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新到细胞冻存后复苏，大量细胞死亡
请教大家问题，我买的新的细胞株，刚到后，传代一次，进行冻存。冻存20天后，复苏细胞，结果大量的细胞死亡。我一直沿用的冻存方法及试剂，从没出过问题。我猜想是不是细胞刚到后，传代培养一代，这之间用的是原细胞培养液，但二代以后的细胞培养基就用我们的培养基了，而这时候已经冻存了，复苏以后的培养基也是我们的，是不是它还没有完全适应现在的培养基而造成的大量死亡呢？
因为我没有冻过刚到的细胞的经历，请教大家什么原因？
我想知道楼主验证过吗？ 跟网上的一模一样！
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【求助】细胞冻存问题！请戳进来！！！！
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你们细胞是怎么冻存的？求解！！！！我的是4度冰箱放半小时，-20度冰箱半小时，然后转移到-80度冰箱！但是放在-80度冰箱1个月后，细胞复苏就感觉状态不太好了！！你们遇到过这种情况吗？？？求各位在线解答！！！急！！！！！！！
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注意，-80只能作为冻存细胞的过渡阶段，不能用来长期保存冻存的细胞。长期保存必须用液氮，-80放久了会导致复苏存活率降低。
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我觉得可以调整为：4℃冰箱放半小时，-20℃冰箱1-2小时，然后转移到-80℃冰箱。在-20℃期间，一定要待冻存管里的液体冻成固体后再转移至-80℃，也就是说放在-20℃的时间可以适当延长。
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Red_Shoulder我觉得可以调整为：4℃冰箱放半小时，-20℃冰箱1-2小时，然后转移到-80℃冰箱。在-20℃期间，一定要待冻存管里的液体冻成固体后再转移至-80℃，也就是说放在-20℃的时间可以适当延长。我反而认为在-20°C的时间要减少，可以减少到25min，然后转-80度，这样可能会更好，在-20度的时间不要太长此外，冻存液这样配：90%血清+10%DMSO，你的细胞一定会状态好的。我一直用这个配方，效果非常好。
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tangxudong1981 edited on
Red_Shoulder我觉得可以调整为：4℃冰箱放半小时，-20℃冰箱1-2小时，然后转移到-80℃冰箱。在-20℃期间，一定要待冻存管里的液体冻成固体后再转移至-80℃，也就是说放在-20℃的时间可以适当延长。同意，之前一起冻的三只细胞，有一只在-20一个小时就没冻住，我就转移到-80了，过了几天，复苏以后很多飘起来的死细胞。还有一次我放-20过夜了，取其中一只复苏了还挺好，比放-20没冻住就转移到-80的强
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tangxudong1981我反而认为在-20°C的时间要减少，可以减少到25min，然后转-80度，这样可能会更好，在-20度的时间不要太长此外，冻存液这样配：90%血清+10%DMSO，你的细胞一定会状态好的。我一直用这个配方，效果非常好。之前我一起冻的三只细胞，有一只在-20一个小时就没冻住，我就转移到-80了，过了几天，复苏以后很多飘起来的死细胞。还有一次我放-20过夜了，取其中一只复苏了还挺好，比放-20没冻住就转移到-80的强。我自己试来是这样的。配方9:1我没试过，下次试下
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想偷懒就直接买个梯度冻存盒
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cheff0412 edited on
Red_Shoulder想偷懒就直接买个梯度冻存盒 原来那个东西叫梯度冻存盒，哈哈哈，一直用这个却不知道叫什么名字 ^_^
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建议从细胞冻存液开始讨论
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我们最后是液氮长期保存的
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是“程序降温盒 ”其实以上的冻存程序差不多。应该影响不大。有时候和细胞状态有很大关系。有时候有的细胞就是很难冻存，例如THP-1，HL60。
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单说冻存液，我的配方是血清:基培:DMSO=5:4:1，冻存效果还算可以。有些大牛冻存珍贵细胞都直接用的全血清……血清好贵，个人表示玩不起，所以还是经常的541。
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冻存液我一般：90%血清+10%DMSO，梯度冻存盒，最后液氮长期冻存。细胞冻得好不好和冻存时候的状态密切相关
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用冻存杯效果好一点，没有冻存杯4℃可以少一点，只是对冻存液的预冷阶段，5到10分钟就可以，-20里面20分钟肯定能冻住，再放到-80。-80也不能长期存放，最好一天后放入液氮罐。还有4℃预冷不彻底的话可能在-20冻不住，可以用棉花包住放到-80。还有用血清加DMSO效果确实很不错
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-80度是不能长期冻存细胞的，如果你有事耽搁或者其他情况，最多可以放个三四天，之后必须转移到-150的冰箱或者液氮中去
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冻存前，各位是否换液。想统计下，目前觉得冻存后难养细胞换一次液。
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luke_zhanghy冻存前，各位是否换液。想统计下，目前觉得冻存后难养细胞换一次液。冻存前一般不换液，消下来，离心，PBS洗两次，冻存。
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没有冻存盒的话，冻存时用棉花把冻存管多包上几层，包厚点，直接放-80，隔天放到液氮，没问题。操作尽量简便。那种4,-20-80的步骤，经常会忘记，落在其中一步。
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哪有那么复杂，也不知道是谁发明的这种冻存方法在国内这么流行。
文献都明确做过研究，这种方法对细胞存活一点用也没有，还不如直接80
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我用的冻存盒是CoolCell ，可以直接放在-80过夜，第二天转入液氮。效果很好。
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我的经验是4度10分钟，-20度的时间低于半个小时，主要看细胞冻存液是否冻住，自己摸索时间，-80度放一个月是没有问题的。时间不是需要那么固定的，冻存液啊，培养基啊，血清啊这些因素要考虑！可以冻存后过几天拿出来复苏一管，寻找原因。
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Becklittle哪有那么复杂，也不知道是谁发明的这种冻存方法在国内这么流行。
文献都明确做过研究，这种方法对细胞存活一点用也没有，还不如直接80真的吗？相信你。呵呵能不能把那文献发一下，俺也看看。另外，有的细胞好冻存，随便动都活的很好。有的细胞不好冻存，怎么冻，都存活率比较差。
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你最好用程序降温盒，细胞有个缓冲期。-80摄氏度放至少48小时，然后转到液氮中。
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liupeng0215 真的吗？相信你。呵呵能不能把那文献发一下，俺也看看。另外，有的细胞好冻存，随便动都活的很好。有的细胞不好冻存，怎么冻，都存活率比较差。cultureofanimalcells这本书的冻存那一章
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liupeng0215 真的吗？相信你。呵呵能不能把那文献发一下，俺也看看。另外，有的细胞好冻存，随便动都活的很好。有的细胞不好冻存，怎么冻，都存活率比较差。我是说那种放冰箱的方法，梯度盒肯定是提高存活的
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luke_zhanghy冻存前，各位是否换液。想统计下，目前觉得冻存后难养细胞换一次液。我是冻存前头天换液。。第二天冻存。
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Becklittle 我是说那种放冰箱的方法，梯度盒肯定是提高存活的我也是说冰箱的。想讨一下那文献。
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程序降温盒，—80°过夜，第二天转移到液氮灌就可以了
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四度10分钟，负20度放半小时，然后移到负八十度，谨记四度不能放的时间太长。我们组都是这样做的。
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四度10分钟，负20度放半小时，然后移到负八十度，谨记四度不能放的时间太长。我们组都是这样做的哦。实践验证过得。
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买个冻存盒吧
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-80保存半年都没问题，半年以上就要转移到液氮了
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-80度本身就不能长期保存细胞，一个月后细胞状态不好是正常的，重要的细胞尽量保存在液氮比较好。
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一定要放在液氮！一定要放在液氮！一定要放在液氮！重要的事情说3遍！我们-80保存的细胞复苏了将近1个月都养不活。。用液氮里同批次的，1次就好
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冻存时细胞密度一定要够，一般不小于10^6，冻存液配方最好查一下，有没有可靠的数据，胎牛血清比例适中。冻存盒没有的话可以将冻存管用棉花包起来以后放在冻存管架里(改造一下)将冻存管下半部分浸在异丙醇里，-80保存过夜。
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【求助】关于细胞冻存的问题
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这个帖子发布于2年零16天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已关闭悬赏丁当:2
打算冻存RAW264.7细胞，自己配冻存液，供应商建议用10%DMOS+含10%小牛血清的完全培养液。这个含量血清是不是少了，培养液、血清、DMOS 7：2:1是不是好一点。自己配冻存液怎么灭菌？还有一个地方，细胞复苏的时候，有的建议融化后马上离心，有的建议溶化后加少量（5ml）培养液再离心，请问大家是什么操作的？求指点
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引进的细胞当然按照推荐商的要求进行冻存。但一般建议你把种扩到足量的时候进行比对冻存，一种按照推荐商给出的要求进行冻存，另外一种就是常规冻存的方法（20%的血清+10%的DMSO）。冻存液是不需要灭菌的，因为培养基是无菌的，血清也是无菌的，而DMSO由于其万能溶剂的特点，当然也是无菌的。直接把三样加在一起混匀用就可以了。切记DMSO要买生物级的，AR级别的还是对细胞有影响的。常规来说复苏的时候细胞很脆弱，不建议进行离心处理。如果是担心DMSO的影响，你大可以等到细胞贴壁后就更换培养基好了。
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这个血清不少了，保证DMSO是10%就好。冻存液是现配的，在超净台配制就好。复苏的话融化后加点培养基好点（2-3ml差不多）。
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丁香园准中级站友
