培养基配制与灭菌方法
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培养基配制与灭菌方法
　　微生物培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，微生物培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。为了达到特定要求的研究，需要进行培养基配制和灭菌，那么微生物培养基该如何配制与灭菌呢?
1.配制溶液
　　向容器内加入所需水量的一部分,按照培养基的配方,称取各种原料,依次加入使其溶解,最后补足所需水分，对蛋白胨、肉膏等物质,需加热溶解,加热过程所蒸发的水分,应在全部原料溶解后加水补足。
　　配制固体培养基时,先将上述已配好的液体培养基煮沸,再将称好的琼脂加入,继续加热至完全融化.并不断搅拌,以免琼脂糊底烧焦。
2.调节pH值
　　用pH试纸(或pH电位计、氢离子浓度比色计)测试培养基的pH值,如不符合需要,可用10%HCl或10%NaOH进行调节,直到调节到配方要求的pH值为止。
　　用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤.用纱布过滤时,最好折叠成六层,用滤纸过滤时,可将滤纸折叠成瓦棱形,铺在漏斗上过滤。
　　已过滤的培养基应进行分装.如果要制作斜面培养基,须将培养基分装于试管中.如果要制作平板培养基或液体、半固体培养基,则须将培养基分装于锥形瓶内。
　　分装时,一手捏松弹簧夹,使培养基流出,另一只手握住几支试管或锥形瓶,依次接取培养基。分装时,注意不要使培养基粘附管口或瓶口,以免浸湿棉塞引起杂菌污染。
　　装入试管的培养基量,视试管和锥形瓶的大小及需要而定.一般制作斜面培养基时,每只15×150毫米的试管,约装3～4毫升(1/4～1/3试管高度),如制作深层培养基,每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基,一般以其容积的一半为宜。
　　分装完毕后,需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气,避免污染.棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作,不要用脱脂棉,以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时,要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度,揪取手掌心大小一块,铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中,用右手食指插入棉花中部,同时左手食指与姆指稍稍紧握,就会形成1个长棒形的棉塞.棉塞作成后,应迅速塞入管口或瓶口中,棉塞应紧贴内壁不留缝隙,以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松,塞好后,以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内,上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札,准备灭菌。
6.制作斜面培养基和平板培养基
　　培养基灭菌后,如制作斜面培养基和平板培养基,须趁培养基未凝固时进行。
　　(1)制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.5～1米左右的木条,厚度为1厘米左右，将试管头部枕在木条上,使管内培养基自然倾斜,凝固后即成斜面培养基。
　　(2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上,点燃酒精灯,右手托起锥形瓶瓶底,左手拔下棉塞,将瓶口在酒精灯上稍加灼烧,左手打开培养皿盖,右手迅速将培养基倒入培养皿中,每皿约倒入10毫升,以铺满皿底为度.铺放培养基后放置15分钟左右,待培养基凝固后,再5个培养皿一叠,倒置过来,平放在恒温箱里,24小时后检查,如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物。
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TA的最新馆藏[转]&[转]&培养基的常规配制程序
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Ke's kingdom
一、目的要求
了解培养基的配制原理。
了解培养基常规配制程序。
了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项。
二、基本原理
