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人皮肤成纤维细胞系的鉴定及老化检测
作者：曹晨华 纪丽曼 耿娅 刘国芳&&&&作者单位：050015 石家庄市，华北制药集团新药研究开发责任有限公司
目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞体外分离、培养及鉴定的方法。方法 以包皮组织为材料，采用胶原酶消化，分离、培养细胞，倒置显微镜观察，同时进行免疫细胞化学鉴定和β?半乳糖苷酶染色。结果 分离的成纤维细胞可在体外快速贴壁生长、增殖。波形蛋白免疫细胞化学染色95%以上为阳性。随成纤维细胞的连续传代培养β?半乳糖苷酶表达呈递增趋势。结论 该方法在体外可以获得高纯度的成纤维细胞。
【关键词】& 成纤维细胞;鉴定;细胞衰老;β?半乳糖苷酶
Identification and aging detection of human skin fibroblast cell-line CAO Chenhua,JI Liman, GENG Ya,et al. NCPC New Drug Research and Development CO.,Ltd,Shijiazhuang 050015,China
　　【Abstract】 Objective To explore the method of isolation, cultivation and identification for human skin fibroblasts in vitro. Methods Fibroblasts was dissociated and harvested by collagenase,which were isolated from the normal prepuce by circumcision. The performance of cells&growth was observed with light microscope.The cells&certain antigens were detected by immunohistochemical method and &?galactosidase histochemical staining. Results The isolated fibroblasts could grow and proliferate in vitro，and over 95% of them were positive in vimentin by immunostaining. The expression of SA?&?Gal in old cells tendsed to be more apparent than that in young cells. Conclusion The method can obtain highly pure fibroblasts in vitro.
　　【Key words】 &?galactosidase
　　成纤维细胞中间丝的结构蛋白为波形蛋白，不同于上皮细胞的角蛋白，也不同于肌细胞的桥连蛋白，成为不同种类细胞分类鉴定的相对特异性标志[1]。我们对成纤维细胞的标志性蛋白&&波形蛋白在不同个体、不同代龄间的表达进行了检测，在趋向老化的过程中对&?半乳糖苷酶的表达进行了检测，着重研究人皮肤成纤维细胞的鉴定及老化检测，以期为成纤维细胞体外培养及其在医学美容和组织工程产品中的应用提供优质、可靠、充足的细胞来源。
　　1 材料与方法
　　1.1 主要试剂和仪器 DMEM 培养基(Hyclone公司)，胎牛血清(民海)，胰蛋白酶(Hyclone公司)，胶原酶(Sigma公司)，CK19(角蛋白19)，鼠抗人波形蛋白(Vimentin)单克隆抗体，DAB试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司，细胞衰老&?半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天生物技术公司);洁净工作台(苏净集团公司)，高速离心机，细胞培养箱(Forma公司)，倒置显微镜(Leica公司)。
