降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性研究及其基因组Fosmid文库构建--《南京农业大学》2013年硕士论文
降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性研究及其基因组Fosmid文库构建
【摘要】：脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol, DON),又名呕吐毒素(vomitoxin),主要是由镰刀菌产生的真菌毒素,该毒素广泛存在于大麦、小麦、玉米、高粱、燕麦等谷类作物中。不仅影响粮食的产量和品质,而且可以通过食物链在人畜体内积累,进而危害人畜的健康。目前主要利用一些物理、化学和生物学手段等去毒技术来处理DON的毒害。与传统的物理和化学方法相比,只有生物学方法才可以解决存在的问题,因而关于消除真菌毒素的污染,采用生物学方法成为目前研究的热点和焦点。采用生物学手段筛选降解真菌毒素的高效降解菌,并使该降解菌在实践中发挥应有的作用,对保证食品安全,减少粮食、畜牧业的经济损失有积极意义。本课题组在之前的研究中已经分离到一株高效降解DON的菌株,即Devosia sp.DDS-1。以往的研究表明,DDS-1首先把DON乙酰化为3-AC-DON,然后3-AC-DON往下氧化为3-酮基-DON,接下来再进一步降解。本论文主要通过研究DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性,以期掌握DDS-1降解3-AC-DON(?)3-酮基-DON特性,为该酶的开发利用奠定理论基础；还构建了该菌的Fosmid文库,为克隆其降解功能基因提供技术平台。本论文酶学实验结果显示,Devosia sp. DDS-1产生3-AC-DON氧化酶的最适条件为：pH值-7.0、25℃、培养36小时。3-AC-DON氧化酶的最适反应条件是：温度35℃,pH值-7.0；该酶在20～40℃,pH 5.0～9.0的范围内能保持80%以上的酶活；大多数金属离子在浓度为0.2 mmol·L-1和2 mmol·L-1之间对3-AC-DON氧化酶有促进作用；EDTA对该酶活有抑制作用,结果表明该氧化酶需要金属离子作为酶反应的辅因子；酶的定域实验表明,DDS-1中的3-AC-DON氧化酶属于胞内酶；DDS-1产生的粗酶液能很好地降解小麦中的DON,3-AC-DON,15-AC-DON毒素。本论文构建了Devosia sp. DDS-1的基因组Fosmid文库。为了获得高质量的DDS-1基因组DNA,本论文采用三种方法提取基因组DNA,分别是CTAB/NaCl法,试剂盒法和改进的试剂盒法,结果表明,相较于传统的CTAB/NaCl法,采用改进的试剂盒提取法,即在普通试剂盒提取的基础上,加上酚/氯仿/异戊醇,氯仿/异戊醇等流程,大大提高了基因组DNA的质量。该文库共包含2000个克隆,平均插入片段大小为35 kb,初步估计总容量为70 Mb,覆盖Devosia sp. DDS-1基因组(按5M计算)14倍,克隆产物在继代培养中没有发生明显变化,该文库可以满足基因组测序、基因克隆的要求。
【关键词】：
【学位授予单位】：南京农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2013【分类号】：Q936;Q78【目录】：
摘要9-11ABSTRACT11-13缩略语13-14第一章 文献综述14-34 1. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒素污染14-19
1.1 毒素危害的概述14
1.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的污染14-15
1.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的产生影响因素15
1.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的结构与理化性质15-16
1.5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的毒性机理16-18
1.5.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇急性毒性作用16
1.5.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇慢性毒性作用16-17
1.5.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的致畸、致突变、致癌作用17
1.5.4 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的细胞毒性作用17-18
1.5.5 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的免疫毒性与联合毒性作用18
1.6 脱氧雪腐镰刀菌烯醇与人类疾病的关系18-19
1.7 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的限量标准19 2. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的分离与检测技术19-23
