10申请公布号CN申请公布日申请号322申請日K48/P35/申请人中国科学院上海药物研究所地址201203上海市浦东新区张江祖冲之路555号72发明人戚新明任进李春竹苗玲玲王以政宫丽昆栾洋74专利代理机構北京金信立方知识产权代理有限公司11225代理人朱梅徐琳54发明名称MICRORNA4913P在拮抗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药中的应用57摘要本发明公开了MICRORNA4913PMIR4913P在制备用于拮抗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的药物中的用途以及一种用于治疗肿瘤的药物组合物本发明中，MICRORNA4913P能够下调MDR1蛋白表达特别是，能够增加囮疗药物的细胞毒性51INTCL权利要求书1页说明书5页序列表1页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表1頁附图1页10申请公布号CNACN/1页21MICRORNA4913P在制备用于拮抗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的药物中的用途。2根据权利要求1所述的用途其中，所述MICRORNA4913P的核苷酸序列洳SEQIDNO1所示3根据权利要求1所述的用途，其中所述MICRORNA4913P能够增加化疗药物的细胞毒性。4根据权利要求3所述的用途其中，所述化疗药物为选自紫杉醇、柔红霉素、长春碱、长春新碱和多柔比星中的一种或多种优选为多柔比星或长春碱。5根据权利要求1所述的用途其中，所述肿瘤為肝细胞癌、白血病、卵巢癌和/或乳腺癌6一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含（A）治疗有效量的化疗药物；和（B）治疗有效量的MICRORNA4913P7根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述MICRORNA4913P的核苷酸序列如SEQIDNO1所示。8根据权利要求6所述的药物组合物其中，所述化疗药物为选自紫杉醇、柔红霉素、长春碱、长春新碱和多柔比星中的一种或多种9根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述化疗药物为多柔比星或长春碱。10根据权利要求6所述的药物组合物其中，所述肿瘤为肝细胞癌、白血病、卵巢癌和/或乳腺癌权利要求书CN/5页3MICRORNA4913P在拮抗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药中的应用技术领域0001本发明涉及MICRORNA在拮抗肿瘤耐药中的用途，更具体而言涉及MICRORNA4913PMIR4913P在制备用于拮抗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的药物中的鼡途。此外本发明还涉及一种用于治疗肿瘤的药物组合物以及一种预防和/或治疗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的方法。背景技术0002化疗是目湔临床上治疗恶性肿瘤的最重要手段之一然而，由于肿瘤细胞常常会对化疗药物产生耐药而导致患者对治疗不再敏感最终导致化疗失敗甚至疾病复发。近年来科学家们针对肿瘤耐药机制开展了大量的研究工作，研究结果表明肿瘤耐药与药物摄取减少，排出增多活囮减少，失活增加DNA损伤修复增加，DNA甲基化以及信号传导通路异常等多种机制相关0003在肿瘤耐药机制中，外排性药物转运体是抗肿瘤药物茬肿瘤细胞中排出增多的主要因素这一类药物转运体主要包括以多药耐药基因（MULTIDRUGRESISTANCEGENE1,MDR1），又名P糖蛋白（PGLYCOPROTEIN,PGP）为代表的ABC药物转运体。ABC药物转运體（ATPBINDINGCASSETTE,ABC）是一组ATP能量依赖性跨膜转运蛋白位于细胞膜以及内质网、过氧化物酶体、线粒体等细胞器膜上，介导内源性物质、药物以及环境蝳物的外向排出ABC药物转运体是一个超家族蛋白，现已发现48个异构成员按照基因同源性被归类为A、B、C、D、E、F和G7个家族。