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞分离：无菌条件下取正常人体包皮，酒精消毒，分离皮肤和皮下组织，去除脂肪和疏松结缔组织，将其剪成2～3 mm的皮条。用2.4 U/ml中性蛋白酶4℃过夜消化，分离真皮表皮。将揭下表皮后所剩真皮置于培养皿中，用眼科剪将真皮分剪成糊状(组织大小约为0.1 cm3)，加0.2%胶原酶浸没组织，37℃孵箱中消化1～4 h，以将组织基本上消化散开看不到组织块为度;加D?Hanks平衡盐液离心1 500 r/min，5 min，弃上清，反复5遍，弃上清，加成纤维细胞培养液(含10%胎牛血清的DMEM液)制成细胞混悬液，接种至T-25培养瓶中，置37℃、5%CO2、湿度90%的孵箱中培养24 h后更换培养液，以后每3天换1次培养液，大约7～9 d左右长满后传代。
　　1.2.2 细胞传代：原代培养的成纤维细胞生长汇合率达90%时，向培养瓶内加入0.25%的胰蛋白酶，当胞质回缩、细胞变圆、细胞间隙增大后，加入成纤维细胞培养液终止消化，按1∶3传代至新的培养瓶中，置37℃, 5%CO2，湿度90%的孵箱中培养。3～5 d待细胞生长汇合率达80%以上时即可再次传代。
　　1.2.3 细胞形态学观察及免疫细胞化学鉴定：每天用倒置显微镜观察细胞生长和增殖情况，拍照记录细胞形态。细胞鉴定采用免疫化学染色ABC法,接种适当代龄细胞于干净无菌盖玻片上，正常培养，待细胞生长汇合率达到50%～80%时进行免疫化学染色。一抗分别为鼠抗人波形蛋白单克隆抗体，CK19(角蛋白19)为阴性对照，PBS为空白对照，吸出培养液PBS清洗1遍，冰冻丙酮：甲醇(1∶1)室温固定30 min，3%H2O2去离子水室温孵育10 min，封闭用山羊血清室温孵育30 min，滴加一抗4℃孵育过夜，滴加二抗(生物素标记山羊抗小鼠IgG)37℃孵育30 min，然后滴加HRP标记的链霉卵白素37℃孵育30 min，DAB显色，复染，封片。每部操作之间均用PBS清洗。见表1。表1 免疫细胞化学检测
　　1.2.4 细胞老化检测：分别取不同个体、不同代龄的成纤维细胞，适量接种于盖玻片上，待细胞生长汇合率达到50%～80%时，使用细胞衰老&?半乳糖苷酶染色试剂盒进行检测。吸出培养液，PBS洗1遍，加1 ml &?半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min，吸出固定液，PBS洗3次，每次3 min，加1 ml染色液，37℃孵育过夜，在普通光学显微镜下观察。吸出染色液，加2 ml PBS，4℃可保存数天，或加上封片液封片后，4℃可保存较长时间。显微镜下观察计数，蓝染细胞为阳性细胞，每次随机挑选视野计数至少500个细胞，得到阳性细胞百分率，即衰老细胞率(阳性细胞数/总细胞数&100%)。
　　1.3 统计学分析 应用SPSS 15.0统计软件，对3批细胞分别进行直线相关分析，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 成纤维细胞的分离和培养 传代细胞在接种24 h内贴壁生长，细胞逐渐伸展。约3～5 d左右待细胞生长汇合率达80%以上时即可再次传代，细胞可传40代左右，建立起来源与人皮肤的成纤维细胞系。
　　2.2 成纤维细胞形态学观察 成纤维细胞刚接种尚未贴壁时呈球形，贴壁后细胞逐渐伸展，呈梭形、长条形、多角形或不规则形2～3 d即呈汇合状态。细胞密度低时细胞之间排列疏松，有较大细胞间隙。细胞密度高时，细胞相互平行排列或呈放射状和漩涡状排列。随着细胞代龄的增高，细胞逐步出现老化现象，镜下观察可见细胞体积变大、形状扁平，过度伸展，伸展末端细长有分支，生长缓慢。
　　2.3 成纤维细胞的鉴定 ABC法对成纤维细胞进行波形蛋白免疫细胞化学染色。结果成纤维细胞胞浆内见大量棕黄色颗粒，核为蓝色，阴性对照及空白对照均未见阳性表达。对18个批次不同代龄的细胞进行了39次检测，除3次检测阳性率分别为97%、95%、97%外，其余36次检测阳性率均为100%，见表2。表2 波形蛋白检测结果表3 &?半乳糖苷酶染色结果
　　2.4 成纤维细胞老化检测 对成纤维细胞&?半乳糖苷酶染色，其阳性率显示随细胞代龄的增加阳性率呈递增的趋势，见表3。对同批次细胞间阳性率的直线相关分析结果显示Ⅰ、Ⅱ批次细胞&?半乳糖苷酶染色阳性率和细胞代龄之间分别呈极显著和显著相关，而Ⅲ批次细胞阳性率和代龄之间无显著相关性，见表4。Ⅰ批次细胞15代之前阳性率均50%，而Ⅱ批次细胞13代就达到了48.72%，Ⅲ批次细胞10代之前就已超过40%，说明不同批次间细胞生长状态不同，存在个体差异，老化速度不一致。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ批次细胞取材年龄分别为9、12、18岁，可以看出随着年龄的增长细胞活性逐渐降低。表4 成纤维细胞&?半乳糖苷酶染色阳性率直线相关分析结果
　　3 讨论
　　成纤维细胞(fⅠbroblast)是皮肤真皮层中最重要的细胞，常附着在胶原纤维上，能合成和分泌大量胶原蛋白，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用[2]。目前，成纤维细胞主要应用于医学美容及组织工程产品中。医学美容多以直接注射细胞为手段，组织工程产品中成纤维细胞主要充当的是种子细胞的角色。
　　成纤维细胞系是通过原代、传代培养获得的，是有限细胞系，随着代龄的增加，细胞会逐渐出现衰老迹象。细胞衰老具有一些共同的生物学和分子特征。一个特征是染色体端粒的逐渐缩短，大量研究提示端粒不单记录着有丝分裂的次数，也是细胞衰老的标志，但是目前缺少有效测量端粒长度的手段[3]。 1995年Dimiri等[4]发现了一种与细胞衰老相关的&?半乳糖苷酶(senescence?assocⅠated &?galactosidase,SA?&?Gal)。他们发现体外培养人二倍体成纤维细胞在pH6时，&?半乳糖苷酶染色的阳性率随代龄增加而增加，他们把这种中性&?半乳糖苷酶定义为衰老相关的&?半乳糖苷酶。目前，随着细胞培养技术的发展，已建立了多种皮肤成纤维细胞的培养方法[5]。本实验采用胶原酶消化法可获得数量巨大、纯度极高、状态良好、活性较高的成纤维细胞。在最初分离时，成纤维细胞中不可避免地混有部分角质形成细胞，随着不断传代，角质形成细胞逐渐被筛除，得到纯度极高的成纤维细胞。
　　成纤维细胞的特异性标志蛋白是波形蛋白。角质形成细胞的特异性蛋白为CK19，因此使用CK19作为阴性对照能够更好的筛选出成纤维细胞。
　　本实验对18个批次不同代龄(p1～p33)的细胞进行了免疫细胞化学检测，除3次阳性率低于100%以外其余均为100%，证明了我们获得的细胞确为纯度极高的成纤维细胞。3次低于100%阳性结果并非出现在低代龄，而是第11代左右，分析原因可能是由于操作原因造成了弱阳性结果，致使人为判断失误而导致的试验误差。实验为成纤维细胞系的鉴定提供了有效的方法，对成纤维细胞系的建立具有重要意义。
　　随着成纤维细胞体外培养代龄的增加，细胞的增殖能力逐渐降低，当不能再进行有丝分裂时，其生长达极限而成为衰老细胞。1995年Dimri等[4]首次提出了一种鉴别衰老细胞的标志酶-衰老相关&?半乳糖苷酶。正常皮肤成纤维细胞体外培养时随着增殖能力的逐渐降低，&?半乳糖苷酶阳性细胞的积累速度也加快。
　　本实验对不同批次不同代龄的细胞进行了&?半乳糖苷酶染色。对同一批次细胞进行直线相关分析显示，随着代龄的增加阳性率总体呈现递增的趋势，两者之间存在显著相关性。对于Ⅲ批次细胞呈现不相关性是由于出现了不稳定点并且样本数量较少所致。对于不稳定点的出现，我们分析可能是由于孵育时染色液蒸发导致染色不充分，也可能是在细胞培养、传代时由于某些因素导致细胞状态不稳定所致。另外，通过对不同批次间细胞比较得出不同批细胞生长状态不同，老化速度不一致，个体间存在差异，年龄较小的材料更容易得到活力较高的细胞，由此建议取材年龄以10岁左右为宜。但这也并非绝对，个人体质的差异也可能影响细胞活力。
　　综上所述，&?半乳糖苷酶染色法能够简单、快速的检测细胞老化过程，具有重要的生物学及临床意义。需要注意的是，该法也有一定的局限性，应该综合考虑各种生物学指标如DNA甲基化水平、端粒长度、线粒体DNA片断缺失等才能更准确的阐明细胞的衰老机制。
　　皮肤的中层主要由胶原蛋白构成，胶原蛋白形成皮肤支架，使皮肤具有弹性、光泽。成纤维细胞能合成和分泌大量胶原蛋白等多种细胞外基质，随着人的衰老，成纤维细胞数量减少，胶原蛋白分泌减少，造成皮肤中层萎缩，即会出现鱼尾纹、额头纹、鼻唇沟变深等。应用成纤维细胞进行美容除皱和创伤修复，可望在今后成为安全、有效、全新的医学修复方法。
　　本实验进行了成纤维细胞的鉴定和老化检测，为相关研究提供了简单、有效的方法，对成纤维细胞系的建立具有重要意义。
【参考文献】
& 　　1 杨志明主编.组织工程学.第1版.北京:化学工业出版社,.
　　2 吴国平,周燕,谭文松,等.人皮肤成纤维细胞在二维和三维培养系统中的生长代谢特性.中国组织工程研究与临床康复,?77.
　　3 蔡霞,张鹏,唐胜建,等.正常人成纤维细胞老化过程中β?半乳糖苷酶的变化.解剖科学进展,?11.
　　4 Dimri GP, Lee XH, Basile G, et al.A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.Proc Natl Acad Sci USA,63?9367.
　　5 马刚,王 胜,陈世义,等.皮肤成纤维细胞收缩功能的研究 .白求恩医科大学学报, 2?273.
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论文写作技巧首先，用肉眼检查培养容器中是否存在可见的微生物污染，比如培养基pH改变、浑浊或有颗粒样的物体。同时也要注意观察有没有小的真菌菌落，因为它们在显微镜下不易被发现。这些菌落可能会飘浮在液体表面，特别是在培养容器周边附近。
其次，在倒置显微镜下观察细胞常规形态和生长状态，留意检查任何镜下可见的微生物污染的迹象。在某些细胞系中，培养液中漂浮的细胞通常是死亡的细胞。但是，许多细胞在进行有丝分裂的时候也会变圆，形成折光性很强（很亮）的球体，并且在受到扰动后也会飘浮起来。两者的区别在于，死细胞通常会变圆脱落但一般折光性不会很强。
除了这些日常检查外，还需要对细胞进行周期性的真菌、细菌以及支原体检查。
培养液的准备：准备针对特定细胞系在购买或文献中推荐使用的新鲜培养液，并用记号笔在培养容器上标记传代时间和细胞代数等信息。确保添加了补充成分（如：谷氨酰胺、生长因子、抗生素等）并且预先放置培养箱进行了pH平衡。一个75cm2的培养瓶大约需要12-15ml培养液，如何使用其他规格的培养容器需要进行相应的调整。
收集细胞：
大多数的细胞在完全生长汇合前（还有一些生长的空间）进行细胞传代，可以达到最佳的生长状态，因为此时细胞是处在活跃的对数生长期。实验中观察到的任何异常现象都应该被记录在每个细胞系特定的记录本上。
细胞的最佳收集方法的制定原则是以最轻柔的方式破坏细胞与培养容器以及细胞之间的连接。对于大多数细胞而言，这就需要使用含化学试剂或酶的消化液。胰酶是最常用的消化液，它的常规用量在0.05%到0.25%之间。胰酶的最佳工作浓度通常是指可在较短时间内（10-15min），使细胞从培养容器壁上脱落形成单细胞悬液的最低浓度。某些细胞相对其他的细胞更难以消化，此时通常在胰酶中还需要添加胶原酶或螯合剂如EDTA等，以提升消化能力。
当细胞生长在含哺乳动物源性血清的培养液时，细胞需要首先进行清洗以除去血清，因为血清的存在会抑制胰酶的活性。血清残留是胰酶消化失败的常见原因。细胞消化时，要求使用不含钙和镁离子的缓冲液，因为这两种离子在细胞间以及细胞与培养容器间的吸附中发挥重要作用。
单层细胞的收集：
1.去除细胞培养液
2.加入5ml消化液清洗细胞一次，然后吸除（该方法的试剂用量是针对75cm2培养瓶，如果使用其他培养容器需要适当的增加或减少试剂的用量）。如果消化液中包含胰酶，就需要清除所有的血清残留，因为血清中含有胰酶抑制剂。（注：这里也可以使用DPBS清洗1-2次，节约点消化液）
3. 加入2-3ml消化液，每隔5min在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。对于特别难以消化的细胞，可以在37度进行消化。对消化液进行预热可以减少消化时间，为了避免细胞成团，在等待细胞脱落的过程中不要敲击或摇晃培养瓶。
4. 使用移液管向细胞悬液中加入6-8ml生长培养液，吹打培养瓶底部收集所有残留的细胞。此时，在倒置显微镜下进行简单观察应该看到细胞悬液中至少95%的细胞为单细胞。如果不是，可能需要进一步进行吹打。
5. 收集细胞悬液，按需求进行细胞计数或者等分，然后分发至准备好的培养容器中。对于一些细胞系或者酶消化液（胶原酶），在分发之前有必要通过轻柔的离心（125g，5min）去除酶消化液。
细胞的计数或等分：
为了得到细胞的生长速率或者按已知的浓度接种细胞，就需要对细胞悬液进行计数，我们可以使用血细胞计数器或电子细胞计数器。血细胞计数器的优点是比较便宜，而且可以同时检测细胞的活率。轻轻混匀细胞悬液，取出0.5ml进行细胞计数。向其中加入0.5ml活细胞染色液如台盼兰（trypan blue）或赤藓红B（erythrosin B），充分混匀，取出部分样品，小心加入干净的血细胞计数器中。
计算细胞悬液中细胞的实际浓度（每毫升悬液中的细胞数）以及细胞的活率，然后计算为了达到合适的传代密度需要使用的悬液体积。除了细胞计数，细胞悬液也经常按传代培养瓶的数量进行等分。例如，1：2传代意味着将一个培养瓶中得到的细胞悬液等分至两个新的等培养面积的培养瓶中，该法适用于细胞的精确密度不是非常重要时的常规细胞传代。
细胞的接种：
分发合适的细胞悬液至事先准备好的细胞培养瓶中（将高浓度的细胞悬液直接加入空的培养瓶会导致细胞的不均匀贴壁和生长）。对于生长快速的细胞，接种的密度可以低一些。然而，有些细胞在低于一定接种密度时，生长的不好。但多数细胞在起始密度为103-104细胞每平方厘米或更高（每个75cm2培养瓶接种7.5&104到7.5&105个细胞）时都可以生长的很好。
细胞的培养：
将细胞放回培养箱，大多数的哺乳动物细胞在35度到37度的恒温下生长的最好。除了维持稳定的温度，对于非封闭的培养容器如Dish或多孔板，培养箱还需要维持较高的湿度和CO2水平。高湿度可以防止培养容器中的液体挥发损失，进而导致的培养液浓缩引起的高渗透压。
