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中国生物器材网 电话：021-请教ELISA实验中吸光值不稳定问题
aumeypw735
可能由于被测物质不稳定，可能有化学变化，这样会影响吸光度的测定值，另外可能与分光光度计本身有关，比如对吸光度值的测定算法设计的不好，随时间变化不稳定等！
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ELISA加样偏差对稀释液吸光值变化关系的研究
目的探讨酶联免疫法(ELISA)微量加样试验中，加样偏差对稀释液吸光值(OD值)变化的影响与处置对策.方法在HCV-ELISA标准加样量10μl (对照组)基础上递减1、2、3、4、5ul (-1、-2、-3、-4、-5实验组)分别加样，分析不同加样偏差和稀释液OD值(620nm)变化的影响.结果除-1和-2组加样后稀释液OD值与对照组比较无显著差异(p&0.05)外，-3、-4、-5组均存在显著性差异性p&0.01.结论稀释液OD值随着加样偏差增大呈规则下降变化趋势，通过变化关系判定加样准确度并及时采取相应的纠正措施.
作者单位：
广西南宁市疾病预防控制中心 530011
年，卷(期)：
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万方数据电子出版社elisa实验中常见问题以及解决方案_仪器仪表_中国百科网
elisa实验中常见问题以及解决方案
&#160;&#160;&#160;&#160;elisa实验中常见问题以及解决方案1、为什么所有试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作？答：温度是elisa结合反应的重要影响因素。为了使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有试剂平衡至室温，包括检测样本。避免因温度的动力学反应差异而导致elisa检测结果的不准确。2、为什么标准曲线线性较差？答：按照推荐方式保存标准品；溶解标准品之前需短暂离心，彻底收集粉末；确保标准品完全溶解和混匀（大约10分钟），然后再进行后续的系列稀释步骤，确保每一步都充分混匀且精确移液；显色的恰当终止；选择合适的数学拟合方程绘制标准曲线。3、elisa实验为什么必须设置复孔？答：为获得更准确的实验结果，强烈建议标准品及样本进行复孔检测，因为复孔检测可以：计算平均值，确保实验结果更准确；解决实验中误操作造成的跳孔现象；计算cv值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。4、为什么实验过程中孵育、洗涤需要振荡？如何振荡？答：振荡孵育使反应更充分，振荡洗涤使背景更干净。建议使用酶标专用96孔微孔板振荡器。孵育过程振荡，可以加快、加强抗原抗体间的相互碰撞接触，使得反应过程更加完全，od值通常会比未振荡孵育的结果要高；洗涤过程振荡，可以使洗板更干净，在很大程度上能降低背景值，同时可以提高试剂盒检测的灵敏度。5、何时终止elisa反应？答：elisa实验最终需要酶催化底物显色反应来完成，在最佳时间终止反应是elisa实验成功的重要因素。在hrp-tmb酶反应系统中，当最高浓度标准品颜色不再变深，倒数2-3个浓度标准品颜色开始有浅蓝色时，便需要终止反应；或者也可以根据最高浓度标准品孔在620nm的od值来决定，od620=0.9-0.95之间时即可终止。6、为什么酶标仪读数时必须选用双波长？答：首先，酶标仪使用前务必预热10-15min，使测读结果更稳定。其次，elisa实验采用双波长测定吸光度，可以排除单波长检测时的测定干扰（标本的浓度，干扰色等）。一般采用最大波长作为参照波长，在参照波长下，检测物的吸光值最小，检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收；因此，双波长测定，可最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。1、为什么所有试剂和检测样本要平衡至室温后再进行加样操作？答：温度是elisa结合反应的重要影响因素。为了使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有试剂平衡至室温，包括检测样本。避免因温度的动力学反应差异而导致elisa检测结果的不准确。2、为什么标准曲线线性较差？答：按照推荐方式保存标准品；溶解标准品之前需短暂离心，彻底收集粉末；确保标准品完全溶解和混匀（大约10分钟），然后再进行后续的系列稀释步骤，确保每一步都充分混匀且精确移液；显色的恰当终止；选择合适的数学拟合方程绘制标准曲线。3、elisa实验为什么必须设置复孔？答：为获得更准确的实验结果，强烈建议标准品及样本进行复孔检测，因为复孔检测可以：计算平均值，确保实验结果更准确；解决实验中误操作造成的跳孔现象；计算cv值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。4、为什么实验过程中孵育、洗涤需要振荡？如何振荡？答：振荡孵育使反应更充分，振荡洗涤使背景更干净。建议使用酶标专用96孔微孔板振荡器。孵育过程振荡，可以加快、加强抗原抗体间的相互碰撞接触，使得反应过程更加完全，od值通常会比未振荡孵育的结果要高；洗涤过程振荡，可以使洗板更干净，在很大程度上能降低背景值，同时可以提高试剂盒检测的灵敏度。