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[求助]细胞免疫荧光的几个问题
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1:为做一可能在核内表达的抗原的免疫荧光定位,与膜上的比较,除了多加
0.5% TRITON100 外,还有其它什么不同?
2:核内表达的抗原定位是用免疫荧光更好还是用免疫酶标?
3:以下是我做的细胞爬片的免疫荧光(FITC标的二抗),请各位帮忙详细分析及指正:
我的步骤:细胞爬片(约60-70%)___0.01MPBS洗两次_____4%多聚甲醛固定30分钟____PBS振洗5分钟____0.5% TRITON100破膜10分钟___PBS洗___吹干___
1%BSA封闭30分钟____吹干____1比100稀释的一抗___培养箱内2小时(爬片在6孔内)____PBS振洗3次,每次5分钟____吹干____加荧光素标记的二抗(PBS配)____培养箱内1小时_____PBS振洗2次,5分钟____蒸馏水振洗1次____甘油封片.
图1:可能是很强的非特异荧光屏?原因?(我做的是阳性对照啊!!) 查看完整版本请点击这里：
qumm1985 ( 11:16:50)
1.细胞的密度低了一点，是接种少了还是掉了？
2.第一张片子没有照好，焦距没有调好，所以看不清细胞的结构。
第二张片子只有两个细胞的细胞核是阳性的，而其他的细胞核有的也有阳性的。细胞膜上可以明显的看到一圈绿色的光。
总体判断，实验基本是成功的。只是片子照的不太好。可以调整暴光时间和焦距。我调整了一下对比度，可能效果稍微好点，至少能看清细胞膜上的荧光了。
hot_hot_hot ( 11:17:11)
1比100稀释的一抗?
楼主事先做过预试验么？之前的结果如何？
u234 ( 11:17:44)
请问:核内表达的抗原定位是用免疫荧光更好还是用免疫酶标?
为做一可能在核内表达的抗原的免疫荧光定位,与膜上的比较,除了多加
0.5% TRITON100 外,还有其它什么不同?
u234 ( 11:18:16)
我的方法有无问题?有的人说我的均是非特异荧光?没什么意义?(真是郁闷!)
请问,你说的只有两个细胞的核有荧光是指那两个最亮的吗?你是否注意到其它细胞中间暗影中心也有少量的绿色荧光?
是否可以说明此抗原在胞浆,胞核均有表达?只是胞浆表达更高此?
对不起,刚做,但老做不好,请多多指教!
u234 ( 11:19:29)
另:1比100稀释的一抗是推荐浓度(分装的)
zhenxin ( 11:19:45)
过一段时间我也做了，象大家好好学习
TNT ( 11:21:40)
总体感觉象是非特异性的着色。
核内表达的抗原定位是用免疫荧光或者免疫酶标都应该可以。用0.5% TRITON100打孔足够了，建议封闭和打孔和为一步，即在封闭液中添加0.5% TRITON100，37度封闭2小时。加一抗后最好4度孵育过夜（16小时）。
每一步结束为什么要吹干？没有必要吧。
为什么不用DAPI称染细胞核，这样不就看的很清楚了。
zsxan1990 ( 11:21:57)
请问:若用DAPI染,若是在核内表达,两种荧光就会重叠吧?
能否介绍DAPI的配法及用法及价格\公司吗?谢谢!
one ( 11:22:13)
DAPI可以从sigma公司购买,10mg大概1000RMB左右.
用法API stock solution:10mg/ml in water.DAPI working solution:1-2ug/ml,可以用水稀释,也可以添加到antifade fluorescence mounting medium中,antifade fluorescence mounting medium可以搜一下,有多种配方,最廉价的就是在90%的甘油中添加Vc.
DAPI和FITC的荧光可以在UV和B滤光片下分别观察,互不干扰(PI或者EB在普通荧光显微镜下就会和FITC相互干扰).通过同视野重叠可以判断抗原的表达位置.
66小飞侠 ( 11:22:37)
问几个问题:
90%的甘油中添加Vc:Vc是什么?
DAPI在UV是呈红色吧?
FITC在蓝色激发光是呈绿色,若核上有黄色(红加绿)则也可认为是阳性细胞吗?
能否详细介绍下如何在荧光显微镜下进行同视野重叠?我正很需要这个(不用PS重叠吗?)
除了用DAPI外,还有用什么合适的核染色?若胞质未表达,用什么来染核呢?