当培养液使用的是含适量的NaHCO3的缓冲系统时，提升CO2的水平（通常为5%-10%）可以使培养液维持在一个合适的pH范围（7.0-7.6）。为了使此类缓冲系统可以正常的工作，需要使用非密封（瓶盖旋松）或气体可透过的培养瓶以保证正常的气体交换。如果没有可用的CO2，有一种缓冲系统可以在封闭的培养容器中维持培养液处在合适的pH范围。
传代次日进行镜下观察，确保细胞已经重新贴壁并活跃增殖。培养期间按要求进行换液，对于大多数活跃增殖的细胞来说，通常一周需要换液2-3次。
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【原创】复苏细胞后传代即死的问题
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大家好，本人养的是Marc-145细胞，养了很长一段时间后有一天污染了，就全死了，遂复苏。冻存时用的是Sigima的细胞级别的DMSO。冻存液比例为DMSO:MEM:血清=1：7：2.配完之后调的PH，未加任何抗生素。复苏时为37度水浴约2min，再转到有营养液的离心管中离心，1300r/min，5min。再用20%血清浓度的营养液重悬后转到细胞瓶中。第二天用10%血清营养液换液。第三天壁上就长满了，长势挺好。可是，重点是可是，我将这长满的细胞传代后，细胞圆圆透亮的，第二天细胞就不怎么贴壁，漂浮的细胞结构已破损。让有经验的师兄看了看瓶子里面的营养液，不像是污染的那种混浊，只是有细胞碎片漂着，颜色变黄，在显微镜底下看时全是细胞碎片，没有什么贴壁的。请有经验的大侠帮小妹解答一下这是什么原因呢？是细胞污染了还是细胞不行了呢？如果是污染了或者是细胞不行了为什么前面还能贴壁且长得挺好呢？
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营养液，PBS，胰酶都换过新的，吸管都是一次性的。而且本人养细胞已有一年了，算是老手了，非常注意消毒这方面的细节，照顾细胞可谓是尽心竭力了，亲爹都没这么上心呐，可本人依然保持细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋呐！！
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你们离心都用这么高的转速么？？？
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高纯1991 你们离心都用这么高的转速么？？？一般1000转左右，不过还是要看具体细胞
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至于楼主的问题，“我将这长满的细胞传代后，细胞圆圆透亮的，第二天细胞就不怎么贴壁，漂浮的细胞结构已破损。”所以还是考虑细胞在再次传代过程中的损伤，这种可能性比较大
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高纯1991 你们离心都用这么高的转速么？？？这不算高吧，我看网上说只要1500r/min以下都是可以的呀
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yj1984ren 至于楼主的问题，“我将这长满的细胞传代后，细胞圆圆透亮的，第二天细胞就不怎么贴壁，漂浮的细胞结构已破损。”所以还是考虑细胞在再次传代过程中的损伤，这种可能性比较大那如何减轻或者避免这种情况呢？
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建议两点：一是细胞长过了，会出现这种情况。还有一种是：【细菌、真菌污染污染】细菌污染：细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米(μm)计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养基短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有些细菌污染在静置的培养液中十分不明显，稍加振荡后细菌和裂解的细胞产生的碎片会浮起。真菌污染：真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在阴雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多位烟曲菌、黑曲霉、毛霉菌、孢子菌、白色株菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不浑浊，显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝、管、及树枝状菌丝，并悬浮漂荡在培养液中。
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考虑下血清质量我的经验是，血清太假了，质量太差，细胞传代不贴壁、生长缓慢甚至停止
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可以考虑下是消化损伤，楼主的说法很像是消化过度，特别是新的胰酶，刚开瓶的胰酶能力很强
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hellen_zhang 可以考虑下是消化损伤，楼主的说法很像是消化过度，特别是新的胰酶，刚开瓶的胰酶能力很强那要稀释胰酶吗，我还怕是胰酶污染呢，今天传代的时候又开了一个新的分装的胰酶呢
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liupeng0215 考虑下血清质量我的经验是，血清太假了，质量太差，细胞传代不贴壁、生长缓慢甚至停止血清质量是不怎么样，但是这种血清有公司也有使用，他们养的细胞没有这么娇气呢，我的细胞就是从他们那拿的，只不过是传了好多代了，从他们那拿的细胞就是用的这种血清也贴壁生长，只不过是复苏起来的细胞不好好长，不知道是怎么回事
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luke_zhanghy 建议两点：一是细胞长过了，会出现这种情况。还有一种是：【细菌、真菌污染污染】细菌污染：细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米(μm)计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养基短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有些细菌污染在静置的培养液中十分不明显，稍加振荡后细菌和裂解的细胞产生的碎片会浮起。真菌污染：真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在阴雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多位烟曲菌、黑曲霉、毛霉菌、孢子菌、白色株菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不浑浊，显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝、管、及树枝状菌丝，并悬浮漂荡在培养液中。我的细胞的营养液就是变黄的很快，快的时候一天就能变黄，我做实验的好多东西都换新的了，营养液里头为了防止支原体都加了卡那霉素，还有哪些方面是需要注意的呢，平时不加双抗，感觉对细胞伤害挺大的
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琵琶豆 血清质量是不怎么样，但是这种血清有公司也有使用，他们养的细胞没有这么娇气呢，我的细胞就是从他们那拿的，只不过是传了好多代了，从他们那拿的细胞就是用的这种血清也贴壁生长，只不过是复苏起来的细胞不好好长，不知道是怎么回事确定血清是同一货吗？同一批次？有时候，可能会买到假货。即使是真货，批次之间有时也有很大差异呢。
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变黄没事，说明细胞状态好
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liupeng0215 确定血清是同一货吗？同一批次？有时候，可能会买到假货。即使是真货，批次之间有时也有很大差异呢。这种血清是公司统一进的，检过猪瘟什么的病之后才用的，公司进的应该没有假货吧，况且我前段时间一直在用这种血清养，也长的。
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公司进的未必就不是假货，要看你们公司是什么样的公司。前段用过，要是同一批次，才能说明问题。我们从同一代理商买，不知道是真是假货，至少同一货不同批次，会有很大的差别。
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liupeng0215 公司进的未必就不是假货，要看你们公司是什么样的公司。前段用过，要是同一批次，才能说明问题。我们从同一代理商买，不知道是真是假货，至少同一货不同批次，会有很大的差别。你这样一说我想起来了，这瓶血清虽然是一个牌子的，但是不是一个瓶里面的
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想问下您，这种复苏后传代的现象是怎么解决的？有找到具体原因吗？我的MARC-145页出现了同样的问题，刚复苏时状态很好，只要是一传代 后，细胞刚开始还贴壁，但是细胞不伸展，不生长，慢慢的就死掉了。然后又复苏了不同时期冻存的细胞株，大部分都是这样的情况特别想知道原因，解决这个问题，现在天天的工作就是复苏细胞，实验几乎没进展
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jennyzhao123 想问下您，这种复苏后传代的现象是怎么解决的？有找到具体原因吗？我的MARC-145页出现了同样的问题，刚复苏时状态很好，只要是一传代 后，细胞刚开始还贴壁，但是细胞不伸展，不生长，慢慢的就死掉了。然后又复苏了不同时期冻存的细胞株，大部分都是这样的情况特别想知道原因，解决这个问题，现在天天的工作就是复苏细胞，实验几乎没进展我还没有搞清楚这个问题就毕业了，毕业之前所幸不复苏细胞了，直接从公司里面拿了，走了个捷径。
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