5、何时终止elisa反应？答：elisa实验最终需要酶催化底物显色反应来完成，在最佳时间终止反应是elisa实验成功的重要因素。在hrp-tmb酶反应系统中，当最高浓度标准品颜色不再变深，倒数2-3个浓度标准品颜色开始有浅蓝色时，便需要终止反应；或者也可以根据最高浓度标准品孔在620nm的od值来决定，od620=0.9-0.95之间时即可终止。6、为什么酶标仪读数时必须选用双波长？答：首先，酶标仪使用前务必预热10-15min，使测读结果更稳定。其次，elisa实验采用双波长测定吸光度，可以排除单波长检测时的测定干扰（标本的浓度，干扰色等）。一般采用最大波长作为参照波长，在参照波长下，检测物的吸光值最小，检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收；因此，双波长测定，可最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。关键词：elisa实验
收录时间:日 10:35:15 来源: 作者:不详
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[求助]MTT实验测的吸光度值是多少？
查看完整版本请点击这里：
我在做mtt实验，发现细胞的密度很高了，可是测出的吸光度值是0.05-0.06，很低，大家做的范围大概是多少？查看完整版本请点击这里：
TAT ( 14:10:40)
我也在做MTT，通过酶标仪出来的数据就象上表的格式，但不知这些数据如何处理，只知道采用t检验。我是新手，刚做有关MTT的实验，请各位多多指教！
yapuyapu ( 14:10:59)
按分组，求平均值，根据公式：抑制率=（空白组-处理组）/（空白组-调零组）； 在根据抑制率求IC50 值
hulu呼噜 ( 14:11:22)
一般是这样的值：
Endpoint Read Test Wavelength: 570 , Blank Subtracted& && && && && && && && &
&&1&&2&&3&&4&&5&&6&&7&&8&&9&&10&&11&&12
A&&0.944&&1.107&&1.041&&1.065&&1.005&&0.86&&1.243&&1.355&&1.402&&1.342&&1.381&&1.265
B&&0.764&&0.811&&0.764&&0.739&&0.745&&0.525&&1.003&&1.166&&1.169&&1.085&&1.073&&1.161
C&&0.802&&0.731&&0.701&&0.717&&0.645&&0.423&&0.958&&1.154&&0.971&&0.923&&1.03&&1.264
D&&0.856&&0.758&&0.729&&0.766&&0.59&&0.498&&0.93&&1.174&&1.062&&1.069&&0.946&&1.037
E&&1.335&&1.241&&1.269&&1.195&&1.029&&0.897&&1.412&&1.408&&1.63&&1.515&&1.72&&0.126
F&&1.018&&0.896&&0.845&&1.103&&0.9&&0.739&&1.194&&1.352&&1.414&&1.2&&1.309&&-0.103
G&&0.868&&0.871&&1.028&&1.135&&0.788&&0.679&&1.192&&1.207&&1.123&&1.018&&1.192&&-0.158
H&&1.131&&1.128&&1.06&&1.185&&0.995&&0.847&&1.368&&1.443&&1.465&&1.487&&1.384&&0.134
——————————————————————————————————————————————————————
你的数据是不是有点高啊？你一直都是这样的吸收度嘛？有些书上说490nm测定吸收度，和570nm有什么区别嘛？
一般紫外法（用uv）测定的时候要求吸收度在0.2-0.8范围内比较准确，你这个都已经超过1.0，是否合适呢？
我也是新手，我测的数据（570nm）大概在0.4-0.8之间。希望都交流。谢谢
owanaka ( 14:11:44)
由于是5.1节，我有几天没有上网了，给自己放了假，不好意思现在才来感谢！谢谢，我收到的邮件（来自）也一定是您发来的吧。我打开了邮件，并且成功的使用了您给的计算IC50，万分的感谢！
DDD ( 14:12:03)
我看文献上都采用平均值±标准差表示的啊，而且也说采用t检验，是不是这个公式也可以算呢？？
　　　　　　　　　　对照孔测定的平均OD值一加药组测定的平均OD值
肿瘤细胞杀伤率(%)= -----------------------------------------------------------------------　　　 对照孔测定的平均OD值
再乘100％。还有一个问题：吸光度值是不是就是OD值？这里的对照孔是只含培养液的孔吗？还是含有细胞的空白组？？请多多指教！
DDD ( 14:12:20)
我的数据在570下测的都是一点多，二点多的？？怎么办啊
lgm ( 14:12:43)
请问，具体怎样根据抑制率求IC50 值?
