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【求助】Western blot：细胞色素C检测不出来？
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【求助】Western blot：细胞色素C检测不出来？
我用药物诱导细胞凋亡后，收集细胞，制备细胞裂解液后（常规方法制备，可能不包括线粒体中的蛋白），用15%的SDS-Page分离蛋白，然后15V，80min转0.22um的PDVF膜，1抗室温孵育2hr，2抗室温孵育1hr，然后显色观察。没有发现任何细胞色素c的条带出现。由于转膜后我的PDVF膜上存在5kd，10kd以及15kd的蛋白marker，所以个人推测转膜应该没有问题，因为细胞色素c大约为14kd左右，所以应该也能转上。但是为什么没有条带呢？
再补充一下：我以前做过活化的caspase-3的western，其分子量大概17kd，19kd，用上面的方法是可以检测出来的，但是为什么细胞色素c检测不出来呢？他们的分子量差不多啊。
注：转膜后发现与膜接触的那张滤纸上有10kd 的蛋白marker痕迹，是不是过转了？
请大家帮助我。在线等。
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你怎么制备蛋白？是只收集了细胞液？可能不包括线粒体中的蛋白？？
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我是按每个样品加50ul裂解液（RIPA，PMSF，cocktail）然后吹打30次，冰上静置10min，高速离心20min，再冰上静置10min，蛋白定量后加loading buffer，99度加热5min离心后-20度保存。
这是我们实验室的常规制备方法，检测其他蛋白时都不错。就是细胞色素c搞不出来。怎么回事呢？
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正常情况下，Cytochrome C 位于线粒体内膜，裂解液中要含有约1% Triton X-100，并充分匀浆才有可能溶解下来。建议使用全细胞裂解液，即SDS-loading buffer去裂解细胞，效果更好。
细胞凋亡时，Cytochrome C有可能释放到胞浆，经常有人检测这一部分的Cyt C作为apoptosis的依据。但是这一部分的Cyt C量很少，要加大上样量。
我不清楚Caspase 3的亚细胞定位，如果和BCL2 及Bax一样，那就位于线粒体外膜上，朝向胞浆，比较容易提取。
此外，Apoptosis情况下，释放到Cyt C的量也是微乎其微的，建议使用更大的蛋白质上样量，缩短转膜时间（分子量较小），加长一抗孵育时间至2-3hrs，可以增强信号。因为即使以前我们制备线粒体，并以Cyt C作为control,信号也不是很强。
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请问：是不是分子量越小的蛋白转膜速度越快啊？而大分子量的蛋白转膜速度慢呢？如果转膜时间过长，会不会导致小分子量的蛋白转到滤纸上了。
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原帖由 zhihui小新 于
15:52 发表
请问：是不是分子量越小的蛋白转膜速度越快啊？而大分子量的蛋白转膜速度慢呢？如果转膜时间过长，会不会导致小分子量的蛋白转到滤纸上了。 很对
小分子量可以用半干
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1. 如果你在滤纸上看到了maker，就表示很可能就是转过去了。
你做这么小的蛋白，PVDF膜的孔径多大呢？
最好用0.2um那种，一般不会转过去的。
如果你用的是0.45um的甚至更大的，就有可能转过去。所以下次你可以转膜轻点试试，滤纸上不能看到marker为好。
2. 你确定你的 primary antibody 没问题？ 最好有个control，如果你从来没有用该抗体看到过条带，说明抗体的原因也得考虑考虑，不是吗？
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我的抗体是cell signaling的，应该没问题吧？
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各位师兄，我想问一下，说明凋亡时，匀浆怎么排除线粒体中的cytc的影响，就只能证明你wb的是胞浆中凋亡释放的cytc呢
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使用线粒体胞浆分离试剂盒提取线粒体和去线粒体胞浆，然后分别检测细胞色素c，如果线粒体中减少，胞浆中增加可以证明细胞色素C的释放。关注今日：10 | 主题：75044
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【求助】Cleaved-caspase-3
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这个帖子发布于7年零343天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
Cleaved-caspase-3
和caspase-3 有什么区别？我想检测细胞的凋亡率，应该买那个一抗，谢谢啦
不知道邀请谁？试试他们
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caspase-3 和Cleaved-caspase-3 区别在于：caspase-3切割（cleaved）活化之后就会变成Cleaved-caspase-3 ，即后者是前者的活化形式。如果您要检测凋亡率的话，可以买cleaved-caspase-3。需要留意的是：如果做WB，有些caspase-3的抗体是可以同时检测Cleaved-caspase-3 的。
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13579yyy1 Cleaved-caspase-3 ，应该是mature caspase-3，不应该说是活化的形式吧？Cleaved Caspase-3---- an Activated Form of Caspase-3（1）BackgroundCaspases are a family of cysteine proteases that are key mediators of programmed cell death or apoptosis (2). The precursor form of all caspases is composed of a prodomain, and large and small catalytic subunits. The active forms of caspases are generated by several stimuli including ligand-receptor interactions, growth factor deprivation and inhibitors of cellular functions. All known caspases require cleavage adjacent
to aspartates to liberate one large and one small subunit, which associate into a2b2 tetramer to form the active enzyme.
