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2016新编临床基因扩增检验实验室工作规范
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3秒自动关闭窗口阮建波 康东平（东莞市太平人民医院广东东莞523901）
【摘要】目的:研究乳腺癌患者乳腺癌手术标本中乳腺癌易感基因1 (breast cancer susceptibility gene 1，BRCA-1)蛋白表达、原癌基因HER-2的基因扩增与蛋白表达及其与临床病理特征之间的关系。方法: 采用免疫组织化学和显色原位杂交的方法，检测乳腺癌手术切除肿瘤组织中的HER-2和BRCA-1蛋白表达以及HER-2基因扩增情况，对这两个基因的表达与临床相关病理特征之间的关系进行分析。结果: BRCA-1和HER-2蛋白表达在不同组织类型中差异无统计学意义，但在不同肿瘤大小、不同组织分级和有无淋巴结转移中差异有显著性(P &0.05)。BRCA-1蛋白表达与HER-2基因扩增率呈负相关。结论: BRCA-1和HER-2蛋白表达对乳腺癌的发生发展具有一定作用,检测BRCA-1和HER-2蛋白表达在乳腺癌的早期诊断、判断生物学行为、预测预后中有重要意义。另外BRCA-1与HER-2可能存在相关性，须进一步研究。
【关键词】乳腺癌；BRCA-1；HER-2；蛋白表达；基因扩增
【中图分类号】R710【文献标识码】A【文章编号】（6-02
&&&&&&& 乳腺癌是指发生于乳腺导管上皮细胞的恶性肿瘤，是女性常见的肿瘤之一，约占全身恶性肿瘤的7%-10%。我国近20年来发病率有增高趋势，有可能超过宫颈癌而居女性恶性肿瘤的首位。近年来，随着分子生物学研究的迅速进展，肿瘤发生基因学说研究突飞猛进，使得乳腺癌的早期诊断和治疗有了希望。目前，原癌基因-2(HER-2)、乳腺癌易感基因（BRCA-1和BRCA-2）是研究较多的三种致癌基因，它们对于乳腺癌的发生、发展、诊断和治疗具有十分重要的作用。本研究组采用免疫组织化学和显色原位杂交的方法，检测乳腺癌手术切除肿瘤组织中的HER-2和BRCA-1蛋白表达以及HER-2基因扩展情况，对这两个基因的表达与临床相关病理特征之间的关系进行分析。
&&&&&&& 1材料与方法
&&&&&&& 1.1临床资料及标本收集东莞市太平人民医院2007年6月到2008年12月经病理证实的乳腺癌患者手术切除标本124例，患者年龄38岁～67岁，平均52岁。所有标本采用WHO分类标准复查切片，记录患者年龄、肿瘤大小、病理分型、分级、淋巴结转移、TNM分期等临床病理资料。手术切除标本经10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋， 4&m切片4张，分别用于HER-2和BRCA-1的蛋白质HE 和免疫组化染色，6&m 切片1张，用于HER-2的DNA 显色原位杂交(chromogenic in situ hybridization，CISH)。
&&&&&&& 1.2主要试剂和方法
&&&&&&& 1.2.1免疫组化染色BRCA-1和HER-2鼠抗人单克隆抗体及试剂盒购自福州迈新生物技术开发公司，切片常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，3% H2O2去除内源性过氧化物酶，高压锅修复抗原，加入鼠抗人BRCA-1和HER-2单克隆抗体(稀释度1∶50), 4 ℃过夜，加入酶标抗鼠聚合物，室温30 min，DAB反应显色，苏木精对比染色，中性树胶封片。光镜观察阳性信号，阳性信号为棕黄色，正常上皮定位于胞核，异型上皮定位于胞核、胞浆、胞核胞浆。每例免疫组化染色切片由两名病理医师双盲观察。结果根据阳性细胞数分级: (-):阳性细胞数0；(1+):阳性细胞数& 25 %；(2+):阳性细胞数25 %～50 %；(3+)阳性细胞数50%～75%；(4+):阳性细胞数&75%。
&&&&&&& 1.2.2CISH法检测HER-2基因扩增原位杂交、HER-2CISHTM检测试剂盒(美国Zymed公司)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡切片，常规脱蜡水化，加热预处理液煮沸20 mim，胃蛋白酶消化10-20 min ，脱水、晾干；每片滴加10&L探针，杂交，95 ℃变性5 min 后，37 ℃湿盒孵育过夜，漂洗，滴加封闭液室温封闭10 min，滴加鼠抗地高辛抗体30 min， PBS/ Tween 20漂洗，滴加HRP抗鼠抗体30 min，PBS/Tween 20 漂洗，DAB显色30min，复染苏木精，烤干，中型树脂封片。结果判定标准: HER-2基因扩增定位于细胞核中，呈棕黄色的点或簇，&50 %的癌细胞中HER-2基因扩增信号&10个点或呈大簇为高扩增：&50 %的癌细胞中HER-2基因扩增信号5～10个点或呈小簇为低扩增： &50%的癌细胞中，HER-2基因扩增信号为1～5个点为无扩增。
