结核杆菌可以导致全身性疾病，特别是在发展中国家，其发病率较高，危害性极大.近几年结核杆菌的变异性较大，对抗痨药物的耐药性增加，从而使结核病的发病大幅度增高.虽然传统的涂片抗酸染色、细菌培养以及胸片检查对大部分结核能作出正确的诊断，但对某些病人亦可造成误诊或漏诊;动物接种虽特异性较高，但因时间较长，不能满足临床快速诊断的需要.近几年也出现了几种快速诊断方法，但也存在较大的缺陷，如短期培养后抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BACTEC培养瓶中被培养标本所分泌的抗原，该方法可在BACTEC瓶本身鉴定出细菌之前，结合ELISA和涂片抗酸染色有效地鉴别典型和非典型分枝杆菌，敏感性较高，但存在培养时间长，重复性尚差的缺点.另一种是短期培养后核酸探针杂交法，即用特异性DNA探针与BACTEC瓶中培养的细菌染色体DNA杂交.该方法能有效地防止培养的假阴性结果，但却易发生假阳性结果，加之采用的方法较为复杂和繁琐，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近来已较少应用.上面两种方法都要借助细菌培养来进行，虽然在时间上比传统培养大大缩短，但缺乏快速诊断的优势.近几年兴起的PCR方法基本实现了快速、灵敏、准确地诊断结核的目的，并且该方法正趋于常规化地应用于临床一般实验室.应用PCR方法检测结核杆菌的首要条件是设计一对特异性DNA引物.该引物所引导的DNA扩增序列应是结核杆菌独有的，且是结核杆菌的保守序列，这样才能保证检测结果的特异性.PCR方法的另外几个关键因素是:①DNA提取，即对有限的结核杆菌应尽量地将其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR产物的检测方法，即将PCR产物进行快速、灵敏、安全、准确的检测.
一、结核杆菌DNA的提取
　　在该技术上，目前仍无一种统一常规化的方法.现有各方法都存在着提取DNA不足的缺点，因此，敏感性受到影响.现在主要的细菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性剂法;②蛋白变性剂加表面活性剂煮沸法;③反复冻融法;④超声波法;⑤溶菌酶加表面活性剂法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌体的溶液，然后用乙醇从抽提后的溶液中沉淀DNA.有的学者将硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有机相的界面更牢固，这样不但能减少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌体释放出的DNA，该二氧化硅用70%乙醇洗涤，而后干燥，最后用双蒸水洗脱(55℃).有报道认为该方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的学者发现未预裂解的结核杆菌直接煮沸进行PCR的效果与预先处理的相仿，提示结核杆菌不预裂解也可直接进PCR.但加入的菌数应&约1000个，否则细菌蛋白(bacterial protein)会对PCR产生抑制作用.
二、引物的设计
　　根据不同型结核杆菌的序列，目前常在下列几种序列内进行引物设计.
(一)编码结核杆菌抗原的基因序列
　　1.编码65-KDa蛋白抗原的基因序列:结核杆菌65-KDa蛋白抗原为存在于所有分枝杆菌细胞壁(cell wall)中的热休克蛋白，也是一种交叉反应蛋白.所以依据该序列设计合成的引物，PCR能扩增出所有分枝杆菌的靶DNA片段，没有属内特异性.这种PCR较适用于结核病高发区大规模筛选和流行病普查.另外，对65-KDa蛋白基因的PCR扩增产物进行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准确地检测出结核杆菌的属内归属.
　　2.编码MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白为结核杆菌复合群(MTBC，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、BCG、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌)所特有.根据该蛋白的基因序列设计的引物进行PCR，对MTBC模板DNA显示出高的特异性.
　　3.编码38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:该序列仅存在于人型和牛型结核杆菌.采用在此基因内设计合成的引物和探针进行PCR，只能扩增人型和牛型结杆菌的DNA序列，能检出少至10个结核杆菌的纯化DNA.
　　4.编码32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝杆菌的一种分泌蛋白，由它的基因序列设计的引物和探针进行PCR，可以特异地检测出分枝杆菌的DNA片段，能检测出50fg的纯化DNA，相当于10个结核杆菌.
　　5.编码MPB70抗原的基因序列:MPB70为牛型结核杆菌所特有，由该基因序列设计的引物进行PCR，对牛型结核杆菌的检测具有高度的特异性和敏感性.
(二)结核杆菌基因组重复序列
　　1.克隆DNA序列:目前所应用的DNA序列都是MTBC所特有，拷贝数在10个以上，包括亚克隆重组质粒pPH7301和克隆质粒PMTb4，分别含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根据这些基因序列设计的引物，其检出限在20个结核杆菌以下.
　　2.插入序列:结核杆菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它们仅见于MTBC.这两种插入序列在基因组中的拷贝数为1--20个，选择插入序列作为扩增的靶序列，可以得到较高的敏感性和特异性.尤其是IS6110，是目前进行临床PCR检测的首选区段.
