举一反三（巩固练习，成绩显著提升，去）
根据问他()题库系统分析，
试题“请回答基因工程方面的有关问题:(1)利用PCR技术扩增目的基...”，相似的试题还有：
请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为_______。②在第_______轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。①第1组：_______；②第2组：_________。(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为__________。(4)用限制酶EcoRⅤ、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图(1kb 即1000个碱基对)，请在直接在下图的质粒上画出EcoRⅤ、MboⅠ的切割位点。
(8分)请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为&&&&&&&&&&。②在第&&&&&&&&&轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的一组引物(只标注了部分碱基序列)不合理(如下图)，请说明理由。&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&；&(3) PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的&功能，这是因为&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
请回答基因工程方面的有关问题：(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链DNA 片段，它是子链合成延伸的基础。①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A 的DNA 片段所占的比例为________。②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA 片段。(2)设计引物是PCR 技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。①第1 组：________________________；②第2 组：________________________。(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA 聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA 聚合酶的功能，这是因为____________________________________________________________。(4)用限制酶EcoRV 、MboⅠ单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA 片段长度如下图(1 kb 即1 000 个碱基对)，请画出质粒上EcoRV 、MboⅠ的切割位点。考点2　PCR技术的基本操作和应用&&人教版
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考点2 PCR技术的基本操作和应用1．PCR原理2．PCR反应的过程及结果(1)PCR反应过程①变性：当温度上升到90_℃以上时，双链DNA解聚为单链，(如下图)。②复性：系统温度下降至50_℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，(如下图)。③延伸：当系统温度上升至72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，(如下图)。(2)结果①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。特别提醒1.DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。2．DNA分子复制的人工控制解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。复制条件：缓冲液、DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶和两种引物。反应场所：PCR仪。PCR技术中的引物：①含义：引物是一小段单链DNA或RNA分子。②作用：为DNA聚合酶提供合成的3′端起点。③种类：扩增一个DNA分子需要2种引物。④数目：引物数目等于新合成的DNA子链数目。⑤与DNA母链的关系：两种引物分别与DNA母链的3′端通过碱基互补配对结合。 PCR技术过程的考查(2013?江苏，22改编)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是( )。①设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列②用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列[来源:www.shulihua.netwww.shulihua.net]③PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶④一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞A．①②B．①③C．②③D．②④解析 本题考查基因工程中基因表达载体的构建、受体细胞的选择以及PCR技术等内容，意在考查考生的综合运用能力。设计引物时应当考虑扩增的目的基因两端的序列要与载体两端的序列进行互补配对，①项错误；PCR体系中应用耐高温的DNA聚合酶，而不是从受体细胞中提取的普通DNA聚合酶，③错误。答案 D[对点强化]PCR是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个。PCR需要模板DNA、引物、脱氧核苷酸和DNA聚合酶等条件。下图为模板DNA分子及2种引物，请回答相关问题。(1)PCR的全称是________。PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在温度环境的不同，在PCR技术中先用95℃高温处理的目的是________，而这一过程在细胞内是通过________实现的。(2)在PCR技术中所需要的引物实质上是一种________。请在图中绘出引物结合的位置。(3)若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入________个引物。(4)DNA子链复制的方向是________，这是由于__________________________________________________________________________________________________________________________________________。解析 本题考查考生对PCR技术的理解，属于知识识记和理解层次的考查。PCR技术又称多聚酶链式反应。在PCR技术中，用95℃高温处理的目的是使DNA分子中的氢键断裂，两条链解开，即使DNA分子变性。引物是一种单链DNA或RNA分子，它能与解开的DNA母链的3′端结合，为DNA聚合酶提供吸附位点，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，从而决定了DNA子链复制的方向是从5′端到3′端。在DNA分子扩增时，需要2种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目，即2×210－2＝211－2(个)。答案 (1)多聚酶链式反应 使DNA变性(使DNA的两条链解开) 解旋酶的催化(2)单链DNA或RNA分子 如图所示(3)211－2(4)从5′端到3′端 DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接单个脱氧核苷酸分子V归纳比较细胞内DNA复制与PCR技术的比较[来源:www.shulihua.net]细胞内DNA复制PCR[来源:www.shulihua.net][来源:www.shulihua.net]不同点解旋在DNA解旋酶作用下，边解旋边复制80～100℃高温解旋，双链完全分开酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA或RNA温度体内温和条件高温相同点①需提供DNA复制的模板②四种脱氧核苷酸为原料③子链延伸的方向都是从5′端到3′端
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题号：3979843试题类型：单选题 知识点：&&更新日期：
下列关于生物技术实践的叙述中,不正确的是(& )A.加酶洗衣粉中添加的酶可能有纤维素酶、脂肪酶、淀粉酶和碱性蛋白酶等B.利用PCR技术扩增目的基因时,引物Ⅰ和引物Ⅱ的碱基序列一定互补配对C.与斐林试剂检测相比,用尿糖试纸检测尿液中的葡萄糖,特异性更强、灵敏度更高D.腐乳制作过程中,添加料酒、香辛料和盐,均可以抑制杂菌的生长
难易度：中等
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bioinformatics（23）
lPCR引物设计及相关软件使用
v2、PCR引物设计原则
v3、常用PCR引物设计软件
v4、Primer Premier 5.0 介绍
v5、Oligo 6.44介绍
v6、在线Primer3 介绍
l1、背景——什么是PCR？
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。
l2、PCR引物设计原则
v引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。
引物设计的总原则
v引物与模板的序列要紧密互补
v引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构
v引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
v如引物长度（primer length），产物长度（product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用?G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。
v1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-24 bp，但不应大于38。
?引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。
?例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3 x 109/412=200 ).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个.