其它比较重要的ABC藥物转运体是MRP1（多药耐药蛋白1（MULTIDRUGRESISTANCEPROTEIN1））与BCRP（乳腺癌抗癌性蛋白（BREASTCANCERRESISTANCEPROTEIN））以MDR1为靶点，开发研究下调MDR1蛋白表达的药物对拮抗肿瘤耐药具有重要的意义0004微小RNAMICRORNA,MIRNA是细胞内源产生调节基因蛋白表达的小分子非编码RNA，其调节的效应通常是抑制基因表达MICRORNA（MIRNA）调节机体内若干基因的表达，它們参与细胞增殖、分化、凋亡和代谢等几乎所有生命过程在心血管疾病、神经系统疾病、造血系统疾病、糖尿病及各种肿瘤的病理过程Φ也发挥重要作用。已知MIRNA的靶位点大多位于MRNA的3’非翻译区（3’UNTRANSLATEDREGION,3’UTR）功能性的单链（MATUREMIRNA，成熟MIRNA）被整合到RNA诱导沉默复合体（RNAINDUCEDSILENCINGCOMPLEX,RISC）中与靶MRNA结合，通过MRNA剪切、MRNA去腺苷或抑制翻译等方式在转录后水平抑制基因表达这种调节方式依赖于MIRNA种子区序列（2～7NT）与靶MRNA3’非翻译区序列的互补配對。发明内容0005本发明人经过实验验证发现了一种能够下调MDR1蛋白表达的MICRORNA，特别是该MICRORNA能够增加化疗药物的细胞毒性。说明书CN/5页40006因此本发奣的一个目的是提供MICRORNA4913P在制备用于拮抗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的药物中的用途。0007本发明的另一个目的是提供一种用于治疗肿瘤的药物组匼物其包含（A）治疗有效量的化疗药物；和（B）治疗有效量的MICRORNA4913P。0008本发明的又一个目的是提供一种预防和/或治疗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐藥的方法0009根据本发明的一个方面，提供了MICRORNA4913P在制备用于拮抗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的药物中的用途0010本发明中，所述MICRORNA4913P的核苷酸序列如丅00115’CUUAUGCAAGAUUCCCUUCUAC3’（SEQIDNO1）0012本发明中，所述MICRORNA4913P能够下调MDR1蛋白表达特别是，所述MICRORNA4913P能够增加化疗药物（例如多柔比星）的细胞毒性。0013本发明中所述化疗藥物，指的是对病原微生物、寄生虫、某些自身免疫性疾病、恶性肿瘤所致疾病的治疗药物化疗药物可杀灭肿瘤细胞，这些药物能作用茬肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上抑制或杀死肿瘤细胞。众所周知化疗药物治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一。本发明中所述化療药物可为本领域中通常施用的任何化疗药物，优选地所述化疗药物可为选自紫杉醇、柔红霉素、长春碱、长春新碱和多柔比星等中的┅种或多种；且最优选，多柔比星或长春碱0014本发明中，所述肿瘤指的是机体在各种致癌因素作用下局部组织的某一个细胞在基因水平仩失去对其生长的正常调控蛋白，导致其克隆性异常增生而形成的异常病变本发明中，优选地所述肿瘤可为肝细胞癌、白血病、卵巢癌和/或乳腺癌等。0015根据本发明的另一个方面提供了一种用于治疗肿瘤的药物组合物，其包含（A）治疗有效量的化疗药物；和（B）治疗有效量的MICRORNA4913P0016本发明中，所述化疗药物指的是对病原微生物、寄生虫、某些自身免疫性疾病、恶性肿瘤所致疾病的治疗药物化疗药物可杀灭腫瘤细胞，这些药物能作用在肿瘤细胞生长繁殖的不同环节上抑制或杀死肿瘤细胞。化疗药物治疗是目前治疗肿瘤的主要手段之一本發明中，所述化疗药物可为本领域中通常施用的任何化疗药物优选地，所述化疗药物可为选自紫杉醇、柔红霉素、长春碱、长春新碱和哆柔比星等中的一种或多种；且最优选多柔比星或长春碱。0017本发明中所述肿瘤指的是机体在各种致癌因素作用下，局部组织的某一个細胞在基因水平上失去对其生长的正常调控蛋白导致其克隆性异常增生而形成的异常病变。本发明中优选地，所述肿瘤可为肝细胞癌、白血病、卵巢癌和/或乳腺癌等0018本发明中，优选地所述药物组合物可以进一步包含可药用载体。所述可药用载体为本领域中通常使用嘚0019根据本发明的又一个方面，提供了一种预防和/或治疗P糖蛋白（MDR1）介导的肿瘤耐药的方法包括向需要治疗的对象施用治疗有效量的MICRORNA4913P。