(三)人型结核杆菌特异序列
　　mtp40是人型结核杆菌特异性DNA片段，Portillo等选择mtp40作为靶序列，用PCR检测结核杆菌，结果只能扩增人型结核杆菌DNA，敏感性达到10fg纯化DNA量.
(四)分枝杆菌dnaJ基因
　　该基因为分枝杆菌共有，但种间又存在差别，在该基因序列内设计合成的引物和探针用于PCR检测，能检出50fg的纯化分枝杆菌DNA，相当于10个结核杆菌.并可用于区分结核杆菌和非典型结核杆菌的鉴别诊断.
(五)rRNA序列
　　用“通用”引物在逆转录酶作用下，将16SRNA逆转录合成cDNA，然后对cDNA进行PCR扩增，检出限达0.1fg化的结核杆菌rRNA.临床标本中少至10个结核杆菌亦可被检出，该方法由于加了一步反转录过程相对增加了难度，临床一般少用.
三、PCR产物的检测方法
　　通常PCR产物的检测方法是经琼脂糖电泳后，用溴化乙锭染色，然后在紫外灯下观察或进一步采用标记的DNA探针杂交.为了进一步提高检测的灵敏度，现多在引物和探针的标记上进行改进.由于放射性标记物的危害性，现多采用非放射性标记，如生物素、荧光素、酶及化学发光剂.Wilson等在巢式PCR的内侧引物上分别掺入生物素和地高辛配基，这样PCR产物两端就分别带有生物素和地高辛配基.PCR产物上的生物素和附着在微型滴定板表面的生物素蛋白结合，使PCR产物附着在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基碱性磷酸脂酶结合形成抗地高辛配基碱性磷酸脂酶偶合物，利用该偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)测定.另外，还可用吖啶酯标记探针进行杂交，用硼酸钠将未杂交的探针分解，然后加入H2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最后测量吖啶的光通量.虽然这些方法安全、快速、但其敏感性还需进一步提高，操作还需进一步简化.
四、PCR检测结核杆菌的敏感性和特异性
(一)PCR的特异性
　　PCR特异性的关键首先取决于所选靶序列的特异性.现在常用的靶序列有:①分枝杆菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型结核杆菌特异的靶序列，如mpt40序列.引物设计对PCR的特异性也至关重要.引物序列在靶DNA上的专一性、以及引物的特异性和保守性，以及引物本身的许多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特异性和保守性及引物长度等都影响PCR的特异性，另外在设计引物时也要防止出现引物间的过多配对，以免形成过多的引物聚合体，造成非特异性扩增.
　　PCR扩增TB的特异性除上述先决条件外，也与PCR反应本身有极重要的关系.其中退火温度是一个重要因素，退火温度过低时，引物易发生非特异性结合，造成非特异性扩增.由于结核杆DNA中G+C含量高，因此可以适当提高退火温度，以获得更高的特异性.
　　另外，PCR缓冲液的组成，尤其是Mg2+浓度对PCR的特异性也有较大影响，Mg2+浓度过高，会提高PCR产物的产量，但同时也会增加非特异性扩增.
(二)PCR的敏感性
　　PCR的敏感性很高，一般可以检测出1～100fg纯化的结核杆菌DNA，相当于1～20个结核杆菌，这种敏感性明显高于涂片法和培养法.PCR还可以检出培养法易发生失败的病例，从而大大提高菌阴结核病的诊断.另外PCR检测TBDNA不受抗痨治疗的影响，可以准确观察抗痨治疗的效果，防止血清学方法所带来的假阴性结果.PCR敏感性受下列因素影响:①扩增靶序列的拷贝数.一般认为，结核杆菌染色体中含靶序列拷贝数越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在结核杆菌染色体中只有一个，而IS6110序列的拷贝数却有10～12个，结果PCR敏感性后者比前者高100倍;②PCR的循环次数.在一定程度上，PCR循环次数越多，其敏感性就越高，但要合适.因为，循环次数过多会增加非特异性问题，造成结果判断上的失误，产生假阳性结果;③结核杆菌DNA的提取技术.处理标本时首先要富集(如离心)标本中的TB，使单位体积内TB含量变高，从而增加了起始模板数，有利于提高PCR的灵敏性.同时提取过程要尽可能减少抑制成份，并提高DNA的提取率.④PCR产物的检测方法.虽然DNA探针杂交要比直接电泳法敏感性高得多，但步骤繁琐，这也是影响PCR临床应用的原因之一.但一般情况下，直接电泳法的敏感性完全能够达到检测的需要.
五.PCR在结核病临床诊断中的应用
　　PCR检测结核杆菌的优点决定了它在临床上的应用价值和范围，PCR检测TB的优点主要表现如下:
　　1.能早期诊断(early diagnosis)TB菌血症:在TB感染的早期，特别是在TB病灶通过血源性外传播时、及在外周血中存在极少量的TB时，PCR就能给于扩增并确诊.此外，由于外周血中TB的含量甚微，又没有新的病灶形成，因而血清学方法和物理方法均难以达到确诊的目的，而对这类病灶的早期诊断(early diagnosis)在临床治疗上具有指导意义，因为早期菌血症是较易控制的，并可以防止继发性TB病灶的形成.
