大多...失败了不要气馁,你没有成功一个是时间的问题,另外...为什么?因为哈磁杯虽然也想到了&用铁勺来检测磁力... 　碱性磷酸化酶或生物素形 成的衍生物标记到 DNA 的 3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一 般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL...