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浅谈样品溶剂对高效液相色谱行为的影响
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HPLC分析中样品溶剂如何选择
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& & 样品溶剂的选择是实验中不可忽视且很重要的部分，一方面靠经验，一方面还要考虑到所产生的溶剂效应。溶剂效应是什么？举个最简单的例子，很多时候，此效应可以导致峰形变差。而样品溶液的组成与进样体积都对会导致溶剂效应。如何避免产生的样品溶剂效应？在HPLC分析中样品溶剂的选择和流动相是怎样的联系？GCMS、紫外检测都分别有哪些溶剂选择经验？本文告诉你!& & 样品溶剂的选择要求，先粗略的概括一下：1、能够溶解待测物质；2、不影响待测物质检测；3、能够在一定时间范围内保持待测物质稳定。& & 什么是溶剂效应？& & 样品溶液的溶剂强度强于流动相溶剂强度时可能会造成的峰展宽、峰分叉现象。即色谱图上较早洗脱的峰前沿或者开叉，与此同时较晚洗脱的峰则较为正常的现象。这些现象可能是由以下原因引起的——样品溶液的溶剂很可能强于流动相。& & 可能发生溶剂效应的情况：& & 出峰时间早；& & 保留弱；& & 进样量大。A.样品溶液的溶剂：100% 乙腈B.样品溶液的容积：流动相& & 上图中，色谱图上较早洗脱的峰扭曲变形或者开叉，与此同时较晚洗脱的峰则较为尖锐与对称，这些现象显示一个比较特殊的起因――样品溶液的溶剂很可能强于流动相。此种强溶剂效应的例子在左图中可见。此处的样 品溶液的溶剂是100%乙腈(100%的强溶剂)，而流动相的组成则较弱，18%的乙腈与72%的水。第一个峰是开叉的，并且与第二个峰相比，明显地变宽 了。当样品溶液的溶剂变成流动相时，所有的峰形都改善了，且变得尖锐。见右图。& & 为什么呢？这是因为当样品进样时，有可能出现峰展宽，最佳的样品溶液组成和体积将会保持在10%甚至更低，在这个例子里，当样品溶剂与流动相溶剂强度不同时，换句话来说，也就是样品未用流动相溶解，因此，有些样品分子溶解在强溶剂中，并随强溶剂流过柱子，而有些则溶解在流动相中，从而导致峰分叉。& & 当样品与流动相强度相差较小，进样影响也会小，第一个峰可能会宽于第二个峰，而当这种展宽导致必要的分离度降低时，这样情况应引起注意，在左图中，使用一根短柱，和5μL进样，这与最佳进样体积4μL相近，用了极性更强的溶剂导致分离度明显的降低，从2.1降到1.5(如右图，分离度为2或更大是评估一个完善方法的一个必要参数，也是每个方法的验证参数，1.5只是一个基本的分离度，任何一个方法或一根柱子都必需满足这个条件，当进样为一倍时，也就是10μL时，分离度更一步降低，此方法就不行了。& & 液相色谱系统的很多问题都能在谱图上反映出来，其中一些问题可以通过改变设备参数得到解决，而其它的问题必须通过修改操作程序来解决。& & 样品溶剂选择不当的解决方法：&谱图问题&与流动相或溶剂有关的原因&解决办法&峰拖尾&流动相pH选择错误&调整pH值。(对于碱性化合物，低pH值更有利于&得到对称峰)&峰前延&样品溶剂选择不恰当&使用合适的溶剂&峰分叉&样品溶剂不溶于流动相&改变样品溶剂&鬼峰&流动相问题&a.检查流动相是否纯净&b.使用流动相作为样品溶剂&c.减少进样体积&保留时间波动/不断变化&流动相组分变化选择不恰当&防止变化(蒸发、反应等)/&a.更换合适的流动相&b.选择合适的混合流动相&基线漂移&流动相污染、变质或由低品质溶剂配成/&不均匀/配比不当或流速变化&检查流动相的组成,使用高品质的化学试剂及HPLC&级的溶剂/使用HPLC 级的溶剂，高纯度的盐和&添加剂,流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦&气/更改配比或流速,定期检查流动相组成及流速&基线噪音(规则的)&流动相混合不完全&用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂&基线噪音(不规则的)&流动相污染、变质或由低质溶剂配成/流动相 &各溶剂不相溶&检查流动相的组成/选择互溶的流动相&宽峰&流动相组成变化&重新制备新的流动相&分离度降低&流动相污染或变质(引起保留时间变化)&重新配置流动相& & HPLC溶剂的要求& & (1) 高纯度，溶剂与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性。由于高效液相灵敏度高，对流动相溶剂的纯度要求也高。不纯的溶剂会引起基线不稳，或产生“伪峰”。& & (2) 溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性，即足够的溶解能力。溶剂的极性要与待测样品相匹配，如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响纯化分离，且会使柱子恶化。& & (3) 溶剂要与检测器匹配& & 对于UV-Vis，所用流动相在检测波长下应没有吸收或UV 吸收很小。& & (4) 化学稳定性好& & 不能选与样品发生反应或聚合的溶剂。& & (5) 低粘度，沸点适中& & 减小溶质的传质阻力，降低柱压，利于提高柱效。& & 常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙腈等；粘度过低的溶剂也不宜采用，如戊烷、乙醚等，易在色谱柱或检测器内形成气泡，影响分离。& & HPLC溶剂关键性能& & (1) UV吸收性& & HPLC级试剂是用特殊方法生产的含有最少的颗粒和最低的紫外吸收物质，除去具有吸收UV的杂质，在规定的波长上吸光度限制在规定值以内。