&&&&&&& 1.3统计学方法采用统计软件SPSS13.0进行数据分析。统计数据采用&2检验，P &0.05为差异有统计学意义。
&&&&&&& 表1BRCA-1及HER-2蛋白的表达、HER-2基因扩增与临床病理特征之间的关系
&&&&&&& 2结果
&&&&&&& 2.1BRCA-1及HER-2蛋白的免疫组化结果如表1显示，BRCA-1及HER-2蛋白的表达与临床病理特征之间存在密切关系，不同大小、组织级别和淋巴结转移的乳腺癌的BRCA-1及HER-2表达率均存在统计学差异性（P &0.05），但在不同组织学类型中 BRCA-1及HER-2表达率则无统计学差异性（P &0.05)。
&&&&&&& 2.2BRCA-1蛋白表达与HER-2蛋白表达的关系经相关分析，提示BRCA-1蛋白的表达与HER-2呈负相关且差异有统计学意义(r=-0.579， P &0.001)。
&&&&&&& 2.3BRCA-1蛋白表达与HER-2基因扩增率成正相关，且差异有统计学意义(r=0.154， P &0.005)。
&&&&&&& 3讨论
&&&&&&& 乳腺癌的病因是国内外学者非常重视的研究课题，大量的实验结果支持BRCA-1 基因为抑癌基因，其抑癌作用是呈隐性存在的。当基因发生突变时所编码的蛋白质表现为功能降低或丧失，它的失活使细胞分化受阻，失去正常分化对增殖的作用，从而导致细胞恶变和肿瘤的发生［1］。
&&&&&&& 本研究结果显示BRCA-1 表达阴性或弱阳性的乳腺癌例子在组织分级和淋巴结转移发生率均高于BRCA-1 表达阳性者，提示相对于BRCA-1 阳性表达的乳腺癌而言，BRCA-1 表达阴性者更具有更强的增殖活性。这可能导致BRCA-1 阴性的乳腺癌具有更为恶性的生物学行为。
&&&&&&& 研究发现，BRCA-1相关性乳腺癌有着类似于三阴性乳腺癌（ER、PR与HER-2均为阴性的一类乳腺癌）的表型和分子病理特征，多数学者认为二者之间可能存在一定的相关性。有研究表明，80%-90% BRCA-1相关性乳腺癌为三阴性乳腺癌。本研究发现，BRCA-1相关性乳腺癌中HER-2阳性率低于非BRCA-1相关性乳腺癌。这个结果提示，在BRCA-1相关性乳腺癌中，HER-2是一个相对独立的预后指标。至于BRCA-1是否能作为一个独立的预后指标，这仍是个有争议的问题［2］。根据BRCA-1 相关性乳腺癌的病理学特点，组织分化性差和ER阴性提示预后差，但HER-2阴性又是预后好的指标。根据报道，BRCA-1通过调节下游基因(如VEGF)进一步对肿瘤的增殖发挥作用［3］。 而HER-2也可通过抑制凋亡、上调血管内皮生长因子和血管通透性因子，协助形成新生血管，帮助肿瘤细胞的浸润和肿瘤的生长［4］。但BRCA-1 与HER-2 之间可能的调节机制尚不清楚。本实验结果初步显示， BRCA-1表达与可HER2基因有关，但具体机制仍需进一步探讨。
&&&&&&& HER-2基因，是人类原癌基因，定位于人染色体17q21 。HER-2基因的表达产物c-erbB-2 蛋白属于人类表皮生长因子受体( EGFR) 家族中的第2个成员，是具有刺激生长活性的跨膜酪氨酸激酶受体，包括细胞内区、跨膜区和细胞外区3 部分，在细胞的增殖、分化、迁移、黏附、转化、凋亡中起调控作用。HER-2 基因过表达可导致乳腺上皮细胞的恶性转化，增加乳腺癌细胞的侵袭性，并与淋巴结转移、激素受体阴性状态及预后差有关［5］。本研究结果支持以上结论, 检测BRCA-1和HER-2蛋白表达在乳腺癌的早期诊断、判断生物学行为、预测预后中有重要意义。
［1］王玉林,赵荣宇,张丽芝. BRCA-1和BRCA2在乳腺疾病中的表达和意义［ J ］. 中国医师进修杂志, ) : 13 - 15.
［2］Deng CX. BRCA21: cell cycle checkpoint, genetic instability, DNA damage response and cancer evolution ［ J ］. Nucleic Acids research, ) : 1416 - 1246
［3］Kawai H,L i H, Chun P, et al. Direct interaction between BRCA-1 and the estrogen receptor regulates vascular endothelial growth factor (VEGF) transcription and secretion in breast cancer cells ［ J ］. Oncogene, ) : 7730 - 7739.
［4］PowellWC, Hicks DG, Prescott N, et al. A new rabbit monoclonal antibody ( 4B5) for the immunohistochemical ( IHC) determination of the HER2 status in breast cancer: comparison with CB11, fluorescence in situ hybridization (FISH ) and interlaboratory reproducibility［ J ］. App l Immunohistochem Mol Morphol, ) : 94 - 102.
［5］Tsutsui S , Ohno S , Murakami S , et al . Prognostic value of cerb-2 expression in breast cancer ［J ］ . J Surg Oncol , 2002 , 79(4) : 216 - 223.
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您的邮件地址:附件；医疗机构临床基因扩增检验；实验室工作导则；一、临床基因扩增检验实验室的设计；（一）临床基因扩增检验实验室区域设计原则；1.试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装；2.标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存；3.扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测；4.扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如；（二）临床基因扩增检验实验室的空气流向；（
医疗机构临床基因扩增检验
实验室工作导则
一、临床基因扩增检验实验室的设计
（一）临床基因扩增检验实验室区域设计原则。原则上临床基因扩增检验实验室应当设Z以下区域：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区。这4个区域在物理空间上必须是完全相互独立的，各区域无论是在空间上还是在使用中，应当始终处于完全的分隔状态，不能有空气的直接相通。根据使用仪器的功能，区域可适当合并。例如使用实时荧光PCR仪，扩增区、扩增产物分析区可合并；采用样本处理、核酸提取及扩增检测为一体的自动化分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并。各区的功能是：
1.试剂储存和准备区：贮存试剂的制备、试剂的分装和扩增反应混合液的准备，以及离心管、吸头等消耗品的贮存和准备。
2.标本制备区：核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管。对于涉及临床样本的操作，应符合生物安全二级实验室防护设备、个人防护和操作规范的要求。
3.扩增区：cDNA合成、DNA扩增及检测。
4.扩增产物分析区：扩增片段的进一步分析测定，如杂交、酶切电泳、变性高效液相分析、测序等。
（二）临床基因扩增检验实验室的空气流向。临床基因扩增检验实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。可按照从试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区方向空气压力递减的方式进行。可通过安装排风扇、负压排风装Z或其他可行的方式实现。
（三）工作区域仪器设备配置标准。
1.试剂储存和准备区。
（1）2～8℃和-20℃以下冰箱。
（2）混匀器。
（3）微量加样器（覆盖0.2-1000μl）。
（4）可移动紫外灯（近工作台面）。
（5）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头。
（6）专用工作服和工作鞋(套)。
（7）专用办公用品。
2.标本制备区。
（1）2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。