klayar 打算冻存RAW264.7细胞，自己配冻存液，供应商建议用10%DMOS+含10%小牛血清的完全培养液。这个含量血清是不是少了，培养液、血清、DMOS 7：2:1是不是好一点。自己配冻存液怎么灭菌？还有一个地方，细胞复苏的时候，有的建议融化后马上离心，有的建议溶化后加少量（5ml）培养液再离心，请问大家是什么操作的？求指点 供应商建议用10%DMOS+含10%小牛血清的完全培养液。这个含量血清是不是少了，培养液、血清、DMOS 7：2:1是不是好一点。按你们实验室的操作习惯就行了。自己配冻存液怎么灭菌？现配现用，注意避光。，细胞复苏的时候，有的建议融化后马上离心，有的建议溶化后加少量（5ml）培养液再离心，请问大家是什么操作的？还是要加到培养液中，要细胞适应一下培养的环境。一是因为在冻存体系和培养体系中，细胞所处的环境不一样，有不一样的渗透压。二是稀释DMSO。
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如果加了培养液，不马上离心的话DMSO不是会损伤细胞的吗？我们实验室刚开始培养，什么都不会。刚看了实验室DMSO在4°保存的时候有点凝固，可以加热然后一起配液吗
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丁香园准中级站友
如果加了培养液，不马上离心的话DMSO不是会损伤细胞的吗？我们实验室刚开始培养，什么都不会。刚看了实验室DMSO在4°保存的时候有点凝固，可以加热然后一起配液吗所以在融化时，要快速操作。操作的细节可以参考
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配制的时候，三种成分添加的先后顺序有要求吗， 你们实验室马上离心吗
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一个细胞冻存不需要弄得这么神秘的。你大可在细胞消化等待过程中把细胞冻存液配好，消化结束后直接用冻存液体重悬细胞。直接利用冻存管分装冻存就是了。每个细胞的最佳冻存条件不一定相同，有地细胞在90%的血清里能长期保存，但有的就不行。最好你买个梯度冻存盒，用那个细胞冻存，复苏率高很多的。至于离心与否主要看你的细胞是否对DMSO很敏感，如果不敏感的话等到贴壁再换也不迟。敏感的细胞就低速离心后换无DMSO的完全培养基就好了。简单程序：4ml完全培养基+融化1ml细胞冻存悬，轻柔混匀后无菌移至10ml离心管，800rpm离心10分钟，弃掉上清后加入无DMSO完全培养基，混匀后加入T25-T50的培养瓶就好了。
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冻存时：完全培养基加5%DMSO就行了，都是无菌的，不用灭菌；复苏时：快速37度融化，加几ml 培养基离心1-2分钟即可。
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无血清的即用型细胞冻存液，很方便啊，直接放-80度冰箱，不需程序降温。复苏成活率高啊。还有冻干细胞和原代细胞的冻存液。无DMSO的冻存液。新产品新技术都上来了啊。需要请联系我啊。
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【求助】冻存的组织能不能用细胞流式术做细胞凋亡？？
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这个帖子发布于3年零265天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:2
紧急求助，冻存的组织能不能用细胞流式术做细胞凋亡？？如果能，怎么用组织做细胞悬液？用哪种方法做细胞凋亡？？Annexin V 行不？先谢谢大家了！
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基本不能了。。做出来也不可信
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firstaid261 紧急求助，冻存的组织能不能用细胞流式术做细胞凋亡？？如果能，怎么用组织做细胞悬液？用哪种方法做细胞凋亡？？Annexin V 行不？先谢谢大家了！1.冻存的组织本身在后续操作中有很多的细胞会死亡，还是不要用流式来做了。2.可以做原位免疫组化，比如用
来做就行了。
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reyesa 基本不能了。。做出来也不可信能具体说一下，为什么不可以？谢谢！
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firstaid261 能具体说一下，为什么不可以？谢谢！很简单，冰冻的组织在融化的过程中冰晶融化会撑破细胞。所以annexin V+PI，切片都做不了了。基本上你只能做wb，检测caspase-3等凋亡marker的剪切或者其他凋亡蛋白的表达了。或者做rt这些分子水平的检测想做生理水平的表型，比如细胞的凋亡基本不可能了。
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reyesa edited on
hbezyr 1.冻存的组织本身在后续操作中有很多的细胞会死亡，还是不要用流式来做了。2.可以做原位免疫组化，比如用
来做就行了。TUNEL法，我已经做过了，做不出来！
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丁香园准中级站友
firstaid261 TUNEL法，我已经做过了，做不出来！1.原位的不行，那就是看total的了。2.或是找新鲜组织来看，来检测下一些死亡通路中的受体配体什么的。
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不可以，冻存的组织一般只能做Western检测蛋白水平了，连普通的免疫组化都做不了呢，更别提要求更高的流式细胞术了
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肯定不可以，有做过活组织之间染色的吗。不做免疫染色。荧光染色
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不能做流式凋亡，流式凋亡要染活细胞，
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非常感谢大家！
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