荧光定量PCR仪的发展和应用
一、PCR概述
1、什么是PCR &&&
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。 由美国科学家PE（Perkin&&Elmer珀金-埃尔默）公司遗传部的Dr. Mullis发明，由于PCR技术在理论和应用上的跨时代意义，因此Mullis获得了1993年化学诺贝尔奖。
2、PCR技术发展史 &&&
PCR原理是由一对引物介导，能在动植物体外对特定基因(DNA)片断进行快速酶促扩增，经过n个热循环扩增，扩增产物中所含特定基因数是原始模板数的(1+E)n(0＜E＜1,扩增效率＝n倍)使得检测扩增产物中的特定基因成为可能。
聚合酶链式反应自从1993年到现在很快经历了四代产品：
第一代：手动/机械手式水浴基因扩增 &&& 用三个恒温水浴箱，分别将三个水浴温度恒定在三个温度：PCR的高温变性温度（如94℃）低温复性温度（如58℃），适温延伸温度（如72℃）。再用一个装有PCR标本试管的提篮，用手工在不同温度的水浴箱中依次水浴，标本在每个水浴箱中恒温的时间用秒表计时。 &&&
这种方法的特点是：实验人员劳动强度大，容易因疲劳引起差错；而优点是:设备简单，投资少，与自动化基因扩增仪相比，它无须升降温过程，实验时间短，试验更接近理想PCR反应条件，但由于标本试管从一个水浴箱往另一个水浴箱移动中要较短暂暴露于空气中，因此如移动速度不够快时也会对标本形成温度干扰，影响结果。本方法的另外一些缺点包括只能局限三个温阶（某些PCR反应需要多于三个温阶）、液体污染以及在低气压地区水温难以烧到94℃变性温度等。 &&& 为改进提高本方法的自动化水平，有人设计了机械手装置，替代上述手工移动标本过程，形成了机械手水浴式基因扩增仪，该改进解决了实验人员的高强度劳动问题，但又带来了一个机械手部件大行程频繁相对运动而引起的高故障。这种类型的基因扩增仪在九十年代中期我国北京、上海有定型的产品销售，应用也较广，曾为我国的分子生物学的发展做出过积极贡献，而后便逐步被自动化程度更高的扩增仪替代，现在很少有单位使用。
第二代：自动化控制型定性基因扩增仪 &&& 与上述水浴式扩增仪相比，也有人称该种扩增仪为干式基因扩增仪，它是最具代表性的扩增仪，包括后续介绍的第三代、第四代都是以第二代为基础集成了定量检测部分。
第三代：终点定量/半定量 &&& 第二代的定性PCR只能定性，而无法评价特定核酸的浓度及定量分析，定量PCR至少能达到定性PCR无法实现的下列功能： &潜伏期病毒浓度探测&&&感染程度&&&致病病原体数量变化测定&&&抗病毒药物疗效评估&&&恢复期病毒载量检测。 &&& 自从1996年美国ABI公司发明第一台荧光定量PCR仪以来，PCR技术和应用从定性向定量快速发展，终点定量PCR的优点是设备投资少，对于国内经济条件还不能购买昂贵实时荧光定量PCR仪的科研单位和医疗机构，利用现有的第二代常规定性PCR仪，在添加一台专用的单孔PCR终点产物荧光定量检测仪便可开始工作，起到定量的作用。终点定量PCR技术是从定性向实时定量过渡的一个中间产品，但现在进口的终点定量PCR
第四代：实时定量PCR &&& 实时定量QPCR仪＋实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。设备由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。样品到达域值水平所经历的循环数称为Ct值（限制点的循环数）。域值应设定在使指数期的扩增效率为最大，这样可以获得最准确，可重复性的数据。如果同时扩增的还有标有相应浓度的标准品，线性回归分析将产生一条标准曲线，可以用来计算未知样品的浓度。
二、PCR技术的应用
1、分子生物学研究： &&&