Gene for Caspase-3 also known as Yama, CPP32, and apopain codes for a 32-kDa protein (3-5). Caspase-3 cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) to a specific 85 kDa form observed during apoptosis and is inhibitable by the CrmA protein. Other Caspase-3 substrates include DNA-PK, actin, GAS2, and procaspase-6, etc (6).
Caspase-3 is activated by cleavage
events at Asp-28/Ser-29 (between N-terminal pro-domain) and Asp-175/Ser-176 (between large and small subunits) to generate a large subunit of 17-kDa and a small subunit of 12-kDa (4). Reference1.Kobayashi T,et al.Clin Cancer Res. 13:7.2. Cohen GM. Biochem J. 326:1-16, 1997.3. Fernandes-Almnemri T, et al. J. Biol. Chem. 269:94.4.
Tewari M, et al. Cell 81: 801-809, 1995.5. Shi L, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:96.6. Villa P, et al. TIBS 22: 389-392, 1997.
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13579yyy1 an Activated Form of Caspase-3：Caspase-3 is activated by cleavage events at Asp-28/Ser-29 (between N-terminal pro-domain) and Asp-175/Ser-176 (between large and small subunits) to generate a large subunit of 17-kDa and a small subunit of 12-kDa .我觉得应该说是形成多聚体后才能叫做活化吧，如果你单纯的剪切的亚单位只能叫做成熟.如果他们不能形成多聚体是不能发挥作用的！The caspase-3 precursor is first cleaved at Asp 175-Ser 176 toproduce the p11 subunit and the p20 peptide. Subsequently, the p20 peptideis cleaved at Asp 28-Ser 29 to generate the mature p17 subunit.The activecaspase-3 enzyme is a heterodimer
composed of two p17 and two p11 subunits.谢谢您的回复。关于您提出的问题，我很仔细地温读了一些文献，下面是学习心得：1、您最后的一段话应该是出自Santa cruz公司关于caspase抗体的背景介绍。其中提到“mature p17 subunit”，这个提法是与文献相对应的，即mature subunit，在谈及caspase的文献中与其相对应的即为mature caspase。所以mature caspase的提法也是成立的。2、何为mature caspase？其实您刚好把mature caspase理解颠倒了。p17和p12两个subunit形成的heterodimer才叫mature caspase-3。文献原文如下：Together, the p12 and p17 subunits then form the mature caspase-3 。（图解见下面）不知我说明白没有。至于“cleaved caspase--an Activated Form of Caspase-3&就如我上帖所讲，是有文献依据的。虽然就您个人的理解这么定义似乎不妥，但这毕竟是有依据的。谢谢您的关注和交流，让我对这个问题有了进一步的认识。向您推荐一篇参考文献，全文键接：http://www.jbc.org/cgi/reprint/272/20/13432
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caspase-3 和Cleaved-caspase-3 区别在于：caspase-3切割（cleaved）活化之后就会变成Cleaved-caspase-3 ，即后者是前者的活化形式。如果您要检测凋亡率的话，可以买cleaved-caspase-3。需要留意的是：如果做WB，有些caspase-3的抗体是可以同时检测Cleaved-caspase-3 的。
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Cleaved-caspase-3 ，应该是mature caspase-3，不应该说是活化的形式吧？
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13579yyy1 Cleaved-caspase-3 ，应该是mature caspase-3，不应该说是活化的形式吧？Cleaved Caspase-3---- an Activated Form of Caspase-3（1）BackgroundCaspases are a family of cysteine proteases that are key mediators of programmed cell death or apoptosis (2). The precursor form of all caspases is composed of a prodomain, and large and small catalytic subunits. The active forms of caspases are generated by several stimuli including ligand-receptor interactions, growth factor deprivation and inhibitors of cellular functions. All known caspases require cleavage adjacent
to aspartates to liberate one large and one small subunit, which associate into a2b2 tetramer to form the active enzyme.