正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础，由于微生物种类及代谢类型的多样性，
因而用于培养微生物培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异。但一般培养基的配制程序却大致
相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无
菌检查等基本环节大致相向。
三、实验材科
待配各种培养的组成成分，琼脂，1mol/L NaOH溶液，1mol/L (升，统一用大写)HCl溶液。
天平或台秤，高压蒸汽灭菌锅。
(三)玻璃器皿
移液管、试管、烧杯、量筒、锥形瓶、培养皿、玻璃漏斗等。
(四)其他物品
药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、纱布、线绳、塑料试管盖、牛皮纸、报纸等。
四、实验内容
(一)玻璃器皿的洗涤和包装
1．玻璃器皿的洗涤
玻璃器皿在使用前必须洗刷干净。将锥形瓶、试管、培养皿、量筒等浸入含有洗涤剂的水中，用毛刷刷洗，
然后用自来水及蒸馏水冲净。移液管先用含有洗涤剂的水浸泡。再用自来水及蒸馏水冲洗，洗刷干净的玻璃器皿
置于烘箱中烘干后备用。
&&2．灭菌前玻璃器皿的包装
(1)培养皿的包装&&培养皿由一盖—底组成一套。可用报纸将几套培养皿包成一包，或者将几套培养皿直接置
于特制的铁皮圆筒内，加盖灭菌。包装后的培养皿须经灭菌之后才能使用。
(2)移液管的包装&&在移液管的上端塞入—小段棉花(勿用脱脂棉)。它的作用是避免外界及口中杂菌吹入管内
，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花应距管口约0.5cm左有。棉花自身长度约1-1．5cm。塞棉花时，可用一
外圈拉直的曲别针，将少许棉花塞入管口内。棉花要塞得松紧适宜，吹时以能通气而又不使棉花滑下为准。
先将报纸裁成宽约5cm左右的长纸条，然后将已塞好棉花的移液管尖端放在长条报纸的一端，约成45度角，折
叠纸条包住尖端，用左手握住移液管身，右手将移液管压紧，在桌面上向前搓转，以螺旋式包扎起来。上端剩余
纸条，折叠打结，准备灭菌。
(二)液体及固体培养基的配制过程
& & 1．液体培养基配制
(1)称量一般可用1/100粗天平称量配制培养基所需的各种药品。先按培养基配方计算各成分的用量，然后进
行准确称量。
(2)溶化&&将称好的药品置于一烧杯中，先加入少量水(根据实验需要可用自来水或蒸馏水)，用玻棒搅动，加
(3)定容&&待全部药品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需体积。如某种药品用量太少时，可预先配成较浓溶
液，然后按比例吸取一定体积溶液，加入至培养基中。
(4)调pH&&一般用pH试纸测定培养基的pH。用剪刀剪出一小段pH试纸，然后用镊子夹取此段pH试纸，在培养基
中蘸一下，观看其pH范围，如培养基偏酸或偏碱时，可用1mol/l NaOH或1mol/l
HCl溶液进行调节。调节pH时，应
逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。边加边搅拌，并不时用pH试纸测试，直至达
到所需pH为止。
(5)过滤&&用滤纸或多层纱布过滤培养基。一般无特殊要求时，此步可省去。
& & 2．固体培养基的配制
配制固体培养基时，应将已配好的液体培养基加热煮沸，再将称好的琼脂(1．5％-2％)加入，并用玻棒不断
搅拌，以免糊底烧焦。继续加热至琼脂全部融化，最后补足因蒸发而失去水分。
(三) 培养基的分装
根据不同需要，可将己配好培养基分装入试管或锥形瓶内，分装时注意不要使培养基沾污管口或瓶口，造成
污染。如操作不小心，培养基沾污管口或瓶口时，可用镊子夹一小块脱脂棉，擦去管口或瓶口的培养基，并将脱
脂棉弃去。
& & 1．试管的分装
取一个玻璃漏斗，装在铁架上，漏斗下连一根橡皮管，橡皮管下端再与另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一
弹簧夹。分装时，用左手拿住空试管中部，并将漏斗下的玻璃管嘴插入试管内，以右手拇指及食指开放弹簧夹，
中指及无名指夹住玻璃管嘴，使培养基直接流入试管内。
装入试管培养基的量视试管大小及需要而定，若所用试管大小为15&150 mm时，液体培养基可分装至试管高
度1／4左右为宜；如分装固体或半固体培养基时，在琼脂完全融化后，应趁热分装于试管中。用于制作斜面的固
体培养基的分装量为管高1／5(约3—4m1)；半固体培养基分装量为管高的1／3为宜。
& & 2．锥形瓶的分装
& & 用于振荡培养微生物用时，可在250 m1锥形瓶中加入50
ml的液体培养基，若用于制作平板培养基用时，可在
250 m1锥形瓶中加入150ml培养基，然后再加入3g琼脂粉(按2％计算)，灭菌时瓶中琼脂粉同时被融化。
