为什么过表达后无法表达ha tag序列

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-17 02:36 标签： ha tag sequence
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带有His标签的禽流感病毒HA基因在杆状病毒表达系统中的表达.pdf73页
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新疆农业大学 硕士学位论文
带有His标签的禽流感病毒HA基因在杆状病毒表达系统中的表达 姓名：李永强 申请学位级别：硕士 专业：预防兽医学 指导教师：孟庆文;冉多良 座机电话号码 摘要 蠢流瘩 A弼∞趣粕％＆，A1 是由A型流感癍毒gl起麴禽类感染器或烈螺传染痪+迄令发生静态致
辩学家普遍试免禽滚懑病毒不感染入，饿97’香港禽流感事件及近年j|乏泰国、越南帮我萄国现 毛5Nl禽流
感病毒直接感染人井敬人死亡的事件，使得禽流感在公共卫生学具有突出意义。血凝索∞elIla罄lmifI．m， 置^谨因在病毒吸附及穿膜过程中起关键作用，可刺激机体产生中和抗体来中和病毒的感染力，对宿主抵
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GPCR蛋白N端连flag不表达！急！
FLAG 连在G 蛋白耦连的受体的N端，做了两个月了还是没有进展。测序是正确的，也没有移码。可western就是检测不到FLAG的表达。受体的ATG带着和不带着我都做了，也不表达。转染的时间24h和48h我也做过了。载体也换过，还是不表达。我看有的文章说GPCR，有的是有糖基化，所以会影响融合蛋白表达的位置。有没有做过给G蛋白耦连受体连flag的大神，帮忙分析一下。
我是在293里面表达的。这个载体是pCMV-Tag 2B，别人用这个质粒已经连过flag了。western肯定没问题，我做了那么多的western了。flag的抗体我用过你说的sigma的，也用了cst的，就是压不出来。是不是因为这个是G蛋白耦连的受体的原因?不知道你做过这方面的吗？
只是做了较多的wb，没做过G蛋白偶联的受体
也遇到一些膜蛋白很难表达的或者不表达的，实在不行估计只能换表达系统了……比如昆虫杆状病毒表达系统，如果不行我们实验室一般四套常见表达系统都来试
因为这个受体没有好的抗体，所以我才想连个flag。如果表达的话，后续还是要连到腺病毒的载体上，包腺病毒感染小鼠的。所以估计别的载体可能还行。我还是要在腺病毒的载体上解决这个问题。谢谢！
这个早就注意过了，受体没有信号肽。不过现在我用的HA的tag，已经做好了！谢谢！
不知你的问题解决了吗？我也有相似的问题，载体也是Tag-2B.但是转然重组质粒后不表达，一起做的别人的重组质粒就表达了……
同问， 我也遇到这个问题
我是在细菌中表达的带FLAG标签的融合蛋白，用目的蛋白的单抗做WB有目的条带，而用FLAG单抗不能检测到目的条带，能帮忙分析一下原因吗？单抗没有问题，C端融合表达，做WB的技术也应该不会有问题。
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重组多肽Tat-HA-NR2B9C载体构建、表达与分离纯化
脑卒中是危害人类生命与健康的常见病、多发病，具有较高的致残率和死亡率。迄今，在临床上除早期使用溶栓药对脑缺血有效外，尚缺乏疗效明确的治疗药物。
通过对脑缺血模型的病理研究发现，NMDA(N-methyl-D-aspartate)受体过度激活导致脑损伤。兴奋性毒性假说认为，NMDA受体过度激活，引起大量的Ca内流，是导致神经元损伤和死亡的主要原因。因此，大量的临床前理论研究认为NMDA受体拮抗剂可以治疗缺血性脑损伤。但是，近十年来NMDA受体拮抗剂的临床研究的结果表明，所有临床研究使用的NMDA受体拮抗剂均因疗效不确切或严重不良反应而被停用。有研究者认为，NMDA受体拮抗剂阻断NMDA受体兴奋性毒性作用的同时也阻断了NMDA受体的正常生理功能。因此，对于突触后信号通路的研究为阻断NMDA受体过度激活引起的兴奋性毒陛找到了新的途径。