2.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的提取19
2.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的净化19-20
2.3 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的检测方法20-23
2.3.1 生物学检测方法20
2.3.2 物理化学检测法20-22
2.3.2.1 薄层色谱法(thin-layer chomatography,TLC)21
2.3.2.2 气相色谱法(gaschomatography,GC)21-22
2.3.2.3 高效液相色谱法(high performance liquid chomatography,HPLC)22
2.3.3 酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)22-23 3. 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的脱毒技术23-26
3.1 物理方法23-24
3.1.1 漂洗23
3.1.2 热加工23-24
3.1.3 离子辐照24
3.1.4 无机吸附24
3.2 化学方法24-25
3.2.1 碱处理24
3.2.2 氧化剂的氧化作用24-25
3.2.3 还原剂作用25
3.3 生物方法25-26
3.3.1 微生物的菌体吸附作用25
3.3.2 微生物降解25-26 4. 国内外对微生物去除脱氧雪腐镰刀菌烯醇污染的研究进展26-27 5. 基因组文库在微生物中的应用27-31
5.1 基因组文库概述27-28
5.2 大片段基因组文库28-31
5.2.1 Cosmid文库28
5.2.2 Fosmid文库28-30
5.2.3 BAC文库30
5.2.4 大片段基因组文库在微生物研究中的应用30-31 6. 本研究的目的31-34
6.1 目前存在的问题31
6.2 本研究的目的意义31-34第二章 降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的酶学特性研究34-52 第一节 降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶酶液反应体系的建立34-44
1. 材料与方法34-38
1.1 材料34-35
1.1.1 菌种来源34
1.1.2 培养基及试剂34-35
1.2 实验仪器35
1.3 方法35-38
1.3.1 DDS-1种子液的制备35
1.3.2 粗酶液的制备35
1.3.3 粗酶液的纯化35-36
1.3.4 酶活力测定方法36
1.3.5 标准曲线36-37
1.3.6 DON与3-AC-DON含量的计算方法37
1.3.7 Devosia sp.DDS-1最适产酶条件37-38
2. 结果与讨论38-43
2.1 标准曲线的制作及线性关系38-39
2.2 3-AC-DON降解酶的反应进程曲线与酶浓度曲线39-40
2.3 硫酸铵饱和度的确定40-41
2.4 菌株最适产酶条件41-43
2.4.1 培养时间对DDS-1生长和产酶的影响41-42
2.4.2 pH值对DDS-1生长和产酶的影响42
2.4.3 培养温度对DDS-1生长和产酶的影响42-43
2.4.4 最佳产酶条件的优化43
3. 结论43-44 第二节 降解菌DDS-1产3-AC-DON氧化酶的特性研究44-52
1. 材料与方法44-46
1.1 菌株、培养基、试剂及仪器44
1.2 方法44
1.2.1 DDS-1种子液的制备44
1.2.2 粗酶液的制备44
1.3 酶活力的测定44
1.4 酶学性质的初步研究44-45
1.4.1 温度对酶活的影响44-45
1.4.2 pH对酶活的影响45
1.4.3 酶的热稳定性45
1.4.4 酶的酸碱稳定性45
1.4.5 金属离子和EDTA对酶活的影响45
1.5 3-AC-DON毒素氧化酶的定域试验45
1.6 DDS-1粗酶液对小麦中DON,3-AC-DON,15-AC-DON的降解45-46
2. 结果与分析46-50
2.1 酶学性质46-49
2.1.1 温度对酶活的影响46
2.1.2 pH对酶活的影响46-49
2.2 酶的定域试验49-50
2.3 DDS-1粗酶液对小麦中DON,3-AC-DON,15-AC-DON的降解50
4. 结论50-52第三章 降解菌DDS-1基因组FOSMID文库构建52-70 第一节 降解菌DDS-1基因组总DNA的提取52-57
1. 材料与方法52-56
1.1 材料52-54
1.1.1 菌种来源52
1.1.2 培养基及试剂52-54
1.1.3 仪器54
1.2 方法54-56
1.2.1 基因组DNA提取54-56
1.2.2 电泳检测56
2. 结果与分析56-57 第二节 降解菌DDS-1基因组FOSMID文库构建57-70
1. 材料与方法57-63
1.1 材料57-58
1.1.1 菌种来源57
1.1.2 培养基及试剂57
1.1.3 仪器57-58
1.2 方法58-63
1.2.1 Fosmid文库构建流程58-61
1.2.2 文库质量鉴定及评价61-62
1.2.3 Fosmid克隆的PCR验证62-63