(四)棉塞的制作及试管、锥形瓶的包扎
为了培养好气性微生物，需提供优良通气条件，同时为防止杂菌污染，则必须对通入试管或锥形瓶内空气预
先进行过滤除菌。通常方法是在试管及锥形瓶口加上棉花塞等。
& & 1．试管棉塞的制作
制棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉
花从中央压入团孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。也可借用玻璃棒塞入，也可用折叠卷塞法制作棉
制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入。棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，
试管不下落为准。棉塞的2／3在试管内，1／3在试管外(图5—1—4)。
目前也有采用金属或塑料试管帽代替棉塞。直接盖在试管口上。灭菌待用。
将装好培养基并塞好棉塞或盖好管帽的试管拥成一捆，外面包上一层牛皮纸。用铅笔注明培养基名称及配制
日期，灭菌待用。
& & 2．锥形瓶棉塞制作
通常在棉塞外包上一层纱布，再塞在瓶口上。有时为了进行液体振荡培养加大通气量，则可用8层纱布代替
棉塞包在瓶口上。目前也有采用无菌培养容器封口膜直接盖在瓶口，既保证良好通气，过滤除菌又操作简便，故
极受欢迎。
在装好培养基并塞好棉塞或包上八层纱布或盖好培养容器封口膜的锥形瓶口上，再包上一层牛皮纸并用线绳
捆好，灭菌待用。
(五)培养基的灭菌
培养基经分装包扎之后，应立即进行高压蒸汽灭菌，100Pa灭菌20min（灭菌条件根据培养基不同有所差异，
含糖培养基105℃，30min）。如因特殊情况不能及时灭菌，则应暂存于冰箱中。
(六)斜面和平板的制作
& & 1．斜面的制作
将已灭菌装有琼脂培养基的试管，趁热置于木棒上，使成适当斜度，凝固后即成斜面(图5—1—5)。斜面长度
不超过试管长度1／2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。
& & 2．平板的制作
将装在锥形瓶或试管中已灭菌的琼脂培养基融化后，待冷至50℃左右倾入无菌培养皿中。温度过高时，皿盖
上的冷凝水太多，温度低于50℃，培养基易于凝固而无法制作平板。
平板的制作应采用无菌操作，左手拿培养皿，右手拿锥形瓶的底部或试管，左于同时用小指和手掌将棉塞打
开，灼烧瓶口，月左手大拇指将培养皿盖打开一缝，至瓶口正好伸入，倾入10-12m1的培养基，迅速盖好皿盖，置
于桌上，轻轻旋转平皿、使培养基均匀分布于整个平皿中、冷凝后即成平板。
(七)培养基的无菌检查
灭菌后的培养基，一般需进行无菌检查。最好从中取出1-2管（瓶），置于37℃恒温箱中培养1—2天，确定无
菌后方可使用。
(八)无菌水的制备
& & 在每个250
mL的锥形瓶内装99mL的蒸馏水并塞上棉塞。在每支试管内装4.5m1蒸馏水。塞上棉塞或盖上塑料试
管盖。再在棉塞上包上一张牛皮纸。高压蒸汽灭菌，100 Pa灭菌20分钟。
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。在配置斜面培养基分装试管时,一般应装多少,为什么
浔子酝秩259
一般装1/3左右,如果超过1/2的话斜面就做不起来了,那么所得的表面积就小了,是一种浪费.1/3左右的量少倾斜角度可以很大,所得的表面积就大了,获得了最大利用率,因为底部的培养基对表面上的菌是起不到做用的.如果是做穿刺的话建议也不要超过1/2.到时候灭菌的时候防止培养基飞溅到塞子上,导致容易染菌而作废!
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扫描下载二维码名词释义/斜面培养基
　　斜面培养基（agarslantculture-medium ）：固体培养基（solid culture medium ）的一种形式；制作时应趁热定量分装于内，并凝固成斜面的称为斜面培养基，用于菌种扩大转管及菌种保藏。
　　与斜面培养基相对和并列的概念是：平面培养基、高层培养基。固体培养基倒在培养皿内，凝固成平面的称为，用于菌种分离及研究菌类的某些特性；分装在试管内，直立凝固而制成的称为高层培养基，这样接入菌种后虽然发育的面小了一点，但培养基的厚度增大，营养丰富，时间长些也不容易干燥、开裂，常用于保存菌种。
制作方法/斜面培养基
　　1、配制溶液
　　向容器内加入所需水量的一部分，按照培养基的配方，称取各种原料，依次加入使其溶解，最后补足所需水分。对、肉膏等物质，需加热溶解，加热过程所蒸发的水分，应在全部原料溶解后加水补足。
　　配制固体培养基时，先将上述已配好的液体培养基煮沸，再将称好的琼脂加入，继续加热至完全融化。并不断搅拌，以免琼脂糊底烧焦。
　　2、调节pH值