同问这个问题。
书上说，OD值与药物浓度的对数做曲线，求IC50 值，可是怎么求呢？
kswl870 ( 14:13:00)
我也觉得很奇怪,前面看到不少战友都说MTT的OD应该在0.7-1.25之间线性比较好.也的确看到了有文献是这么写(英文),用这么高的OD做增殖曲线的(中文).
但是按照仪器分析书上讲法,分光光度计的吸光度不是应该落在0.2-0.8之间时线性才比较好么?
这样两者就有矛盾了啊.
请教有经验的前辈.
lgm ( 14:13:24)
请问，具体怎样根据抑制率求IC50 值?
——————————————————————————————————————————————————————————————
应该是这样的，用处理组的OD值与浓度（一些列浓度）的对数做曲线，得到曲线方程，求空白组50％的OD值对应的浓度，应该是IC50 值。
不知道对不对。
66小飞侠 ( 14:13:41)
我觉得OD值的大小与所给药物的作用强弱和作用时间长短有很大的关系，不一定要拘泥在某个数量范围之间，只要所测值与空白对照组相比有统计意义即可，统计方法好象还是oneway-anova要稍好些。所用的吸光度波长与所用的仪器特性及所用的细胞种类也有很大关系，应该参考已有文献资料摸索出适合自已实验的条件范围，不一定非要用某个值。
yhz1973 ( 14:13:57)
我看文献上都采用平均值±标准差表示的啊，而且也说采用t检验，是不是这个公式也可以算呢？？
　　　　　　　　　　对照孔测定的平均OD值一加药组测定的平均OD值
肿瘤细胞杀伤率(%)= -----------------------------------------------------------------------　　　 对照孔测定的平均OD值
再乘100％。还有一个问题：吸光度值是不是就是OD值？这里的对照孔是只含培养液的孔吗？还是含有细胞的空白组？？请多多指教！
lgm ( 14:14:15)
请问，在mtt实验中，多少的抑制率才算抑制癌细胞的生长啊？才有意义再进一步验证啊？比如动物实验什么的。
请各位高人指点啊！
@STAR@ ( 14:14:36)
有计算IC50 的软件，直接输入抑制率和对应的药物浓度，软件自动会输出抑制率。
@STAR@ ( 14:15:01)
在新药开发中，IC50值低于10uM，才有意义。
@STAR@ ( 14:15:22)
对照组可以选择空白组，也可以选择溶酶组，我平时用0.2%DMSO 作为溶酶组
orangecake ( 14:15:47)
由于是5.1节，我有几天没有上网了，给自己放了假，不好意思现在才来感谢！谢谢，我收到的邮件（来自zy***@）也一定是您发来的吧。我打开了邮件，并且成功的使用了您给的计算IC50，万分的感谢！
star#room ( 14:16:11)
I think ELISA Reader when work on MTT assay, it should be using OD 570nm. Long timeago, when we test MTT, we all use 490nm, but someday, some scientist said that
490nm is not correct and we should use 570, them we all switch to 570. I do believe that the liner ranger for OD 570nm is locatede is 1.00 to 2.00. Any number greater
or less then that is consider out of ranger, either you have too many of too few cells.
查看完整回复请点击这里：