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&&&&&&&&琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）是专门设计用于分离纯化GST标签蛋白、依赖S-转移酶或谷胱甘肽的蛋白以及不同来源（如胎盘、肝脏、胞液、大片吸虫、昆虫、血吸虫、玉米螟等）的谷胱甘肽S-转移酶，通过一步分离即可得到高纯度的目标蛋白，操作条件温和，有利于保持蛋白活性。
2、琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）的应用
纯化谷胱甘肽-S-转移
层析柱：2.5 cm ×1.0 cmI.D.，CV=2 ml&
样品：GST融合蛋白发酵液（0.45μm滤膜过滤，上样5ml）
平衡缓冲液（A）：50mM Tris/Hcl+0.15MNaCl, pH 8.0
洗脱缓冲液（B）：50mM Tris/Hcl+10 mMGSH, pH 8.0&
&流速：1ml/min
&&&&&& 1. 进口介质的流穿峰P0
&&&&&& 2. 进口介质的洗脱峰P1
&&&&&&&3. 本介质的洗脱峰P1
&&&&&& 4. 本介质的流穿峰P0
& 上图为采用琼脂糖亲和层析介质（谷胱甘肽）纯化GST融合蛋白的色谱图和电泳分析图。其中，第2道和第3道的谱带为GST的特征条带，经检测其纯度达到90%以上。证明本中心生产的介质和进口介质一样具有良好的GST分离的专一性，可以实现对进口介质的替代。
3、产品与服务
&&&&& 西宝提供的琼脂糖亲和介质（谷胱甘肽）是以琼脂糖凝胶为基质，以谷胱甘肽为配基，通过特殊的化学反应将谷胱甘肽偶联到琼脂糖凝胶上。该介质具有良好的色谱性能，并具有较强的化学和物理稳定性。此外，西宝还可依据客户的具体需求提供各种规格的预装柱。
&&& 4、规格&
谷胱甘肽亲和介质
20 ~ 30 mmol/mL
粒径范围(μm)
最大流速(cm/h)
用于含GST标签蛋白的纯化
西宝提供的介质如下：
配基密度（ml介质）
15~120mmol
20~30 mmol
7-10 μmol
载量（ml介质）
20~30mg（LDH）
2mg抗凝血酶III
35mgIgG（兔）
粒径范围(μm)
最大流速(cm/h)
用于含组氨酸标签蛋白的纯化
用于含GST标签蛋白的纯化
用于抗凝血酶III、凝血因子及干扰素等蛋白的纯化
用于白蛋白、干扰素、脂蛋白、凝聚因子等蛋白的纯化
用于多种抗体的纯化
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& 主营业务
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& 医药原料及食品添加剂部分（包括原料药及中间体、高端食品添加剂、天然提取物、新材料、精细与专用化学品等）进出口业务；
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gst标签蛋白的表达和纯化
有没有高人做过GST标签的蛋白的表达和纯化，能不能给点建议，我用的是pGEX质粒，需要在什么菌株中表达，纯化时用什么方法收集提纯呢？
请问用的什么公司的柱子分离蛋白的？破碎细菌的那些液体是随柱子一起的吗？
表达量曲线怎么做啊，太麻烦了吧，蛋白怎么提？还是测总蛋白代替？
这是你们实验室用的，包涵体怎么办；lysis buffer 的配方是什么，你们用得载体是什么
包涵体怎么办呢？37诱导，我24度诱导都大部分是在包涵体里面的，不知道怎么办，只能先尿素溶解:hand:再透析，再复性了；你们有什么好办法吗？
楼主是怎么做的呢？能否分享一下你的protocol？和你纯化蛋白的经验？我现在要开始做呢，正在找相关的信息。先谢谢啦。
请问，直接破菌点PAGE胶，条带应该会很杂量很少的吧，这样能看出来吗？
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蛋白质表达：带GST标签蛋白的纯化 pdf
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>GST融合蛋白表达与纯化的实验步骤与注意事项
GST融合蛋白表达与纯化的实验步骤与注意事项
提供者：上海信帆生物科技有限公司 &&发布时间：&&阅读次数：152次&&
&GST表达融合蛋白载体pGEX-KG大小：5006bp，氨苄青霉素抗性（Ampr），iptg诱导表达酶切位点：BamHI 930、SmaI 937、EcoRI 962、XbaI 966、NcoI 974、SalI 980、XhoI 985、SacI 992、HindIII 994GST分子量：构建pGEX-KG-YFG重组质粒1、分析所感兴趣的基因（your favorite&GENE, YFG）Primer Premier 5.0软件，分析YFG含有哪些酶切位点，注意是否与pGEX-KG载体的多克隆位点有重合2、确定合适的双酶切位点NEB网站（） Double Digest Finder软件，查找最佳双酶切组合（下表）
NEB双酶切图谱
NEBuffer EcoRI + BSA at 37&C.
