蛋白表达系统量极小是怎么回事

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-27 09:08 标签： 蛋白表达纯化实验步骤
如何检测一个细胞中的蛋白质表达量?问题是这样的 我现在有个想法,就是验证杂合子的蛋白表达含量比野生型的少~ 但是具体用什么技术可以做到呢?或者提个思路也行啊~ 谢谢~
实时荧光定量PCR检测mRNA的表达,然后westernblot检测蛋白表达量.
您好~ 您现在有时间吗？我想具体请教一下您~因为我现在还是本科低年级学生，所以对这些还不是很懂。我的qq号是.。。。您能上qq和我具体说下吗？真的很摆脱了~
没有qq，就这里问吧。首先你确定拿到了这两种细胞系，通过PCR反应证明一个是野生型一个是突变型，即snp。然后用试剂盒提取RNA，设计引物，采用半定量或绝对定量的方法，测定mRNA表达水平；然后另取细胞裂解，提取总蛋白，用特异性抗体检测蛋白表达量。很简单，你问一个研究生就行。
那这种荧光定量测定的计数花费贵吗？ 因为我的实验经费不是很多~ 还有我想问问您，据您所知，有没有验证过杂合型的细胞比野生型的蛋白表达量少？这个实验可以定量做出来嘛？
编码区突变很容易造成这种情况，荧光定量PCR需要专门仪器，各个实验室收费不同，你一定有老师的，问问老师，他会有熟人，去测一下也许不花钱
恩~ 有是有老师~但老师是大忙人 不管我们这些本科生的。。。对了~ 您用过这个实时荧光定量pcr吗？ 是能检测出细胞中的mRNA的水平？？？
当然，必须用这个方法。
那实时荧光PCR不是要以mRNA为模板？ realtime pcr 能够以mRNA为模板吗？？？测量蛋白的表达量不能只做westernblot？
real-time PCR功能很多的，可以测溶解曲线，甚至左高分辨率溶解曲线，当然最常用的就是做mRNA表达了，要做定量mRNA表达当然要以mRNA为模板，否则还做个什么。当然，如果你就是想基因分型，那么模板是DNA就可以了。mRNA提取质量是做实验的关键，不要讲解了，realtime定量的基础就是CT值，初始载量不能如实反映试验，那么一定是假阳性或假阴性。做westernblot是非常必要的，但是不要忘记转录后调控，因此做出来mRNA表达升高，但是免疫印迹没变化也别感到奇怪。当然最终起决定作用的还是蛋白表达量，那必须是免疫印迹做的。
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标题: 本来表达量很高的蛋白过了一段时间不表达了咋办？
摘要: [本来表达量很高的蛋白过了一段时间不表达了咋办？] 各位园子里的前辈，在下急于请教各位一个问题：我08年7月份构建好的表达菌，经诱导摸索后目的蛋白有大量表达。之后我就将表达菌加了百分之二十五的甘油冻在-60度了，最近不管是冻存的还是原先放在4度的表达量都很微弱，我也试着将质粒提出又转了下BL21，可是表达量还不进入人意，请大家指点一下！多谢了！我实在是找不出原因了。蛋白不表达可能是质粒丢失，但已经连在表达载体上的目的片段不可能又掉下来了吧？ 关键词:[表达量 质粒 目的蛋白 甘油 蛋白不表达 表达载体]……
各位里的前辈，在下急于请教各位一个问题：我08年7月份构建好的表达菌，经诱导摸索后目的蛋白有大量表达。之后我就将表达菌加了百分之二十五的甘油冻在-60度了，最近不管是冻存的还是原先放在4度的表达量都很微弱，我也试着将质粒提出又转了下BL21，可是表达量还不进入人意，请大家指点一下！多谢了！我实在是找不出原因了。蛋白不表达可能是质粒丢失，但已经连在表达载体上的目的片段不可能又掉下来了吧？
这个应该不会，你转染之前有没有确认你的质粒？如果没有确认的话有可能现在的质粒是空的。
you should test it again using enzyme digestion. if the target gene is ok then you can do transformation to express your protein. good luck
转化前的质粒还在么，用那个质粒重新转化以下试试。最好不要保存菌体，因为有些菌体放时间久了是会出现你说的情况的。
谢谢各位献计献策，不过我都试过了，还是不行，觉得好纳闷呢！
重新挑单克隆，重新保存菌种.