& & (2) 梯度洗脱性能& & 在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。& & 采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度。& & ① 溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能作为梯度洗脱的流动相。& & 当有机溶剂和缓冲液混合时，可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。& & ② 纯度要求更高，以保证良好的重现性。进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。& & ③ 防止压力过大。& & 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。& & 例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。& & 反相液相色谱& & (柱效高、分离能力强、保留机理清楚，是液相色谱分离模式中使用最为广泛的一种。适用于非极性-中等极性组分)& & 固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱& & 流动相：流动相极性 & 固定相极性 极性大的甲醇-水或乙腈-水& & HPLC里面的溶剂效应是如何产生的，该如何避免？如何判断分叉的峰是否由溶剂效应造成，第一就是通过HPLC仪器比对一下两个劈叉峰的紫外吸收波谱，看看他们是否能完全一样的μV特征吸收，第二将进样体积调节到0.1μl看看，峰是否好转，如果满足上面两个条件几乎就可以肯定是100%的溶剂效应。产生原因：& & 1、样品溶液的溶剂很可能强于流动相。例如样品溶液的溶剂是100%乙腈(100%的强溶剂)，而流动相的组成则较弱，18%的乙腈与72%的水；& & 2、就是进样量比较大；& & 3、样品的pH值与HPLC流动相pH悬殊，比如酸性流动相体系，样品pH偏碱性(pH=10),这种情况下也很有可能发生 其实上面三个原因归结起来就是一个原因，那就是样品的溶剂与流动相存在一些不一样，当样品进入流动相的时候，由于这种巨大的差异，一部分样品溶解进入了流动相，一部分还留在进样的溶剂里面，所以在HPLC上出现了保留的差异，所以要解决这个问题的最佳方案就是，使用流动相的起始梯度溶解样品，如果由于溶解度的问题，不得不改用其余的溶剂，那就只能降低进样体积来解决，比如 5μl，1μL。& & GC-MS 测定PAHs，HP-5MS (Agilent) 柱，固相萃取后使用甲醇洗脱。用甲醇做溶剂，是否会影响柱效和柱寿命。是否是最佳选择？甲醇的沸点比较高，极性比较大，如果换成正己烷类的弱极性，低沸点，配合一定的色谱条件可以实现溶剂聚焦作用，显著提高保留时间较短的化合物的灵敏度和检出线。甲醇相对于正己烷等极性小的溶剂，造成的柱流失大，国外用乙腈做GC-MS溶剂的文献很多，很多用来减少前面溶剂转换步骤，结合大体积进样等，溶剂先挥发分流走掉，从而进入柱子乙腈溶剂的较少，可认为对柱子影响不大，同时甲醇乙腈对比，乙腈的柱流失要少。& & 现有个样品，其结构中只有孤立的C=O。由于样品溶于乙醇，所以第一次做紫外扫描时就以乙醇作为溶剂。结果在202nm处测得了最大吸收。检测该化合物的HPLC条件是以乙腈－水作为流动相的。我用流动相作为溶剂再对该化合物进行紫外扫描。结果在197nm处测得了最大吸收。而在200～400nm范围内仅在285nm处测得一很小的吸收峰。在做紫外扫描时，样品溶剂不同，测得的样品的最大吸收波长也会不同。如果用HPLC-UV检测该化合物，波长选为202nm(以乙醇作为溶剂测得的)，是否合适呢？在做HPLC检测时，样品的溶剂如果不是流动相之一，会不会影响检测结果呢？C=O在270～300nm有较弱的紫外吸收(ε=10～100)，285nm的峰应为C=O的吸收。乙腈-水的极性强于乙醇，由于N-π跃迁的存在，将发生蓝移(最大吸收202变为197)，在紫外区的边缘测定有关物质则干扰甚大，不合适；测定含量勉强可以，如果仅测定含量可以根据吸收情况适当增加到210nm左右。如果溶剂跟流动相一样，那紫外吸收也应该一致，否则样品就非完全同一物质。紫外测定选择最大吸收波长进行含量测定，可以提高检测灵敏度，减少其他干扰，但这是相对的。
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在HPLC中，溶解样品的溶剂不同，对峰形有影响吗？
正在用C18柱，甲醇-磷酸缓冲盐体系，用水溶解样品进样和用甲醇溶解进样得到的峰形不一致，样品在水和甲醇中都溶解，是什么原因呢？
冒昧问一句，溶剂不同会影响出峰时间吗
会的，分析柱柱体积本来就小，很容易影响的。
好的，谢谢！！
用流动相溶解样品是最靠谱的吗？
我的样品在198nm有紫外吸收峰，水和甲醇的影响是不是会很大？我查了说水和甲醇乙腈什么的溶剂极限波长是210nm
这个波长不太合适，溶剂干扰也会挺大的。选择次吸收峰试试
一般来说，用流动相溶解会对系统带来的干扰稍微小点。不过也要看物质的具体性质
我想问一下，谱图中峰都集中在2-3min，因为样品极性大，跟溶剂峰混在一起，但是用水和甲醇做流动相无论怎么调整比例，还是出峰很早，能不能用四氢呋喃或丙酮这样极性较小的流动相与甲醇或水来配伍呢，会让峰后移吗，对分离度会有所改善吗？求赐教:arm:
极性大的物质，在反相色谱里基本不保留的，你可以尝试加离子对试剂看看。丙酮太容易挥发了
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