（2）高速离心机。
（3）混匀器。
（4）水浴箱或加热模块。
（5）微量加样器（覆盖0.2-1000μl）。
（6）可移动紫外灯（近工作台面） 。
（7）生物安全柜。
（8）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）。
（9）专用工作服和工作鞋(套)。
（10）专用办公用品。
（11）如需处理大分子DNA，应当具有超声波水浴仪。
3.扩增区。
（1）核酸扩增仪。
（2）微量加样器（覆盖0.2-1000μl），（视情况定）。
（3）可移动紫外灯（近工作台面）。
（4）消耗品：一次性手套、耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）。
（5）专用工作服和工作鞋。
（6）专用办公用品。
4.扩增产物分析区。
视检验方法不同而定，基本配Z如下：
（1）微量加样器（覆盖0.2-1000μl）。
（2）可移动紫外灯（近工作台面）。
（3）消耗品：一次性手套、加样器吸头（带滤芯）。
（4）专用工作服和工作鞋。
（5）专用办公用品。
上述各区域仪器设备配备为基本配备，实验室应当根据自己使用的扩增检测技术或试剂的特点，对仪器设备进行必要的增减。
二、临床基因扩增检验实验室工作基本原则
(一)进入各工作区域应当严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→ 扩增产物分析区。
(二)各工作区域必须有明确的标记，不同工作区域内的设备、物品不得混用。
(三)不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。
(四)实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。
(五)工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。工作区的实验台表面应当可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应当方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上60～
90cm内照射。由于扩增产物仅几百或几十碱基对（bp），对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。
(六)实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》（GB）。
三、临床基因扩增检验实验室各区域工作注意事项
(一)试剂储存和准备区。贮存试剂和用于标本制备的消耗品等材料应当直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过扩增检测区，试剂盒中的阳性对照品及质控品不应当保存在该区，应当保存在标本处理区。
(二)标本制备区。由于在样本混合、核酸纯化过程中可能会发生气溶胶所致的污染，可通过在本区内设立正压条件，避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须在生物安全柜内开盖，并有明确的样本处理和灭活程序。
(三)扩增区。为避免气溶胶所致的污染，应当尽量减少在本区内的走动。必须注意的是，所有经过检测的反应管不得在此区域打开。
(四)扩增产物分析区。核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板或芯片上探针杂交方法（放射性核素标记或非放射性核素标记）、直接或酶切后琼脂糖凝胶电泳、
包含各类专业文献、中学教育、幼儿教育、小学教育、文学作品欣赏、各类资格考试、10医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则等内容。　