现在PCR技术广泛应用于分子生物学的研究，可以说是分子生物实验室的一项非常常规的技术手段。它常被用于基因表达研究、新药开发研究等领域。 &&& 特别是荧光实时定量PCR仪，可应用于针对一些感染性疾病的药物，如各种病毒病、细菌病等，在新药的开发过程中，快速了解药物对疾病进程的影响可以为新药开发节约大量的人力、时间和资金，与以前所用的Elisa等方法相比，实时荧光定量PCR技术可以快速、准确、定量、灵敏地测定血液或组织中病原体的含量，因此有利用分析药物的作用效果，为比较不同的配方的疗效、用药量、用药时间等等提供快速、定量的评价。此方法除了用于人用药物以外，还可以用于畜用药物，甚至其他经济动物及植物的药物研究等，因此其在药物研究方面的应用范围是很广的。另外，实时荧光定量PCR方法可测定血液中病毒核酸的含量，因此不必等到病人体内产生抗体，同时，由于其灵敏度与Elisa相比不可同日而语，在病毒感染的早期，即血液中病毒含量很低时就可以测定，为将疾病消灭在超早期作出贡献。而对于一些已经上市的新药或是应用了很长时间的老药，其用药的效果以及用药量及用药时间都可以进行进一步的研究，为更加合理化的应用这些药物为人类造福进行进一步的研究。以前所用的方法由于不能准确定量，灵敏度也不够，因此有很多需要研究的内容没有完成。这一方面需要研究内容很多，意义也很大。
2、医疗方面的应用：
⑴ 病原体检测：目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和巨细胞病毒等病原体进行定量测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。
⑵ 产前诊断：到目前为止，人们对遗传性物质改变引起的遗传性疾病还无法治疗，只能通过产前监测，减少病婴出生，以防止各类遗传性疾病的发生，如为减少X连锁遗传病患儿的出生，从孕妇的外周血中分离胎儿DNA，用实时荧光定量PCR检测其Y性别决定区基因是一种无创伤性的方法，易为孕妇所接受。
⑶ 药物疗效考核：对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量分析显示：病毒量与某些药物的疗效关系。HCV高水平表达，干扰素治疗作用不敏感，而HCV低滴度，干扰素作用敏感；在拉米夫定治疗过程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，随后若再度上升或超出以前水平，则提示病毒发生变异。
⑷ 肿瘤基因检测：尽管肿瘤发病的机理尚未清楚，但相关基因发生突变是致癌性转变的根本原因已被广泛接受。癌基因的表达增加和突变，在许多肿瘤早期就可以出现。实时荧光定量PCR不但能有效地检测到基因的突变，而且可以准确检测癌基因的表达量。随着与肿瘤相关的新基因的不断发现，荧光定量PCR技术将会在肿瘤的研究中发挥更大的作用。
(5)在优生优育中的应用：近年来经济发展迅猛，人民生活水平逐年提高，对自身及家人特别是下一代的身体健康愈来愈重视。另外，由于国内计划生育工作逐步走向深化，独生子女比较多，孩子的身体素质更成为长辈们关注的焦点。因此，怎样提高新生儿质量改善人类遗传素质，即优生优育已显得非常重要。以往对遗传性疾病的检测主要使用染色体分析法，而临床绝大部分遗传性疾病是基因病而不是染色体病，染色体发析法不能检出的。若使用PCR基因扩增法联合单链构型多态性分析（sscp）、限制性片段长度多态性分析（RFCP）等位基因特异性寡核某酸（Aso）点杂交或差异PCR可以很方便地检出单个基因的突变而且其准确性可达95%以上，因此使这一问题得到了较好的解决。常见的易致胎儿畸型的感染性疾病原体主要有单疱病毒（HSVⅡ）、风疹病毒（RV）、人巨细胞病毒（HCMV）、弓形体（TOX）及沙眼衣原体（CT）。以往这些病原体感染诊断比较困难，主要靠培养法进行确诊，而培养法费时，代价昂贵，而且受到采样、样本保存及用药等因素的影响，基本不能在临床中推广。PCR基因扩增法因其高敏感性、高特异性非常适合这些疾病诊断及疗效跟踪，是最值得推荐的检验方法。不管是否怀疑胎儿有严重遗传病倾和中或有感染引起的畸形风险，对胎儿的去留应尊重胎儿父母亲的意见。