　　2.时间短;PCR检测TB仅需2-4h对于某些培养法难以实施的病例，PCR法则行之有效，同时提高了敏感性和特异性，可以检测到1个TB菌.
　　3.有利于鉴别诊断:对于肺结核来说，其中的结核球和成人型原发性结核等，经常易于同肺癌的诊断相混淆.病灶中心部位经常出现既未见TB又未见癌细胞的坏死区.此时涂片检测常是阴性的.在这种情况下，PCR检测就显得特别有效.它不但可以扩增能着色的活菌，还可以扩增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，从而确定这样的病灶是恶性还是良性.在许多情况下，TB可以导致脑膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.涂片法尽管在诊断上具有直接、简便的优点，但敏感性差就局限了它的诊断范围和实用价值.PCR检测这类标本，可以说极其有效.其极高的特异性和敏感性可以很容易地确定TB性脑膜炎及TB性胸腹水.另外，对于肾结核、泌尿生殖系统结核的诊断，PCR都可以予以完成.
　　4.抗痨治疗的评价:对于抗痨治疗效果的评价，以前的方法显得软弱无力.而PCR法则可以通过定期检测，采用定量PCR法确切地评价抗痨药物的疗效及残存菌的数量和活性度.在体内一般情况下，细菌死后，其蛋白系统很快崩溃，而DNA则能相对较长时间地保存下来.这些DNA在某种情况下又会复活.所以，细胞的死亡最可靠的评价指标是其基因DNA的完全降解.特别是在许多问题未搞清楚以前，更应该以DNA的降解来判定病原体的死与活.从理论上讲，PCR扩增结果将是最可靠的疗效评价指标.
　　5.修正以往所谓“正确”的观念:致病菌与机体的防御系统是一对激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打击人体的防御系统，以便其生存和繁殖.在健康人群和周围环境中都携带或存在有大量的TB，但何时何地才会造成机体致病呢?以往认为TB很少存在于外周血，这主要是因为外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺组织中.但很难让人相信的是，肺部血管极其丰富，淋巴组织和血管网共同构成人体的细胞外液贮存和交换的场所.所以，二者之间的交换是经常的.这种交换就包括能透过毛细血管壁的致病菌.当然，对于TB来讲，大多数细菌将被机体的免疫器官禁固起来.但仍有不少“漏网之鱼”，只是以前所用的方法敏感性及特异性均不够.但在某些情况下，如情绪低落、过度劳累、感冒等情况下，机体防御系统功能减弱，就会造成致病菌的攻击发生疾病.所以PCR技术对于评估临床疗效、疫情的检控、发病机理的探讨均有十分重要的意义.
六、PCR在检测TB中的注意事项
　　PCR如操作不严格会出现假阳性和假阴性结果.
　　发生假阳性最常见的原因是:样品间的污染和扩增产物的污染.样品间的交叉污染最易发生在样品的处理过程之中.如大家共用一个加样器、剪刀、位置等，因此在处理活检标本时，用剪刀剪碎组织块，每个标本用后，剪刀应在火上烧数分钟，以彻底清除污染在剪刀上的DNA.对于液态标本的处理，尽可能在同一管子内处理.用具应为一次性的.要解决好扩增物的污染，最佳的方式是减少操作的时间，简化操作手续并使用一次性离心管及接头.因为扩增产物的量一般很高，易于污染实验室任何地方.所以减少打开反应管的次数会降低假阳性的发生率.
文章关键字:引物,基因序列,分枝杆菌,探针
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【题　名】乳品中肠球菌LAMP快速检测方法的建立及应用
【作　者】姜侃 张东雷 金燕飞 陈小珍
【机　构】浙江省质量技术监督检测研究院 杭州310013
【刊　名】《中国乳品工业》2011年 第5期 50-53页　共5页
【关键词】肠球菌 LAMP 快速检测 乳品
【文　摘】应用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）,针对肠球菌16sRNA中高度保守的序列分析设计特异性引物,建立乳品中肠球菌特异性快速检测方法。结果表明,所设计的引物具有良好特异性,10株肠球菌均能扩增出特异性片段,而14株非肠球菌均未扩增出相应片段,无假阴性或假阳性情况出现。同时,该方法可在14 h内完成检测,且阳性LAMP反应所需目标菌DNA浓度仅为10 fg/μL。应用本方法对164份婴幼儿配方乳粉的检测结果显示,共在37个批次中检出肠球菌,检出率为22.6%,污染量在0.36~110 g-1（最近似值）间。该方法为肠球菌的快速检测提供了一种重要的技术手段。
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7株布氏杆菌临床分离株16SRNA基因PCR扩增及序列分析
【摘要】：正目的利用PCR技术扩增7例布氏杆菌临床分离株16SRNA基因片段,并对该基因进行序列分析,为该菌的分子诊断学、遗传学和流行病学研究提供实验依据。方法针对布氏杆菌16S RNA保守区设计引物,并利用PCR技术扩增目的片段,进行RFLP分析和测序。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R450【正文快照】：