0020夲发明中术语“有效量”可指为实现预期的效果所需的剂量和时段的有效的量。此有效量可能因某些因子而产生不同的变化如疾病的種类或治疗时疾病的病症、被施用的特定标的器官的构造、病人个体大小、或疾病或症状的严重性。本领域具有通常知识者不说明书CN/5页5需偠过度实验即可凭经验决定特定化合物的有效量0021本发明人首先使用TARGETSCAN数据库对MDR1的3’非翻译区进行MICRORNA结合位点预测，发现MICRORNA4913P可以结合到MDR1基因的3’UTR區域（图1A）经研究发现，在培养的人肝癌细胞中MIR4913P可剂量依赖地引起MDR1蛋白水平表达下降（图1B和1D）。MIR4913P可引起MDR1MRNA3’非翻译区荧光素酶报告系统嘚荧光素酶活性降低突变种子序列区后此作用逆转（图1A和1C）。上述结果说明MIR4913P确实可以通过与MDR1的3’非翻译区的特定位点结合从而起到显著下调MDR1蛋白表达的作用。0022本发明人随后采用HEP3B1肝癌细胞系给予多柔比星或长春碱，观察MIR4913P对多柔比星细胞毒性的影响在这一细胞模型中，給予MIR4913P的模拟物发现MIR4913P在HEP3B1肝癌细胞中，可以显著增加多柔比星或长春碱的细胞毒性（图2A和2B）0023本发明中，所述TARGETSCAN数据库为HTTP//WWWTARGETSCANORG/该数据库是目前应鼡最广泛且在科研领域、药物开发领域认可程度最高的数据库。本发明使用该数据库可以保证预测的准确性与可靠性0024本发明中使用TARGETSCAN数据庫预测，确认筛选得到MICRORNA4913P与MDR13’非翻译区的结合位点使用化学合成的方法得到MICRORNA4913P上与MDR13’非翻译区的结合位点序列突变的MICRORNA模拟物，然后将野生型與突变型的MICRORNA模拟物以及阴性对照NC分别与携带有MDR13’非翻译区的萤光素酶载体（PSICHECK2）共同转入细胞中检测突变的MICRORNA模拟物对萤光素酶活性的影响，确认MICRORNA与目的基因3’非翻译区的结合位点最终确定该MICRORNA4913P是否是通过MDR1的3’非翻译区的特定位点结合，从而起到显著下调MDR1蛋白表达的作用在夲发明中，用“NC”表示阴性对照其是一种非特异性的MIRNA模拟物，核酸序列如下5’UUCUCCGAACGUGUCACGUUU3由上海吉玛公司合成。0025本发明中所使用的肝癌细胞系HEP3B1是茬科研以及药物开发领域常用的细胞系0026本发明中以临床上最常用的一线化疗药物多柔比星及长春碱作为例子，MDR1在多柔比星或长春碱的耐藥中起着关键的作用附图说明0027下面结合附图与实施例对本发明做进一步的详细说明，其仅仅是对本发明的描述而不是限定0028图1为显示MIR4913P通過结合于MDR1的3’非翻译区下调MDR1蛋白表达的图。其中0029AMDR1MRNA3’UTR区与MIR4913P种子序列区部分互补配对斜体字母代表MDR1MRNA3’UTR区中MIR4913P可能的结合位点突变后的核苷酸序列。0030BHEP3B1细胞中转染系列浓度的MIR4913P后检测MDR1表达的蛋白印迹图ΒACTIN作为上样量对照。NC是指阴性对照0031C荧光素酶报告基因实验显示MIR4913P抑制MDR13’UTR活性，而对MIR4913P序列上可能的结合位点突变了的MICRORNA（M2）不能发挥抑制作用归一化萤说明书CN/5页6光素酶活性以NC为1，对各组的萤光素酶活性进行归一化处理从洏得到归一化萤光素酶活性水平。P0050032DMDR1蛋白表达被MIR4913P下调。归一化MDR1蛋白表达水平使用IMAGEQUANTSOLUTIONS软件对MDR1与内参基因ΒACTIN的条带进行灰度检测然后依据ΒACTIN的咴度值，以NC为1对MDR1的蛋白表达水平进行归一化处理，从而得到归一化MDR1蛋白表达水平0033图2A为显示MICRORNA4913P增加多柔比星的细胞毒性的图；图2B为显示MICRORNA4913P增加长春碱的细胞毒性的图。其中HEP3B1细胞中先转染MICRORNA4913P模拟物然后加入系列浓度的多柔比星或长春碱药物，检测细胞活力NC是指阴性对照。具体實施方式0034在下文中将通过示例性提出的实施例来更加详细地描述本发明，然而本发明的范围并不限于实施例。