BamHI may exhibit star activity in this buffer.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
NEBuffer 4 + BSA at 25&C with SmaI, then add XbaI ａnd raise temperature to 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 4 at 25&C with SmaI, then add NcoI ａnd raise temperature to 37&C.
NEBuffer 4 + BSA at 25&C with SmaI, then add XhoI ａnd raise temperature to 37&C.
NEBuffer 4 + BSA at 25&C with SmaI, then add SacI ａnd raise temperature to 37&C.
NEBuffer 4 at 25&C with SmaI, then add HindIII ａnd raise temperature to 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer EcoRI at 37&C.
NEBuffer EcoRI + BSA at 37&C.
NEBuffer EcoRI + BSA at 37&C.
NEBuffer 1 + BSA at 37&C.
EcoRI may exhibit star activity in this buffer.
NEBuffer EcoRI at 37&C.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 4 + BSA at 37&C.
This buffer is not supplied with either enzyme.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 1 + BSA at 37&C.
NEBuffer 2 at 37&C.
NEBuffer 3 + BSA at 37&C.
NEBuffer 1 + BSA at 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
NEBuffer 2 + BSA at 37&C.
At least one enzyme has & 100% activity in this buffer, so additional units of enzyme and/or longer incubation time may be necessary.
对照YFG、载体多克隆位点，确定上、下游酶切位点3、设计PCR上、下游引物Primer Premier 5.0软件，设计PCR上、下游引物酶切位点外最多含6个碱基3&端不是A，最好是G或C，但是不推荐使用GC或CG结尾3&端至少保证有10个碱基完全配对得分（Rating）大于70[注意]上游引物：是否添加适当碱基，确保不打乱开放阅读框下游引物：添加终止密码子（UAA、UAG、UGA）4、引物合成及保存合成：上海生工生物工程技术服务有限公司（Email：，Tel：）;纯化方法：柱层析or聚丙烯酰胺凝胶电泳?;价格1.30/碱基保存：贮存浓度：100pmol/&l（100&M），工作浓度：10pmol/&l（10&M），-20&C保存5、PCR扩增YFG模板：质粒10ng/&l 稀释少量 -20&C保存引物：10pmol/&l（10&M） -20&C保存Taq酶：NEB Quick-Load Taq 2&Master Mix 扩增片段小于2.0kb反应体系（配制时置于冰上）
25&l反应体系
50&l反应体系
2&Master Mix
反应条件（1） 预变性 94&C 5 min（2） 变性 94&C 30 s（3） 退火 待定 30 s（4） 延伸 72&C 待定（5） 重复2-5 25-30个循环（6） 补平缺口 72&C 10 min（7） 暂存 10&C[注意]退火温度：参考4（G+C）+2（A+T）-4（互补碱基），参考Ta Opt（Primer Premier 5.0）延伸时间：Taq酶：1kb/min循环数小于30，减少错配琼脂糖电泳检测PCR产物0.8%有效分离范围：10~0.81.0%有效分离浓度7~0.5kb50ml TAE加入5&l EB母液（5mg/ml）100V，30-45min拍照或者紫外灯下切胶回收6、构建pGEX-KG-YFG酶切：双酶切PCR产物、pGEX-KG回收：PCR产物直接回收、pGEX-KG电泳之后切胶回收连接：pGEX-KG 50ng、插入片段150ng转化铺平板：Ampr挑单克隆：Ampr（四个菌落足够了）鉴定：小提质粒酶切 