目的利用PCR技术扩增7例布氏杆菌临床分离株165RNA基因片段，并对该基因进行序列分析，为该菌的分子诊断学、遗传学和流行病学研究提供实验依据。方法针对布氏杆菌165 RNA保守区设计引物，并利用PCR技术扩增目的片段，进行RFLP分析和测序。结果PCR扩增出目的片段，RFLP可将菌
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京公网安备75号使用两组同源引物的pcr方法及其反应液和应用的制作方法
专利名称使用两组同源引物的pcr方法及其反应液和应用的制作方法
技术领域本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及一种聚合酶链式反应的方法及其反应液和在制备医学微生物核酸检测试剂中应用。
背景技术经典聚合酶链式反应方法发明于八十年代中期，它采用正、反引物各一个来扩增特定的基因。十几年来已发展了若干同时使用二对或更多引物的PCR方法，其中，主要有多重引物PCR和简并引物PCR。
多重PCR是在一个反应管内同时扩增二个或二个以上的目标基因，多重PCR的每一对引物顺序与相应的目标基因匹配，引物彼此之间不存在同源性。多重PCR也已用于扩增同一基因的不同区域，但引物对之间需相隔较远，否则相互干扰，这种情况下引物间相互也无同源性。
简并引物PCR方法是根据一段多肽的氨基酸顺序而非核酸顺序来设计引物的，由于氨基酸密码子的高度简并性，对应5-6个氨基酸多肽的核苷酸顺序通常有32，64，128种或更多的可能性，所以，一套简并引物往往包括几十种引物，通常是在寡核苷酸合成过程中制备的，每一个引物的长度相同。简并引物PCR方法也用来扩增病毒核酸或其他基因的高度变异区，其引物同样具有上述特征。
本发明的正反两组同源引物PCR方法也使用二对以上的引物，但是在原理、引物特性和用途上均与多重PCR和简并引物PCR大不相同。本发明的两组同原引物是根据目标基因各种变种的顺序而设计的，每组引物的数量有限，相互之间高度同源，长度可相同或有差异，其目的是能使PCR在严谨的条件下扩增各种变种，从而减少或消除PCR扩增的假阴性。
PCR已广泛用于人体内微生物的检测包括感染性疾病的临床诊断，其原理是病毒，细菌或其他微生物的基因顺序与人体不同，根据目标微生物的某种基因顺序可以设计高度专一的引物，如果人感染该微生物，则从人体某些部位如血液中提取DNA或RNA，通过PCR方法能扩增得到该微生物特定的基因片段，反之则否。但是，临床诊断实践表明现行的PCR方法往往存在较严重的假阳性和假阴性问题。假阳性是由于样品中存在干扰物质或操作过程中极微量模板的污染所造成的。针对假阳性原因可分别通过改进引物设计，提高PCR反应严谨性，增加产物检测手段如核酸杂交，和创造良好的检测环境，加强检测人员训练，规范操作程序，采取各种技术措施如加入UDG的方法或封闭式的实时荧光定量方法来加以克服。
相对而言，PCR诊断的假阴性问题更为严重，既未被充分认知，又未找到有效的克服办法。以在我国感染率极高的乙型肝炎病毒(HBV)为例，大量的关于HBV的PCR诊断和免疫诊断诊比较研究表明，乙型肝炎病毒表面抗原阳性的，即用免疫方法确认感染HBV并处活动期的病人中，均有一部分未能用PCR方法检出，有时假阴性高达50％。假阴性的造成除了由于PCR反应的不稳定性，样品DNA或RNA提取过程失当等技术方面原因外，主要是由于HBV病毒的核酸顺序的多变性。至今，已提交基因库的各种HBV变种分离株和克隆的全基因或部分基因顺序已超过一千种，相互之间几乎都各不相同。所以，尽管每一位研究者都认识到并强调在HBV基因组的保守区来寻找选择引物，实际上却很难找到一对引物既具有作为优秀引物的的严谨性，同时又能与所有变种的顺序匹配。对文献报导的若干HBV引物的分析表明，几乎每对引物的顺序都与相当数量的变种的顺序存在严重的错配。在严谨的PCR反应条件下或样品中病毒浓度较低的情况下，核酸顺序与引物顺序有严重错配的变种就得不到扩增产物。为了减少假阴性可以降低PCR反应的严谨性例如降低退火温度，使引物与变种模板能在有较严重错配的情况下退火，但是低温退火必然增加非专一产物的形成。另一种方法是在引物中采用脱氧次黄嘌呤核苷酸(dITP)或其他互补专一性差的特殊核苷酸来替代A，C，T或G。但这种方法有若干缺点。1dITP或其他特殊核苷酸都是非天然核苷酸。2dITP虽能与四种核苷酸互补，但不及A与T之间或G与C之间的互补强，如果引物内需要用二个或多个dITP来取代的话，引物与模板的结合强度就更低。3当含dITP的引物掺入扩增链后，含dITP的链又成为下一轮扩增的模板，A，T，C和G都有可能掺入，最后PCR产物就分子的顺序而言将是复杂的异源性混合物。
发明所要解决的技术问题本发明所需要解决的技术问题是提供一种使用两组同源引物的聚合酶链式反应方法及其反应液和在制备医学微生物核酸检测试剂中的应用，以突破现有技术中设计于同源基因的正反引物仅一对的常规，克服同源基因检测中不能同时避免假阴性或非转一性产物的缺陷。
技术方案本发明则采用两组数量有限，长度完全相同或略有差别，顺序高度同源的引物，在严谨的条件下进行PCR，以克服用临床诊断的假阴性问题。
所用的正、反引物为同源的分别针对已知目标基因同一区段设计的2组引物，每组包括1-3条引物。也就是说，使用一组正引物和一个反引物，或者使用一组反引物和一个正引物，或者同时使用一组正引物和一组反引物进行PCR反应，根据测定需要和目标基因的变化程度而决定。