Gene for Caspase-3 also known as Yama, CPP32, and apopain codes for a 32-kDa protein (3-5). Caspase-3 cleaves the death substrate poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) to a specific 85 kDa form observed during apoptosis and is inhibitable by the CrmA protein. Other Caspase-3 substrates include DNA-PK, actin, GAS2, and procaspase-6, etc (6).
Caspase-3 is activated by cleavage
events at Asp-28/Ser-29 (between N-terminal pro-domain) and Asp-175/Ser-176 (between large and small subunits) to generate a large subunit of 17-kDa and a small subunit of 12-kDa (4). Reference1.Kobayashi T,et al.Clin Cancer Res. 13:7.2. Cohen GM. Biochem J. 326:1-16, 1997.3. Fernandes-Almnemri T, et al. J. Biol. Chem. 269:94.4.
Tewari M, et al. Cell 81: 801-809, 1995.5. Shi L, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:96.6. Villa P, et al. TIBS 22: 389-392, 1997.
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composed of two p17 and two p11 subunits.谢谢您的回复。关于您提出的问题，我很仔细地温读了一些文献，下面是学习心得：1、您最后的一段话应该是出自Santa cruz公司关于caspase抗体的背景介绍。其中提到“mature p17 subunit”，这个提法是与文献相对应的，即mature subunit，在谈及caspase的文献中与其相对应的即为mature caspase。所以mature caspase的提法也是成立的。2、何为mature caspase？其实您刚好把mature caspase理解颠倒了。p17和p12两个subunit形成的heterodimer才叫mature caspase-3。文献原文如下：Together, the p12 and p17 subunits then form the mature caspase-3 。（图解见下面）不知我说明白没有。至于“cleaved caspase--an Activated Form of Caspase-3&就如我上帖所讲，是有文献依据的。虽然就您个人的理解这么定义似乎不妥，但这毕竟是有依据的。谢谢您的关注和交流，让我对这个问题有了进一步的认识。向您推荐一篇参考文献，全文键接：http://www.jbc.org/cgi/reprint/272/20/13432
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谢谢，我已经更新了知识！最后个问题，mature 和 active caspase-3在功能上到底有什么区别，或者说到底哪个才是executor呢？
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13579yyy1 谢谢，我已经更新了知识！最后个问题，mature 和 active caspase-3在功能上到底有什么区别，或者说到底哪个才是executor呢？其实，我个人认为mature和active caspase-3并没有本质的区别，只是mature caspase的提法比较少，pubmed检索至今745篇文章；active caspase检索结果却为4288篇。最终的executor即为heterodimer，至于应该怎样命名，这并不是我这样一个非专业人士需要关注的核心问题，知道其具体的原理就行了。但我依然会坚持“cleaved caspase--an Activated Form of Caspase-3&的提法，因为这是我在文献中见到最多的。个人观点，仅供参考。
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其实我关心是检测p17或者p11亚单位表达量的多少是否能能真正代表caspase-3的激活程度，是不是应该多做个caspase-3的底物来反映caspase-3的激活程度，这样会更加有说服力些吧！本小硕正在做这方面的工作，希望大家能给点意见！
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想问个问题，检测caspase-3的时候，我的对照也有caspase-3切割，不知道是什么原因，是不是样品处理时的问题，各位是怎么处理样品的
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麻烦问下各位大侠，如果细胞随着药物剂量的增多随之凋亡也增多后，如果用western检测剪切钱的casepase-3是应该增多呢还是逐渐递减呢？
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rna507 麻烦问下各位大侠，如果细胞随着药物剂量的增多随之凋亡也增多后，如果用western检测剪切钱的casepase-3是应该增多呢还是逐渐递减呢？&剪切钱的casepase-3&？？---------剪切前的casepase-3剪切前的casepase-3即为procasepase-3，在“如果细胞随着药物剂量的增多随之凋亡也增多&的情况下，其表达量通常是逐渐减少的。之所以说是“通常”，那是因为存在非caspase依赖的凋亡途径，如果刚好那种药物仅是通过非caspase依赖的途径诱导凋亡，那么caspase就可能无变化，这种情况虽不常见，但在理论上存在可能性。
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请问，就是说如果凋亡诱导增加的情况下，caspase3 就应该减少，而cleaved caspase3 增加，对吗？多谢！
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为什么WB测凋亡CASPASE-3表达，而CLEAVE CASPASE-3不表达呢