(6)新的愈后指标的研究：对于感染性疾病，在药物作用至一定程度后，就认为可以停药了，但是应该在什么停药，现在大都没有一个明确的指标，现在所用的指标由于受到检测方法的灵敏度及准确性限制，这一指标未必合理，因此有必要对治愈的指标以及指标与复发率以及疾病转化为其他疾病之间的关系等进行进一步的研究，从而为药物或疗法彻底治愈疾病打下坚实的理论基础。
(7)血液检验漏检率：由于实时荧光定量PCR方法比Elisa灵敏很多，因此，血站或血液研究所一般用来研究Elisa方法的漏检率，即分析Elisa方法测定为阴性的血样，再用实时荧光定量PCR方法来复检。复检时，一般24个Elisa阴性的血样混合成一个样本进行检测。上海用此方法在用于血液制品的血液中发现一例HIV，后经测定供血者，证实病人的确是HIV阳性。由于不同地区所用的Elisa试剂、方法、批号等都不相同，因此不同地区都有必要进行这一工作。
3、新诊断及检验试剂的开发 &&&
现有的很多诊断及检验方法都不能同时满足快速、灵敏、定量的要求如现有培养法、Elisa法等等，而荧光定量PCR方法以则可以做到这一点，从而可为临床疾病、商检、粮油检验、食品检验、血液检验等等开发新的试剂，从而提高检验的灵敏度、速度及准确性等；这类试剂的种类是非常多的，所开发的试剂的社会效益及经济效益都是很巨大的。 & &
由于PCR法尤其是荧光定量PCR方法的快速、灵敏、定量的特点，其在研究及开发方面的应用是不胜枚举的，如研究个人基因型与药物疗效之间的关系等；研究人员也可以根据自已研究项目开发其新的用途。
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请教PCR高手，使用SYBR Green I法进行荧光定量PCR对于产物大小有什么要求？
本人打算做荧光定量PCR，现在做了普通的rt-pcr，三种基因的大小为352bp，362bp，228bp，结果都扩增出来了，下一步打算做荧光定量RT-PCR，荧光染料为SYBR，请问是不是可以接着使用普通Rt-PCR中所使用的引物呢，还是重新设计引物，使其产物大小在50-150bp之间？？？求解答？？
哦 谢谢哈！
恩，非常感谢！我觉得您说的挺对的，只是引物要跨外显子设计，自己设计了一下但是没有找到合适的，要么特异性低，要么Tm值相差超过2度，还是仔细再找找吧
引物只要跨外显子设计就行了，其余的和普通的引物设计一样&&设计的软件是Prime 5.0和 oligo 6.0& &目的产物大小在100-200bp
设计的时候 是在外显子的连接处进行设计&&这样子就避免了内含子的引入
如何才能跨外显子啊？怎么看外显子呢？
请问如何跨外显子啊？本人新手！跨外显子设计是什么目的呢？
外显子的连接处是怎么看的啊？？？？？？、、、
到NCBI里面找到你的目的基因的编码区CDS，编码区里面是外显子集合的，然后你再在基因的全序列中找到外显子，这些外显子就按顺序拼合成CDS区~~~，拼接处，就是连接处
市面上的RT-qPCR试剂盒大多退火温度都在42度，能到50度及以上的极少，因为酶不支持。60度以上到65度实际是最好的，可以消除RNA的二级结构。SYBR Green I是非饱和染料，片段长度太长，荧光信号会出现偏差，不死扩不出来，而是荧光信号出现偏差后的错误信息。
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