一组正引物或一组反引物的各个引物不仅有相同的目标基因，而且位于基因的同一部位，引物间彼此高度同源。
同源引物PCR方法中的引物顺序是根据目标基因的各种变种的顺序来选择设计的，每一个引物均与一个或若干变种的顺序完全匹配或高度匹配，各条引物与模板的错配碱基数为0-3。使用两组同源引物能与所有变种或比使用一个引物时与更多的变种的顺序完全匹配或高度匹配，从而减少或消除因引物顺序与模板顺序存在严重错配而导致的假阴性。
两组同源引物内引物间长度完全相同或有1-10核苷酸的差异；相应地引物在基因中的位置也完全相同或有1-10核苷酸参差，也可以说，每组同源引物的各引物在目标基因中的5’起始位置相差0-10核苷酸。由此，应用同源引物方法的PCR扩增产物的长度完全相同或有若干个碱基的差别。因为PCR产物的长度通常大于200碱基，所以，即使PCR产物长度有若干碱基差别，也显示出相同的电泳条带。
当样品中只存在某一种变种时，其中一个引物与模板的匹配是显著高于其他引物，在严谨的PCR条件下，该引物与模板退火，在扩增中起全部或主要的作用。
设计同源引物时，除了考虑引物顺序与目标基因各变种顺序匹配，每一个引物自身应有良好的严谨性，同时要使正同源引物之间，反同源引物之间和正、反同源引物之间均只有较低的3’端互补碱基数。从而使同源引物PCR的有效引物的作用不受其他引物的干扰。
本发明的同源引物聚合酶链式反应的反应液，其组成包括2组正反引物、四种脱氧核糖核酸、镁离子、缓冲液、耐热DNA聚合酶和目标DNA，正反引物组在反应液中的浓度范围上限比标准PCR高，单组同源引物的浓度之和为0.1-2μM。
所说的同源引物聚合酶链式反应方法在制备医学微生物核酸检测试剂中有其独特的应用，比如将正、反引物组分别设计于同种病毒的不同基因型、血清型或其亚型的基因同源区段，如乙型肝炎病毒不同血清型；或设计于同属细菌的不同种、亚种、变种或其变异株的基因同源区段，如嗜酸乳杆菌的16S RNA基因。
有益效果现有技术检测等位基因的PCR，或者是检测等位基因点突变的PCR，如果在同一管反应，往往一个引物有等位突变，同时共享另一引物，必须在引物合成时在二对或多对引物上标上不同颜色的荧光基团加以区别，否则无法区分是由于等位突变还是由于没有目标基因造成的阴性结果。
本发明针对等位突变设计同源引物组，可以不对上述情况加以区别，只要存在目标基因，即可获得可靠的阳性结果，消除了因为等位突变造成的假阴性。
现有PCR技术测定某一种、属的或其他特定范围内的微生物是一种对于多种困难因素的平衡和选择1〕需要选择高严谨性引物，则对引物的位置有较大的限制；2〕如果在基因顺序变化相对保守的区域内选择引物，由于不同种、不同属的微生物基因之间存在广泛的的同源性，PCR引物除了与所有目标微生物的基因顺序匹配，但往往也可能与一些非目标微生物的基因匹配，使PCR检测的专一性受到干扰可能产生假阳性结果；3〕如果在基因顺序变化相对活跃的区域选择引物，则PCR引物可能仅与一部分目标微生物的基因的顺序完全匹配或高度匹配，而与另一部分目标微生物的基因顺序不匹配，在严谨的PCR反应条件下，这部分微生物的基因就不被扩增而造成假阴性，如果降低PCR反应的严谨性，则会使非目标微生物的干扰大大增强。
同源引物组PCR则提供了一种新的、简单的方法，使引物的选择范围极大的扩展，可以在基因顺序变化相对保守的区域内，也可以在基因顺序变化相对活跃的区域选择引物。同时扩大了目标微生物的检测范围，在理想状态下，可以检测整个种乃至整个属的微生物，而避免漏检某些变异株。
同源引物PCR也可以进一步设计为定量检测。
具体实施例方式
实施例1以已知的HBV变种的顺序为例，用两组同源引物方法来克服假阴性。
所设计的正引物组和反引物组均包括三个引物，表1以HBV核酸顺序(E00010，见核苷酸序列表)为准，列述了每一个引物的长度，位置和其他基本特性。
表2列述了每个引物的顺序，字体加深的碱基表示一组同源引物内相互间不完全相同的碱基。
表1.六个乙肝病毒引物的名称和基本特性
表2.六个乙肝病毒引物的顺序
表1和表2数据表明，正引物组的引物长度差最大为4个碱基，反引物组三个引物的长度完全相同。每一组引物内引物间顺序的同源性均超过90％。
表3分析了正、反引物组与HBV核酸顺序的匹配情况。由表3可知正引物HBV15’与HBV病毒E00010的顺序完全匹配，近似解链温度和专一结合强度分别高达90.4℃和574点；反引物HBV13’与HBV病毒E00010的顺序有1个碱基错配，但近似解链温度和专一结合强度仍分别高达86.9C和627点。应用以上引物组在高退火温度下至少其中的一对引物能胜任扩增。
表3.六个引物的近似解链温度和与E00010HBV的专一结合强度
根据HBV全序列的同源性和其他特性可分成7种基因型，每一种包括一种或几种血清型及其亚型。表4列述了引物与7种基因型的代表性病毒株核酸顺序的匹配情况。表4说明3个正引物与7个基因型顺序完全匹配或有一个碱基错配；而3个反引物与7个基因型顺序完全匹配或有0-2个碱基错配，但所有引物与7个基因型的模板专一结合强度都超过515点。所以用本发明引物组能在高温下扩增7个基因型的每一个代表病毒株。
表4.六个引物与各种基因型HBV代表性病毒株顺序的的匹配情况