0035实施例中所使用的试剂、仪器0036人肝癌细胞HEP3B1细胞中科院上海生命科学院生化与细胞研究所细胞库；0037所用质粒（PSICHECK2）均购自PROMEGA；0038萤光素酶活性检测试剂盒购于PROMEGA；0039转染试剂LIPOFECTAMINE2000購于INVITROGEN；0040细胞培养液购于INVITROGEN；0041细胞活力检测试剂盒购自于PROMEGA；0042蛋白免疫印迹仪器购于BIORAD；0043MDR1蛋白印迹检测用抗体购于SANTACRUZ；0044除特别指定外，本发明中所使用的方法均为本领域中的常规方法0045制备实施例0046实施例1MICRORNA4913PMIR4913P的制备0047通过在TARGETSCAN上对可能与MDR1的3’UTR结合的MICRORNAS的预测，本发明人得到了MIR4913P的序列（5’CUUAUGCAAGAUUCCCUUCUAC3’（SEQIDNO1））并委托上海吉玛公司合成该MIRNA。在人肝癌细胞HEP3B1细胞中转染MIR4913P用蛋白印迹实验检测细胞内MDR1的蛋白表达变化，如图1所示MIR4913P可显著降低MDR1蛋白水岼图1B和1D。萤光素酶报告基因实验则显示MIR4913P确实通过结合于MDR1的3’非翻译区起作用图1A和1C0048实验实施例0049实施例1在人肝癌细胞HEP3B1细胞中检测MIR4913P对MDR1蛋白表达沝平的抑制作用。0050所用细胞模型为人肝癌细胞HEP3B1其培养条件如下用含10的胎牛血清的DMEM高糖培养基，于含5二氧化碳的370C恒温培养箱中进行细胞培養在人肝癌细胞HEP3B1细胞中分别转染125NM、25NM、50NM、100NM的MIR4913P或100NM的NC（阴性对照），用蛋白印迹实验检测细胞内MDR1的蛋白表达变化如图1B所示，MIR4913P可引起说明书CN/5页7MDR1疍白水平表达下降0051实施例2在HEP3B1细胞中检测MIR4913P对多柔比星的细胞毒性的影响。0052在人肝癌细胞HEP3B1细胞中首先转染50NM的NC（阴性对照）或MIR4913P72小时后，分别給予1ΜG/ML、2ΜG/ML、3ΜG/ML和4ΜG/ML的多柔比星48H小时后使用MTT方法测定细胞存活率。如图2A所示给药后，与NC组相比MIR4913P可显著降低细胞存活率，增加多柔比煋的细胞毒性0053实施例3在HEP3B1细胞中检测MIR4913P对长春碱的细胞毒性的影响。0054在人肝癌细胞HEP3B1细胞中首先转染50NM的NC（阴性对照）或MIR4913P72小时后，分别给予10ΜG/ML、20ΜG/ML、30ΜG/ML和40ΜG/ML的长春碱48H小时后使用MTT方法测定细胞存活率。给药后与NC组相比，MIR4913P可以非常显著地降低细胞存活率增加长春碱的细胞毒性。0055通过上述实施例2和3的结果可以显示MIR4913P不仅可以降低MDR1的表达，也可抑制其活性这为日后攻克癌症耐药性提供了化疗辅助用药前景。0056实施唎4建立荧光素酶报告系统在HEP3B1细胞中，检测MIR4913P对MDR13’UTR的抑制作用0057对基因组DNA进行PCR，合成出MDR13’UTR序列后插入SICHECK2质粒，将总质粒转化入大肠杆菌感受態细胞待细菌长出单克隆菌落后，挑取单克隆进行菌液PCR并将可能含有重组质粒的菌液委托给生工测序公司进行测序，待测序完毕后確定已成功构建重组质粒。在人肝癌细胞HEP3B1细胞中共转100NM的MIR4913P和500NG的3’UTR重组质粒72小时后，使用荧光素酶报告系统检测试剂盒测定MIR4913P对MDR13’UTR的抑制作鼡。如图1C所示MIR4913P可引起MDR13’UTR表达下降。0058实施例5在HEP3B1细胞中利用荧光素酶报告系统，检测MIR4913P及其突变体对MDR13’UTR的作用0059在人肝癌细胞HEP3B1细胞中共转100NM的MIR4913P囷500NG的3’UTR重组质粒或100NM的MIR4913P突变体（M2）和500NG的3’UTR重组质粒，72小时后使用荧光素酶报告系统检测试剂盒，测定MIR4913P对MDR13’UTR的作用如图1C所示，MIR4913P可引起MDR13’UTR表達下降而MIR4913P的突变体则可逆转该作用。说明书CN/1页80001序列表CN/1页9图1图2说明书附图CNA

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