PSD-95(postsynaptic density-95)是一种重要的调节蛋白，它将NMDA受体信号传递给细胞内蛋白和酶。PSD-95通过第二个PDZ结构域与NR2B羧基端的tSXV基序结合，同时也可以与nNOS(neuronal nitric oxide synthase)结合，激活nNOS。研究发现PSD-95介导了NMDA受体的过度激活所导致的NO(nitric oxide)释放，从而引起神经兴奋毒性。本实验室的研究还发现，NMDAR/PSD-95/nNOS偶联通路对神经元再生起抑制作用。因此阻断该通路的信号传导可能有利于减轻缺血性损伤，促进脑卒中后神经元的再生，从而改善脑缺血诱导的记忆功能损伤。Tat能够携带有功能的NRB9C多肽片断进入细胞内并有效的干拢NMDA受体和PSD-95的结合，阻断引起神经毒性的下游信号，但不影响神经突触的活性和生理状态TCa的内流。动物实验表明，Tat-NR289C能够降低大鼠缺血后脑损伤的面积并能够促进神经功能的恢复。因此，Tat-MR2B9C多肽有可能成为一种用于治疗脑卒中的可行方法，同时为开发新的有临床应用价值的新药提供实验基础。
本论文研究的目的是原核表达Tat蛋白的蛋白转导结构域(Protein Transduction Domain，PTD)与NR289C的融合多肽片段，并在两片段中插入血凝素(hemagglutinin，HA)的附加抗原表位(epitope tag)。根据Tat、HA及NMDA受体羧基端9个氨基酸的氨基酸序列，在计算机辅助下设计出Tat-HA-NR289C多肽基因的全序列。根据该序列设计出4条寡核苷酸引物片断。以pED质粒为模版，同过三次加尾PCR将原pED质粒的L-ansB-C基因加尾合成Ans-Tat-HA-NR289C。将该基因克隆到pET-28a的限制性内切酶位点上，并预留酸水解位点(aspartyl-prolyl linker)，构建表达载体pED-Tat-HA-NR289C，转化大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。经乳糖诱导后，融合蛋白表达量只有全菌体蛋白的5％左右，通过对培养基、诱导时间的优化，确定含0.1％精氨酸的LB培养基培养4小时后加入乳糖至终浓度5mM，诱导4小时后，融合蛋白表达量可以提高到全菌体蛋白的30％左右。该培养基命名为精氨酸富集培养基，用于提高Tat融合蛋白的表达量并且不影响菌体的生长。融合蛋白的大量表达形成包涵体，包涵体在4M尿素裂解下，释放融合蛋白ansB-C-Tat-HA-NR289C，并在2倍乙醇条件下被沉淀。在80mmol/L，HCl，50℃水解72h，融合蛋白ansB-C-Tat-HA-NR289C水解出目的多肽Tat-HA-NR289C。由于目的多肽等电点在10.4左右，经阳离子交换柱层析，在高盐离子浓度下洗脱目的蛋白。本论文成功构建了Tat-HA-NR289C与天冬酰胺酶C端的融合表达载体(pED-Tat-HA-NR289C)，并表达纯化了目的蛋白Tat-HA-NR289C。通过此过程建立了一套简单可行的融合蛋白表达、水解、分离与纯化的方法。通过该方法可以获得一定量的Tat-HA-NR289C多肽，用于研究其促进神经元再生(神经元增殖、分化、存活)，改善记忆功能障碍(Morris水迷宫空间学习记忆能力)等活性，同时进一步阐明NMDAR/PSD-95/nNOS偶联在脑缺血性损伤中所介导的兴奋性毒性，及该信号通路对神经元再生的抑制作用。并可以根据Tat-HA-NR289C的氨基酸片段构建一系列突变位点的多肽，为研究NR2B亚单位与PSD-95的PDZ-2结构域的相互作用和构效关系提供实验基础。
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