截止2002年上半年基因库收录约220个由中国发表或与中国直接有关的HBV核酸的全顺序或部分顺序，以从为分析样本测试上述引物组的同源性特征。其中，与正引物1或3完全匹配的病毒株分别有104和101株，所以至少有205个病毒株顺序与三个正引物中的一个完全匹配。在全部220株中有三株的核酸顺序与正引物1和正引物2在3’端有严重错配，但与正引物3匹配很好。其余十来个变株的顺序与正引物仅在引物的靠近5’一侧有1-3个错配，其近似解链温度和与模板专一结合的强度分别在80℃和500点以上。
所以，本发明的正引物组能与220个变株中的每一个病毒株在高温下退火。在基因库收录的220个HBV基因顺序中多数是部分顺序而不是全顺序，在基因库中列出反引物区域顺序的约有90个，其中，与反引物1或3完全匹配的病毒株分别有61株和15株，所以至少有76个病毒株与三个反引物中的一个完全匹配。其余十来个变株的顺序与正引物仅在引物的靠近5’一侧有1-2个错配，其近似解链温度和与模板专一结合的强度也分别在80℃和500点以上，所以，本发明的反引物组能与90个变株中的每一个病毒株在高温下退火。
当前，基因库收录的人HBV核酸顺序1000个以上，从全顺序看所包括的变异比上述的220株更多，但就本发明的引物顺序区域看，上述220种变株几乎包括了所有的变异种类。所以，本发明引物组能扩增目前已知的几乎每一个HBV变种。
标准PCR只使用一对引物，设计引物时只需要考虑引物自身的互补和二个引物间的互补。本发明共有六个引物，除了考虑六个引物的自身互补还要顾及6个引物间15种可能的互补。表5列述了全部21种引物3’端碱基的互补情况。
表5.六个乙肝病毒引物自身和相互间最稳定3’二聚物形成特性
表5数据表明，六个引物自身和相互间都没有严重的3’端互补，在高退火温度下不易形成引物二聚体。
用两组同源引物的PCR方法对110份HBV血清样品进行检测试验，阴性对照为5份正常人血清(预先经ELISA检测HBsAg、HBsAb、HBcAb、HBeAg和HBeAb均为阴性)。PCR反应采用Clontech公司Advantage-2试剂盒。每份样品取200μL血清加入等体积的裂解液(配方为Tris.HCl，8％，Tween20，2％)，混匀，95℃水浴裂解15min。取出，12000rpm离心15min，取上清液进行PCR反应。反应母液Taq酶1μL，dNTP1μL，10Xbuffer，5μL，表2的2组六条引物各2uL使浓度为0.5μM，dd水3μL。每管加2μL反应母液，3μL血清裂解液。反应条件先95℃变性2min，然后以95℃ 30sec-72℃ 30sec-72℃ 30sec进行30个循环，最后72℃延伸2min。电泳检测结果显示所有HBV血清均获得PCR阳性结果，无一例阴性，阴性对照无阳性扩增产物。
实施例3实施例3是设计用两组同源引物PCR方法来测定人阴道的总乳酸杆菌。阴道微生态是一个含有很多微生物种群的复杂体系。其中，乳酸杆菌活动造成的微pH环境和H2O2对疾病包括艾滋病的防治有重要作用。乳酸杆菌共有几十个种，在人阴道中已发现的常驻乳酸杆菌有嗜酸乳杆菌(L.acidophillus)等十余种(见表9)，目前常用编码16sRNA的基因来鉴别微生物种，基因库已收录的顺序不下几万种。16sRNA基因含约1500个碱基(见核苷酸序列表)，无论是在基因的哪一区域都找不到一个引物，能与表9所列十几种菌种的16sRNA基因顺序完全匹配或高度匹配，又与阴道中存在的其他微生物的16sRNA基因顺序完全不匹配或有严重错配，所以无法用标准PCR方法来测定阴道的总乳酸杆菌。本发明设计的两组同源引物能扩增所有这十几种乳酸杆菌而不受阴道中所有非乳酸杆菌的干扰，引物的顺序，与模板和非模板顺序的结合强度及错配等特性列于表6-11。
表6.六个乳酸杆菌引物名称和基本特性
表7.六个乳酸杆菌引物的顺序
表8.六个乳酸杆菌引物对不同模板的专一结合强度
表9.六个引物与阴道主要乳酸杆菌16s rDNA基因模板的匹配情况
表10.乳酸杆菌引物与人阴道主要干扰菌群16s rDNA模板的错配情况
表11.六个乳酸杆菌引物相互间最稳定3’二聚物形成特性
用两组同源引物的PCR方法对嗜酸乳杆菌(L.acidophillus)、阴道乳杆菌(L.vaginalis)、格氏乳杆菌(L.gasseri)、乳酸乳杆菌(L.lactis)、卷曲乳杆菌(L.crispatus)、罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)、德氏乳杆菌(L.delbruekii)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、发酵乳杆菌(L.fermentum)、短乳杆菌(L.brevis)、布乳杆菌氏乳杆菌(L.buchneri)、植物乳杆菌(L.plantarum)、唾液乳杆菌(L.salivarius)和干酪乳杆菌(L.casei)菌种样品进行检测试验，阴性对照为双歧杆菌(bifidobacterium)、肠球菌(Entercoccus)、链球菌(Streptococcus)和葡萄球菌(Staphylococcus)的代表菌。PCR反应采用Clontech公司的Advantage-2试剂盒。每份样品取3μL的细菌裂解液直接进行PCR反应。反应母液除用表7的2组六条引物各2μL使浓度为0.6μM外同实施例2。每管加2μL反应母液。反应条件先95℃变性2min，然后以95℃ 30sec-72℃ 30sec-72℃ 30sec进行25个循环，最后72℃延伸2min。电泳检测结果显示所有乳酸杆菌菌种均获得PCR阳性结果，无一例阴性，阴性对照菌种无阳性扩增产物。核苷酸序列乙型肝炎病毒HBV(E00010)1 gaattccact gccttccacc aaactctgca ggatcccaga gtcaggggtc tgtatcttcc61 tgctggtggc tccagttcag gaacagtaaa ccctgctccg aatattgcct ctcacatctc121 gtcaatctcc gcgaggactg gggaccctgt gacgaacatg gagaacatca catcaggatt