　医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则_临床医学_医药卫生_专业资料。医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则一,临床基因扩增检验实验室的设计(一)临床基因扩增检验实... 　附件 医疗机构临床基因扩增检验 实验室工作导则一、临床基因扩增检验实验室的设计 (一)临床基因扩增检验实验室区域设计原则。原则上 临床基因扩增检验实验室应当设Z... 　第十三条 医疗机构临床基因扩增检验实验室应当按照 《医疗机构临床基因扩增检验 工作导则》,开展临床基因扩增检验工作。 第十四条 医疗机构临床基因扩增检验实验室人员... 　第十三条 医疗机构临床基因扩增检验实验室应当按照 《医疗机构临床基因 扩增检验工作导则》,开展临床基因扩增检验工作。 第十四条 医疗机构临床基因扩增检验实验室人员... 　临床基因扩增检验实验室工作规范_临床医学_医药卫生_专业资料。临床基因扩增检验实验...临床基因扩增检验实验室...1/2 相关文档推荐 医疗机构临床基因扩增检... 6页... 　《医疗机构临床 基因扩增管理办法》及其附件《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》 ; 江苏省卫生厅颁发的苏卫医办〔2010〕76 号文《江苏省临床基因扩增检验... 　省级临床检验中心或省级卫生行政部门指定 机构应当制订医疗机构临床基因扩增检验实验室技术审核 办法,组建各相关专业专家库,按照《医疗机构临床基因扩 增检验工作导则》... 　申请时需提交以下材料: (一) 《医疗机构执业许可证》复印件; (二)可行性研究...必须按照《临基因扩 增检验实验室工作规范》 (另发)开张临床基因扩增检验工 作... 　《医疗机构临床 基因扩增管理办法》及其附件《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》 ; 江苏省卫生厅颁发的苏卫医办〔2010〕76 号文《江苏省临床基因扩增检验...将海蜇的绿色荧光蛋白基因转移到小鼠体内的DNA上.小鼠在紫外线的照射下.也能发出荧光.基因能够转移成功的主要原因是 , 当把绿色荧光蛋白基因用技术手段切成两部分后.将其中的一部分转移到小鼠体内.结果.小鼠在紫外线的照射下.不再发出荧光.该实验说明 . 题目和参考答案——精英家教网——
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将海蜇的绿色荧光蛋白基因转移到小鼠体内的DNA上，小鼠在紫外线的照射下，也能发出荧光，基因能够转移成功的主要原因是___________________________；
当把绿色荧光蛋白基因用技术手段切成两部分后，将其中的一部分转移到小鼠体内，结果，小鼠在紫外线的照射下，不再发出荧光，该实验说明___________________________。
答案：解析：
解析：基因是有遗传效应的DNA片段，因此，基因的构成单位也是4种脱氧核苷酸，脱氧核苷酸构成DNA分子的方式是相同的，所以，基因能够在不同的生物体中转移成功的原因是，构成基因的基本单位相同，都是四种脱氧核苷酸。将基因切成两部分后，基因的功能破坏了，说明基因是控制生物性状的基本单位。基因结构的破坏，就导致了基因功能的丧失。
答案：构成基因的基本单位都是四种相同的脱氧核苷酸　基因是控制生物性状的基本结构单位和功能单位
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科目：高中生物
来源：新教材新学案　生物2必修　遗传与进化（配人教版） 人教版
将海蜇的绿色荧光蛋白基因转移到小鼠体内的DNA上，小鼠在紫外线的照射下，也能发出荧光，基因能够转移成功的主要原因是________；当把绿色荧光蛋白基因用技术手段切成两部分后，将其中的一部分转移到小鼠体内，结果，小鼠在紫外线的照射下，不再发出荧光，该实验说明________。
科目：高中生物
来源：生物教研室
将海蜇的绿色荧光蛋白基因转移到小鼠体内的DNA上，小鼠在紫外线的照射下，也能发出荧光，基因能够转移成功的主要原因是_________；当把绿色荧光蛋白基因用技术手段切成两部分后，将其中的一部分转移到小鼠体内，结果，小鼠在紫外线的照射下，不再发出荧光，该实验说明__________。
科目：高中生物
将海蜇的绿色荧光蛋白基因转移到小鼠体内的DNA上，小鼠在紫外线的照射下，也能发出荧光，基因能够转移成功的主要原因是_________；当把绿色荧光蛋白基因用技术手段切成两部分后，将其中的一部分转移到小鼠体内，结果，小鼠在紫外线的照射下，不再发出荧光，该实验说明__________。
科目：高中生物
将某发光海蜇的绿色荧光蛋白基因转移到小鼠的受精卵中，培育形成的转基因鼠在紫外线的照射下也能发出绿色荧光。不同生物体的基因能够相互转移的原因包括(多选)(　　) A．不同生物的DNA分子和蛋白质结构相同 B．不同生物的DNA分子化学组成相同 C．不同生物的DNA分子空间结构相同 D．不同生物的DNA分子内的碱基数量相同 &
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