?较长的引物（28-35bp)
?一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点
vTm值的计算
v一般的公式
vTm = 4 (G+C) + 2(A+T)
v对于长一些的引物可用更为准确的
vnearest-neighbor （Frier et al. (1986) ）
v2）、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。
v3）、引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。
v4）、引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。
不同的算法推荐45-55%或50-60%
v5）、?G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端?G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G 值相对较高的引物。引物的3’端的?G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合）。
v6）、对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。
v7）、引物二级结构对PCR反应的影响。
尽可能少的引物二聚体。
l3、常用的引物设计软件
vOligo 6 （引物评价）*
vPrimer Premier （自动搜索）*
vVector NTI Suit
vPrimer3 （在线服务）*
l4、Primer Premier 5.0 的使用技巧简介
1）、引物设计
2）、限制性内切酶位点分析
3）、DNA 基元(motif)查找
4）、同源性分析
l简并引物设计
v根据氨基酸序列来设计引物DNA引物
Premier Primer 5提供了8种生物遗传密码使用的偏好选择
1、纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）
2、无脊椎动物线粒体（Invertebrate Mitochondrion）
3、支原体（Mycoplasma）
4、植物线粒体（Plant Mitochondrion）
5、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）
6、一般标准（Standard）
7、脊椎动物线粒体（Vertebrate Mitochondrion）
8、酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）
lSome other useful function of Premier Primer 5
l5、Oligo 6.44 使用说明
主要功能：专门的引物设计软件
l用Oligo 设计引物时的3个标准
Tm 值曲线以选取5’到3’的下降形状有利于引物引发聚合反应。
Frq 曲线宜选用3’端Frq 值相对较低的片段。
ΔG 值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低。
?首先检查引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。
? 二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。
? 第三项检查为GC 含量，以45-55％为宜。
? 第四False priming 检查。
l6、Online primer3 service
v设计引物的免费在线软件Primer3，其网址：
http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi
或http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
我的评价：
是非常优秀的设计引物的软件！
是真正的“免费的午餐”！
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(1)(2)(2)(1)(2)(1)(1)(1)(3)(4)(3)(2)(4)(1)(1)(3)(1)(2)(7)(5)(5)(2)(1)(2)(5)(1)(2)(2)(1)(1)【转载】PCR扩增的基本原理与2011年江苏高考生物33题答案解析
PCRDNADNADNADNADNA
PCRDNA4dNTP3’DNADNADNAdNTPTaq DNAMg2+DNATaq DNAdNTP5’→3’DNAPCRDNADNA
DNA90~95℃DNADNAG-CG-CA-TG-CPCRDNADNAG-CG-CDNADMSOPCR97℃
37~65℃DNA-DNA12min
DNA-Taq DNAdNTPDNA--“”DNA72℃Taq DNA4060/“--”DNADNA24minPCR304023h“”DNA
PCRDNADNAY1XnYDNAXYn100%DNAPCRDNA“”PCRDNAPCR
PCR5'DNA3'5'3'“”“”5'3'“”“”“”PCRDNA
(1)PCRDNADNA
①ADNA
②▲DNA
①1▲②2▲
PCRDNADNA▲
(4)EcoRVMbolDNA(1 kb
1000)EcoRVMbol
……2011PCRPCR
①IIA3/47/8DNAIIIIA15/16
②ABDNA
&(2)PCRPCR DNADNA
15-30bp20bp
200-500bp10kb
3G+C40-60%G+CG+CATGC5
①IⅡ
②I’
(4)EcoRVMbol
(1)&#②(2)①IⅡ
②I’
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