181 cctaggaccc ctgctcgtgt tacaggcggg gtttttcttg ttgacaagaa tcctcacaat241 accgcagagt ctagactcgt ggtggacttc tctcaatttt ctagggggat ctcccgtgtg301 tcttggccaa aattcgcagt ccccaacctc caatcactca ccaacctcct gtcctccaat361 ttgtcctggt tatcgctgga tgtgtctgcg gcgttttatc atattcctct tcatcctgct421 gctatgcctc atcttcttat tggttcttct ggattatcaa ggtatgttgc ccgtttgtcc481 tctaattcca ggatcaacaa caaccagtac gggaccatgc aaaacctgca cgactcctgc541 tcaaggcaac tctatgtttc cctcatgttg ctgtacaaaa cctacggatg gaaattgcac601 ctgtattccc atcccatcgt cctgggcttt cgcaaaatac ctatgggagt gggcctcagt661 ccgtttctct tggctcagtt tactagtgcc atttgttcag tggttcgtag ggctttcccc721 cactgtttgg ctttcagcta tatggatgat gtggtattgg gggccaagtc tgtacagcat781 cgtgagtccc tttataccgc tgttaccaat tttcttttgt ctctgggtat acatttaaac841 cctaacaaaa caaaaagatg gggttattcc ctaaacttca tgggctacat aattggaagt901 tggggaactt tgccacagga tcatattgta caaaagatca aacactgttt tagaaaactt961 cctgttaaca ggcctattga ttggaaagta tgtcaaagaa ttgtgggtct tttgggcttt1021 gctgctccat ttacacaatg tggatatcct gccttaatgc ctttgtatgc atgtatacaa1081 gctaaacagg ctttcacttt ctcgccaact tacaaggcct ttctaagtaa acagtacatg1141 aacctttacc ccgttgctcg gcaacggcct ggtctgtgcc aagtgtttgc tgacgcaacc1201 cccactggct ggggcttggc cataggccat cagcgcatgc gtggaacctt tgtggctcct1261 ctgccgatcc atactgcgga actcctagcc gcttgttttg ctcgcagccg gtctggagca1321 aagctcatcg gaactgacaa ttctgtcgtc ctctcgcgga aatatacatc gtttccatgg1381 ctgctaggct gtactgccaa ctggatcctt cgccggacgt cctttgttta cgtcccgtcg1501 cgtctgccgt tccagccgac cacggggcgc acctctcttt acgcggtctc cccgtctgtg1561 ccttctcatc tgccggtccg tgtgcacttc gcttcacctc tgcacgttgc atggagacca1621 ccgtgaacgc ccatcagatc ctgcccaagg tcttacataa gaggactctt ggactcccag1681 caatgtcaac gaccgacctt gaggcctact tcaaagactg tgtgtttaag gactgggagg1741 agctggggga ggagattagg ttaaaggtct ttgtattagg aggctgtagg cacaaattgg1801 tctgcgcacc agcaccatgc aactttttca cctctgccta atcatctctt gtacatgtcc1861 cactgttcaa gcctccaagc tgtgccttgg gtggctttgg ggcatggaca ttgaccctta1921 