or菌体 PCR7、转化BL21（DE3）pLysS菌株检测GST融合蛋白的表达（1）冰上融化BL21（DE3）pLysS感受态细胞（天根）（2）2 ml离心管中，加入25&l BL21+ 3&l质粒（300-500ng），混匀（质粒&感受态1/10）（3）冰上放置30min（4）42&C，90s（5）冰上放置2-3min（6）加入300&l LB（无抗生素）（相当于菌体10倍体积的LB），37&C，250rpm，1 h（7）4000rpm，2min，弃上清，其余混匀以后涂平板（Ampr），37&C，过夜（16 h）（8）挑单克隆菌落，5ml LB（Ampr），37&C，250rpm，过夜（16 h）（）稀释10倍、20倍、50倍测定OD600（）选择合适的稀释倍数，5ml菌液，37&C，250 rpm，1 h，测定OD600（7）取100&l菌液加入5ml LB（Ampr）（50倍稀释），37&C，250rpm，过夜（16 h）（8）取500&l菌液加入5ml LB（Ampr）（10倍稀释）（其余菌液4&C保存），测OD600（9）37&C，250 rpm，2 h（OD600：0.6-0.8），测OD600（10）室温放置20 min（摇床降温，30&C）（11）取100&l作为诱导前对照，冰上放置（12）菌液中加入IPTG，终浓度0.5-1 mM（13）30&C，250 rpm，2 -4h（可做时间梯度），测OD600（14）取100&l作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，加入50&l 1&SDS上样缓冲液（15）取4ml菌液，12000rpm，离心2min，收集到2ml离心管中（16）加入1ml GST裂解缓冲液重悬菌体（17）超声破碎细胞：超声20s，间隔10s，共3-5次，超声强度200-300W（冰浴）（18）超声后菌液换入一个新1.5ml离心管，4&C，12000rpm，离心5min（19）超声后上清：取25&l上清，加入25&l 2&SDS上样缓冲液（其余上清-80&C保存）（20）超声后沉淀：沉淀加入1ml GST裂解缓冲液重悬，取25&l，加入25&l 2&SDS上样缓冲液（其余沉淀-80&C保存）（21）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min（22）8-10%SDS-PAGE，30&l上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀（23）考马斯亮蓝染色[注意]（1）菌液OD值小于1即可（2）诱导时间最好做一个梯度，2-6h（3）诱导温度适当摸索，24&C、30&C（4）IPTG浓度可做梯度，1mM（5）超声条件可视实际情况改变，只要使细菌裂解充分即可，即菌液清亮不粘稠8、测序确认上海生工生物工程技术服务有限公司（Tel：）测序引物：pGEX-3通用引物测序样品：过夜菌1质粒（浓度大于50ng/&l，10&l）9、中提质粒（Promega）10、表达纯化GST融合蛋白（1）已经转化的菌液，或者重新转化BL21（DE3）pLysS（2）活化：取20&l菌液加入11ml LB（Ampr）（500倍稀释），37&C，250rpm，过夜（16 h）（3）取10ml菌液加入100ml LB（Ampr）（10倍稀释）（剩余菌液4&C保存）（4）37&C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8（OD600小于1.0即可）（5）取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置（6）加入IPTG，终浓度1 mM（7）30&C，250rpm，诱导适当时间（预实验确定）（8）取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100&l 1&SDS上样缓冲液（9）其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞（10）每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中（无气泡）（11）超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W（冰浴）（12）将超声后菌液转移到50ml离心管中，4&C，13000rpm，离心20-30min（13）将上清转移到1个50ml离心管中，取出50&l，加入50&l 2&SDS上样缓冲液（其余上清-80&C保存）（14）将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液（或PBS）重悬，取出50&l，加入50&l 