　　用pH试纸（或pH电位计、氢离子浓度比色计）测试培养基的值，如不符合需要，可用10%HCl或10%NaOH进行调节，直到调节到配方要求的pH值为止。
　　3、过滤
　　用、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。
　　4、分装
　　已过滤的培养基应进行分装。如果要制作斜面培养基，须将培养基分装于试管中。如果要制作平板培养基或液体、，则须将培养基分装于锥形瓶内。
　　分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。
　　装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。
　　5、加棉塞
　　分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与拇指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。
　　6、制作斜面培养基和平板培养基
　　培养基灭菌后，如制作斜面培养基和平板培养基，须趁培养基未凝固时进行。
　　(1)制作斜面培养基。在实验台上放1支长0.5～1米左右的木条，厚度为1厘米左右。将试管头部枕在木条上，使管内培养基自然倾斜，凝固后即成斜面培养基。
　　(2)制作平板培养基。将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10毫升，以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物。
　　有一种简捷快速制备斜面培养基的方法，现介绍如下：
　　制作培养基斜面，传统的方法是将试管每10支为一组扎成一捆，高压灭菌后，一支一支地摆成斜面，操作比较烦琐，占用面积又多，造成诸多不便。
　　1、将胶合板截成长18厘米(与试管长度相等或略短)、宽9厘米(比并排5支试管直径的总和略窄)的小块备用。
　　2、在并排5支试管上面平置截好的胶合板，再在胶合板上面并排放5支试管，然后将试管的上、下端分别用牛皮纸包好，用线扎紧，使胶合板两侧的试管保持平行，置高压锅中灭菌。
　　3、高压灭菌后，经自然冷却，待气压降至零时，将高压锅的锅盖打开点，当棉塞水分充分蒸发后取出，不用拆捆，直接摆成斜面。大量制斜面时，既快捷又很少占用空间，非常方便，还便于保温，减缓凝结速度，充分吸收游离水分。
　　4、如需将斜面培养基保存一段时间，可在灭菌前将聚丙烯塑料袋套在试管外并扎紧袋口，灭菌后取出，直接摆成斜面，可防止水分蒸发。
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关于斜面培养基
小弟今年刚研一，目前还在学习阶段，最近两天在做试管的斜面固体培养基打算封存菌种。但是倒完斜面之后，培养基就是不粘在试管内壁，转动试管的话培养基就会跟着转动。
我的步骤是这样的：按正常配方加入了牛肉膏、蛋白胨、NaCl之后，溶解，定容，调pH至7.2，然后加琼脂，灭菌。就拿出来冷却到差不多之后就倒斜面了，可是每次都冷却一个多小时都不能粘住试管内壁。
求大神解答，因为刚刚申请的号，所以没有多少金币悬赏，但是希望各位师兄师姐不吝赐教，感激不尽。
不是，他没有把琼脂一起放进去煮沸，灭菌。
我用的琼脂粉，不是那种老式的琼脂块，应该不需要煮了吧，灭菌的时候应该就能混合的很好了。
需要煮吗、之前别人做的没有煮的也貌似没出现过我这种问题哎
我每次灭菌后试管壁都会有水，但是不多，这个貌似无法避免啊。
哈，多谢多谢，辛苦了师姐
过两天我试试先分装再灭菌。
灭菌之前放在一起就行了~就是把俩天放在一起，然后高温灭菌，再拿出来等一长段的时间，应该就能凝上了~ 条的是百分二琼脂，粉的没用过
灭菌之前放在一起就行了~就是把俩天放在一起，然后高温灭菌，再拿出来等一长段的时间，应该就能凝上了~ 条的是百分二琼脂，粉的没用过:hand:
好的，我试一下
:o%15？。。。。一般都不会超过2g/mL的啊
我冷却一个多小时还短吗？我记得本科做的时候很快就凝固了的啊
百分之二的琼脂，你看你加够量了没？ 一个小时应该是时间短，你灭完菌之后拿出来也是很烫的
好的，那我下次试下时间久一点，主要我怕时间越久越容易感染杂菌，那个紫外灯一段时间后自己会灭。。麻烦
开风，点酒精灯，开紫外，关窗，这样的话基本没问题的！
一个多小时还短吗？你一般都是多久
哇，一夜啊。。试管口封吗?不然会不会感染杂菌啊
你说封不封呢:sweat:
当然是要封口了，一般不会染菌
灭菌的时候不就融化了。。
PDA是什么培养基呢？你之前碰到过和我相同的问题是吗？那你后来有没有找到是什么原因呢
事实证明，用琼脂粉也是要煮的，因为我今天没煮，所以就很失败，各个试管不均匀，然后就是琼脂沉底。。。反正在灭菌之前要让琼脂融化了。经验之谈。
研究生必备与500万研究生在线互动！
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