2. 结果63-67
2.1 合适片段DNA的制备63
2.2 DNA片段回收63-64
2.3 包装物滴度计算64
2.4 文库质量鉴定64-66
2.4.1 重组率、插入片段大小及文库覆盖度分析64-65
2.4.2 Fosmid克隆稳定性鉴定65-66
2.5 Fosmid克隆的PCR验证66-67
3. 讨论67-70全文总结70-72参考文献72-82攻读硕士期间发表的论文82-84致谢84
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盐单胞菌Fosmid文库构建及群体感应淬灭酶的筛选Fosmid基因组文库构建及应用现状--《江苏农业科学》2013年06期
Fosmid基因组文库构建及应用现状
【摘要】：稳定的大片段基因组文库是生物基因组学研究的基础材料平台。近年来Fosmid载体由于其插入片段大小适中、易于构建、稳定性好、拷贝数可诱导等优点,越来越广泛地被应用于物理作图、基因挖掘、辅助测序等工作。本文就Fosmid克隆载体发展历程、Fosmid文库的功能及其在各领域的应用现状、发展前景等方面展开论述,主要呈现构建Fosmid基因组文库的作用及应用现状。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：Q785【正文快照】：
稳定的大片段基因组文库是生物基因组学研究的基础材料平台[1]。不同文库间区别主要在于载体系统的不同。自从1973年Cohen等引入质粒pSC101作克隆载体[2]以来,克隆载体的结构和效率方面已有了很大的发展。现在使用的载体除了噬菌体载体[3]和黏粒载体[4]以外,还有酵母人工染色
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北京索莱宝科技有限公司
北京市通州区马驹桥镇联东U谷景盛南四街15号85A三层
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产品详细描述
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产品简介：本试剂盒采用可以特异性结合核酸的硅基质膜和独特的缓冲液系统，既适用于革兰氏阴性菌基因组DNA的提取，也适用于革兰氏阳性菌基因组DNA的提取。可从1-5ml细菌培养液中快速提取纯化10-40ug纯净的基因组DNA，所得基因组DN**段大，纯度高，质量稳定可靠，可用于各种分子生物学常规试验，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。本试剂盒无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。
产品包装：
试剂盒组成 & & D1600-50 & & & & & D & & & &储存条件
RNase A & & & & & & 1ml & & & & & & & & & &2ml & & & & & & & & -20℃
蛋白酶K & & & & & & &1ml & & & & & & & & & &2ml & & & & & & & & -20℃
溶液A & & & & & & & &15ml & & & & & & & & &25ml & & & & & & & & &RT
溶液B & & & & & & & &15ml & & & & & & & & & 25ml & & & & & & & & RT
漂洗液 & & & & & & & 15ml & & & & & & & & 15ml&2 & & & & & & & RT
洗脱液 & & & & & & & 15ml & & & & & & & & & &30ml & & & & & & & &RT
吸附柱 & & & & & & & &50个 & & & & & & & & & 100个 & & & & & & & RT
收集管 & & & & & & & &50个 & & & & & & & & & 100个 & & & & & & & RT
说明书 & & & & & & & & &1份 & & & & & & & & & & &1份 & & & & & & & &RT
注意事项：
1、本试剂盒置于室温(15-25℃)干燥条件下可保存12个月，更长时间的保存可置于2-8℃。
2、相对于革兰氏阴性菌来说，革兰氏阳性菌的细胞壁结构特殊，基因组DNA更不容易被有效地释放出来，因此革兰氏阳性菌在进行基因组提取时需要使用溶菌酶等特殊处理后，再按照革兰氏阴性菌的操作步骤进行基因组DNA的提取。常见的革兰氏阳性菌有：肺炎球菌、葡萄球菌、链球菌等。
3、样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DN**段较小且提取量也下降。
4、如果试剂盒中的溶液出现沉淀，可在65℃水浴中重新溶解后再使用，不影响效果。
5、如果样品消化不彻底，后面的离心步骤中可能会出现堵柱子的情况，可适当延长离心时间。
6、洗脱缓冲液的体积最好不少于50ul，体积过小会影响回收效率；洗脱液的pH值对洗脱效率也有影响，若需要用水做洗脱液应保证其pH值在8.0左右(可用NaOH将水的pH值调至此范围)，pH值低于7.0会降低洗脱效率。
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