taaagaattt ggagctactg tggagttact ctcgtttttg ccttctgact tctttccttc1981 cgtcagagat ctcctagaca ccgcctcagc tctgtatcga gaagccttag agtctcctga2041 gcattgctca cctcaccata ctgcactcag gcaagccatt ctctgctggg gggaattgat2101 gactctagct acctgggtgg gtaataattt ggaagatcca gcatctaggg atcttgtagt2161 aaattatgtt aatactaacg tgggtttaaa gatcaggcaa ctattgtggt ttcatatatc2221 ttgccttact tttggaagag agactgtact tgaatatttg gtctctttcg gagtgtggat2281 tcgcactcct ccagcctata gaccaccaaa tgcccctatc ttatcaacac ttccggaaac2341 tactgttgtt agacgacggg accgaggcag gtcccctaga agaagaactc cctcgcctcg2401 cagacgcaga tctccatcgc cgcgtcgcag aagatctcaa tctcgggaat ctcaatgtta2461 gtattccttg gactcataag gtgggaaact ttacggggct ttattcctct acagtaccta2521 tctttaatcc tgaatggcaa actccttcct ttcctaagat tcatttacaa gaggacatta2581 ttaataggtg tcaacaattt gtgggccctc tcactgtaaa tgaaaagaga agattgaaat
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1441 gagtctgcaa tgcccaaagc cggtggccta accttcggga aggagccgtc taaggcaggg1501 cagatgacnn nnnnnnnnnn gtaacaagnn nnnnnnnnnn gaacctgnnn nnngatcacc1561 tcctttcta
1.一种同源引物的聚合酶链式反应方法，依次包括如下步骤(1)模板变性；(2)引物退火；(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；其特征在于，正、反引物为同源的分别针对已知目标基因同一区段设计的2组引物，每组包括1-3条引物。
2.根据权利要求1所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于各条引物与模板的错配碱基数为0-3。
3.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于每组同源引物的各引物间长度差异为0-10核苷酸。
4.根据权利要求1或2所述的聚合酶链式反应方法，其特征在于每组同源引物的各引物在目标基因中的5’起始位置相差0-10核苷酸。
5.一种权利要求1所述的同源引物聚合酶链式反应的反应液，组成包括2组正反引物、四种脱氧核糖核酸、镁离子、缓冲液、耐热DNA聚合酶和目标DNA，其特征在于每组同源引物的浓度之和为0.1-2μM。
6.权利要求1所述的同源引物聚合酶链式反应方法在制备医学微生物核酸检测试剂中的应用，其特征在于正、反引物组分别设计于同源基因的同一区段。
7.根据权利要求6所述的聚合酶链式反应方法的应用，其特征在于正、反引物组分别设计于同种病毒的不同基因型、血清型或其亚型的基因同源区段。
8.根据权利要求6或7所述的聚合酶链式反应方法的应用，其特征在于正、反引物组分别设计在相当于乙型肝炎病毒E00010株的第387-433Nt和第709-748Nt区段。
9.根据权利要求6所述的聚合酶链式反应方法的应用，其特征在于正、反引物组分别设计于同属细菌的不同种、亚种、变种或其变异株的基因同源区段。
10.根据权利要求6或9所述的聚合酶链式反应方法的应用，其特征在于正、反引物组分别设计在相当于嗜酸乳杆菌的16SRNA的第291-327Nt和第784-820Nt区段。
本发明属分子生物学技术，提供一种使用两组同源引物的聚合酶链式反应方法及其反应液，即将聚合酶链式反应使用正、反引物各一条扩展为使用各一组同源的分别针对已知目标基因同一区段设计的引物组，每组包括1－3条引物，各引物与模板的错配碱基数为0－3，各引物间长度差异为0－10核苷酸，在基因中的5’起始位置相差0－10核苷酸。由于本方法根据已知的待测序列设计具有高严谨性的引物组，故可以减少或消除同源基因PCR检测的假阴性，在制备医学微生物如病毒、细菌等核酸检测试剂中具备广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/68GK16038
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者徐定邦, 朱德芬, 谢文凯, 徐文慧 申请人:徐定邦, 徐文慧