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谢谢，学习了。
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请问一下，您做的关于cleaved-caspase-3的WB最后的结果是什么样的呢，我最近也想做caspase-3的表达，是诱导细胞凋亡的，但是不知道是应该找cleaved-caspase-3还是caspase-3，所以想问一下您是怎么做的，还有啊，您买的是哪一家的哪一个抗体呢~谢谢了~
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求助：最近我在做关于cleaved-caspase-3的WB，膜是0.45的，为什么marker可以转上去，蛋白却不行啊？求各位大侠指点。
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绿色阳光p 求助：最近我在做关于cleaved-caspase-3的WB，膜是0.45的，为什么marker可以转上去，蛋白却不行啊？求各位大侠指点。 你可以试试0.2的膜，因为cleaved caspase 3小于20KD另外据说SDS是促进大蛋白转膜的，甲醛是促进小蛋白，你可以调整下两者的比例
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谢谢你的回复，我用0.2的膜也试着做了，还是没有，我想是不是其他什么地方出了问题，你帮我看下好吗？我配的分离胶是15%，浓缩胶是4%，电泳完后，转膜90分钟，这次转膜是用的0.2的膜，之后用牛奶室温封闭1h，附一抗过夜，请问这些过程哪里有问题吗？
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感谢卤煮的分享。
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透射电镜观察细胞自噬****
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dachong99 edited on
doctormy caspase-3 和Cleaved-caspase-3 区别在于：caspase-3切割（cleaved）活化之后就会变成Cleaved-caspase-3 ，即后者是前者的活化形式。如果您要检测凋亡率的话，可以买cleaved-caspase-3。需要留意的是：如果做WB，有些caspase-3的抗体是可以同时检测Cleaved-caspase-3 的。想知道你这个caspase-3是从哪里买的，哪个公司的，以及货号~~~~~我买过好几个都做不好。
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买cst公司的
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这种常用的国产的也不错，当然cst神马的我也用过。碧云天的其实也可以。
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Cleaved-caspase-3就是活化后的caspase3具有促凋亡的能力？pro-caspase-3就是总的caspase3？求解答
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wanglover 买cst公司的
比较好用请问 你的转膜条件是什么？
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跟实验室老师的解释差不多，老师也说，如果凋亡增加的话，全长的CAS-3应该是减少，激活的片段CAS-3应该是增加，看了上面的帖子更明白了，谢谢！
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caspase-3 和Cleaved-caspase-3
区别在于：caspase-3切割（cleaved）活化之后就会变成Cleaved-caspase-3
，即后者是前者的活化形式。如果您要检测凋亡率的话，可以买cleaved-caspase-3。需要留意的是：如果做WB，有些caspase-3的抗体是可以同时检测Cleaved-caspase-3 的。 您好！我现在遇到一个凋亡方面的问题向您请教，我用干扰RNA处理细胞后，貌似细胞的凋亡明显增加。我想从蛋白方面确认下这是否是由凋亡引起，请问我优先可以检测哪个指标呢？我看文献，有些检测Caspase-9和Caspase-3，有些检测Cleaved
Caspase-3 ,我到底优先该检测哪个指标呢？期待您的回复！谢谢！
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倔强的沙枣树
您好！我现在遇到一个凋亡方面的问题向您请教，我用干扰RNA处理细胞后，貌似细胞的凋亡明显增加。我想从蛋白方面确认下这是否是由凋亡引起，请问我优先可以检测哪个指标呢？我看文献，有些检测Caspase-9和Caspase-3，有些检测Cleaved
Caspase-3 ,我到底优先该检测哪个指标呢？期待您的回复！谢谢！已回邮件
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已回邮件收到，非常感谢！
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我也想请教类似的问题，凋亡方面究竟应该优先该检测呢Caspase-3还是Cleaved
Caspase-3 ？谢谢
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一心向学hj
我也想请教类似的问题，凋亡方面究竟应该优先该检测呢Caspase-3还是Cleaved
Caspase-3 ？谢谢必须同时检测的
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已回邮件你好，我有个化合物，对癌细胞有凋亡作用，测凋亡因子，做BCL-2, cleaved-caspase 3、Bax、cleaved-caspase-8，您认为是否可以呢？谢谢！经费不多，能省就省点，呵呵！
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lyz2003cd edited on
倔强的沙枣树
您好！我现在遇到一个凋亡方面的问题向您请教，我用干扰RNA处理细胞后，貌似细胞的凋亡明显增加。我想从蛋白方面确认下这是否是由凋亡引起，请问我优先可以检测哪个指标呢？我看文献，有些检测Caspase-9和Caspase-3，有些检测Cleaved
Caspase-3 ,我到底优先该检测哪个指标呢？期待您的回复！谢谢！我也有这个疑问哦
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