连接上的片段掉下来的可能性几乎为零。表达宿主菌保存导致表达量降低或者不表达是很常见的事情。我们实验室也经常遇到这样的问题。最常规的做法是重新抽提质粒并转化新鲜宿主菌，筛选高表达菌株。表达量降低的原因可能有很多，文献中报道的包括宿主菌基因组突变、质粒不稳定等。具体原因很难说。但有一个原则，质粒最好不要保存在表达宿主菌，而且最好同时保存质粒本身。4度保存不稳定，-20一般般，最好-80度。楼主提到表达量不尽如人意，是不是有表达但表达量不高而已。这种情况下筛选高表达株系更可行，优化培养方法也很有效。
谢谢各位宝贵的建议，试验本来就是件说不清楚的东西，我会再接再厉的，希望以后继续在里跟大家请教、探讨！
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我做的克隆表达目的片段与载体连接后酶切及PCR鉴定都是正确的,为什么表达量特别小呢,只见一条细线,大小应该是表达的融合蛋白,我优化过诱导时间,IPTG浓度,诱导温度但都无变化,我还换过几次载体,结果表达出来的效果都是一样的,到底是怎么回事啊?请求各位高手帮忙.
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顺便说一句,我表达的两个蛋白都出现了这种情况,测序是正确的,我分别用PET28-A和PQE30载体表达的.
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lz是用E.coli表达的么？
表达的蛋白会不会对E.coli有伤害或者被E.coli降解呢？
也许可以试试不同的表达系统，比如yeast等等。
新手的个人愚见~~
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我曾经表达过一个核酸酶，SDS-PAGE看不到，采用Ni-柱浓缩后发现蛋白表达，量也非常少，而且细菌未诱导生长正常，诱导1小时后细菌OD值降低，细菌死亡。原因就是核酸酶有活性表达后，降解DNA使细菌死亡，蛋白也就很少了，突变无活性后表达正常
如果LZ也遇到诱导后菌体死亡的现象，那么你的蛋白对细菌使有毒性，并有致死作用的，换表达系统或者改变表达条件
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你的意思是表达的蛋白对大肠杆菌有伤害,那也不会影响它的表达量呀.而且我的蛋白不是核酸酶类的,这个蛋白国外己有人成功表达了,量也挺大,但是我却做不出来,不知道为什么原因,烦啊
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表达对细菌有伤害的蛋白肯定会影响表达量的，要不就是包涵体。国外采用的是什么载体呢，也是你采用的这几种载体么？
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你可以试试低温诱导看看，有的蛋白需要低温14度20小时，才会出现。
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国外用的也是PET28,我表达的蛋白是细菌细胞壁表面的一种蛋白,对细菌应该是没有毒性的啊,低温诱导我也尝试了,反而比37度更小.真是头疼啊?不知道还有什么人为因素可以影响它呢?经我手表达的两个蛋白都出现了这种情况,别人也有做我一样的蛋白的,表达量却很大,真不知道原因出在哪里了?
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是不是你跑电泳的问题，你可以换人家的阳性蛋白来跑电泳，看看是不是你后期处理跑电泳出了问题。可能是一些仪器，胶等客观的原因。
同情你！祝你早日找到答案。
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我在想是不是转化进去的质粒太少导致我的表达量小，于是又重新转化了一次，以前转化纯质粒我都转化１微升就够了，这次转了１０微升，可是表达出来的效果还是那样，难道是我一开始连接的时候就出了问题？不知道有没有懂这方面的高手，请帮忙细胞库/细胞培养
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谁做这个实验？
原核表达之后的纯化过程需要考虑缓冲液pH值
看起来好复杂
如果构建重组质粒很好的话，且在种子液传代过程中不丢失、不变异，这样基本可以保证蛋白能被诱导表达出了。但是，质粒若遇到甲基化或其他影响，目的基因虽没有丢失，但却不能被诱导表达出来，这样就麻烦了！
才开始 有难度
有点麻烦，容易忽略细节
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