2&SDS上样缓冲液（其余沉淀-80&C保存）（15）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min（16）8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30&l上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀（17）考马斯亮蓝染色（18）混匀glutathione sepharose beads（4B）（mixed slurry），取200&l加入15ml离心管中（2份）（19）加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清（20）加入超声后上清液，4&C轻柔摇荡60分钟（或过夜）（横放）（21）4&C，3000rpm，离心3min（22）10ml GST裂解缓冲液洗涤2次（冰上）（23）10ml TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT）洗涤2次（冰上）（24）弃上清，加入1倍柱床体积的TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油），混匀（25）取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE（26）-20&C保存beads11、GST-Pull-down（1）10cm培养皿中，未处理的细胞或者转染的细胞（3-5&g质粒转染10cm培养皿，Cos-7、293T或者其他细胞，转染24h）（2）加入1ml 细胞裂解缓冲液，细胞铲刮下细胞（冰上）（3）将裂解液收集到1.5ml离心管中，振荡30s，冰上放置5min，重复2-3次，充分裂解细胞（4）4&C，12000rpm，离心15min，收集上清（5）测定蛋白浓度，取1mg总蛋白做GST-Pull-down?（6）留30&l作为input对照（input与Pull-down蛋白量约为1/10）（7）其余溶液，加入20&l glutathione sepharose beads（PBS洗涤过），4&C，轻柔振荡20min（8）12000rpm，离心3min（9）收集上清，分为两份，一份加入1-15&g GST结合的beads，另一份加入等量 GST-融合蛋白结合的beads，4&C，轻柔振荡60min（10）3000rpm，离心3min，回收上清（11）1ml 细胞裂解缓冲液洗涤3次（12）弃尽上清，加入25&l 2&SDS上样缓冲液（13）煮沸3min，12000rpm，离心3min（14）SDS-PAGE，上样顺序：细胞裂解液input、x、GST、x、GST-融合蛋白（x：LSB）（15）考马斯亮蓝染色或免疫印迹[附录]GST裂解缓冲液（前四个组分配好之后4&C保存，DTT和蛋白酶抑制剂现用现加）配方一
500ml贮存液
10ml工作液
150mM NaCl
15 ml 5M NaCl
10ml贮存液
20mM HEPES pH7.5
20ml 0.5M Hepes pH7.5
10ml 1M MgCl2
1% TritonX-100
5ml 100% Triton-X 100
10&l 1M DTT
34&l 0.3M PMSF
inhibitor cocktail
10&l inhibitor cocktail
500ml贮存液
10ml工作液
200mM NaCl
10ml贮存液
25mM HEPES pH7.5
20&l 1M DTT
10&l 1M PMSF
inhibitor cocktail
10&l inhibitor cocktail
TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT）
500ml 贮存液
150mM NaCl
15ml 5M NaCl
20mM Tris pH7.6
10ml 1M Tris pH7.6
0.5M MgCl2
常用IP细胞裂解液
500ml贮存液
10ml 工作液
50mM Tris-HCl, pH7.5
25ml 1M Tris-HCl, pH7.5
150mM NaCl
15ml 5M NaCl
2ml 0.5M EDTA
25ml 10% NP40
0.5% Triton X-100
25ml 10% Triton X-100
2.5ml 1M DTT
100&l 100mM PMSF
1ml 0.5M NaF
20&l 0.5M NaF
complete protease inhibitors
cleared lysates were incubated for 1.5 h with 3 &g immobilized GST or GST-32
关键词：&&
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