one ( 11:22:59)
Vc：维生素c。 用丙基没食子酸也可以。总之一些抗氧化的东西可以防淬灭。
DAPI在UV滤光片下显兰色，未必需要重叠，能看清定位就行了。（如果重叠要用PS，或者用confocal观察）
也可以用hochest(兰色)，PI（红色）,EB（红色）染细胞核。
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细胞免疫荧光：DiI染色方法求助
各路大侠：
& && && && &细胞免疫荧光实验中如果同时染细胞膜（DiI）、细胞浆（目的蛋白）、细胞核（Hoechst33258），是否应该先染膜后染浆，最后染核？？？？？至于DiI染料方面的资料，小女子找了很多，可是确切的方法竟然没有，可否细胞固定后再染膜（固定后的细胞DiI染色时间不知），如果是活细胞染色，那么染完细胞膜后可否再固定？？？不知各位能否施以援手，小女子感激不尽！！
请问具体的步骤是什么？染膜不是指染膜上的目的蛋白吗？难道先加一抗 然后多聚甲醛固定？
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随时随地聊科研细胞免疫荧光失败原因求教！细胞免疫荧光，细胞用甲醛固定后，triton X-100打孔浓度和时间怎么确定浓度？如果浓度过大或者时间过长对细胞有破坏作用吗？做了3次免疫荧光，三次胞核染得都很漂亮，第一次和第三次没有出现任何荧光，第二次只有少量细胞形态变成圆形的细胞，细胞核有荧光出现（可能是凋亡细胞细胞膜通透性强），但是其他正常形态的细胞没有荧光（考虑可能是打孔时间不够，膜通透性不行，抗体没进去）。第三次将triton浓度提高到0.3%，时间延长到20分钟，结果还是没有，不知道啥原因了，郁闷死了！
1%的triton 25分钟
抗体不好用吧？试试用1.5%BSA/0.3%triton/PBS稀释一抗4度过夜
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（求助）关于细胞免疫荧光染色的问题
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这个帖子发布于12年零115天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我用培养的小鼠胎肝细胞做白蛋白的免疫荧光实验，发现细胞都没有荧光，各位大侠帮忙分析一下！我的实验步骤是：1. PBS轻轻漂洗，冷丙酮固定2min，风干，PBS洗三次，每次5min2. 以5％小牛血清In PBS 封闭30min，PBS洗三次，每次5min3. 以稀释的sheep anti mouse albumin第一抗体孵育1 hour，PBS洗三次，每次5min4. 以稀释的bovine anti sheep-FITC 的二抗 孵育45min，PBS洗三次，每次5min5. 缓冲甘油封片，观察！我用的封闭液是由四季青的胎牛血清配置的，不知是不是这里的问题？谢谢各位
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谢谢野原主任，胎肝细胞是需要打孔的，我用的是0.1％triton in PBS。我明天再用BSA封闭试试看，谢谢！
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今天采取这样几个变化做了一下实验！1. 甲醇－10度固定，未封闭！2. 多聚甲醛室温固定30min，未封闭3. 多聚甲醛室温固定30min，用3％BSA封闭！结果第1、2组均有荧光（不过荧光好像很弱，不知怎么回事？明天贴张图片，大家帮忙看看）；第3组没有荧光发现！这样的话能不能说明胎牛血清或BSA将抗原全部封闭的缘故？另外想问个问题。我用DAPI复染了一下，在425nm的滤光片下是蓝色，但在515nm下好像是与FITC一样的颜色? 不知大家有没有注意这个问题？
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甲醇－10度固定，未封闭
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PFA固定，未封闭
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多聚甲醛室温固定30min，用3％BSA封闭，DAPI复染，515nM 滤光片观察
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多聚甲醛室温固定30min，用3％BSA封闭，DAPI复染，420nM 滤光片观察
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从最后两张图片来看，发荧光的是细胞核，我在显微镜下仔细看过，能不能说明在 BSA 封闭的情况下没有特异性荧光出现？（我买的一抗是单克隆抗体）另外，上面两张图片的荧光好像很弱的，是不是因为打孔的缘故？（我在PBS洗三次的时候，只有最后一次用的是加triton的）谢谢
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谢谢coffejumps，1. 上次做的时候做过封闭过的（新生牛血清），未加一抗的对照，结果是没有荧光。所以这次就没有做这个，那我下次再做一次。2. 胎肝细胞的白蛋白表达量应该还好，我的一抗是单抗呀！他试剂说明上说是与牛血清白蛋白不交叉反应的，不明白为什么还能用这个全部封闭？我也不清楚为什么整个片子都发绿，为什么最后一张是黑色背景？3. DAPI不是发蓝色荧光的吗？在515nm的滤光片下也是黄绿色的吗？
第三张是400倍的照片，第四张是200倍的照片！谢谢
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谢谢还有几个问题没有明白（有点菜，呵呵）1. “用BSA封闭没有荧光结果，至少说明了单抗还是不和BSA交叉反应的，不然会整张片均有非特异性荧光”。为什么是这样的呀，如果单抗不与BSA反应的话，我应该可以拿BSA做封闭剂用的吧？2. 第三张图片应该是细胞核，我在显微镜下面仔细看过，和 DAPI 在420nM的图像完全一样（上传的照片倍数不太一样），如果 DAPI 在515nM 没有荧光的话，那是不是我的荧光结果是非特异性的（不过为什么只在细胞核中出现呢？）3. 盖波片到挺干净的，我都没有凉干就用甘油封片了，观察结果也差不多。
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谢谢1. 这个一抗是做免疫扩散等实验的，ICC等实验试剂说明上没说做过，不过他们说也可以。所以我想在这个实验中， BSA （或胎牛血清）的封闭可能影响到了一抗和抗原的结合，所以造成无荧光的现象？2. DAPI是我顺便看一下它的效果怎么样的。倒没想证明什么！不用DAPI衬染的就是上面那两张，颗粒好像没这么明显呀！
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谢谢主任。那是胎肝细胞白蛋白的表达量不够了？不知胎肝细胞分泌出细胞的白蛋白对此有没有影响？还是我的一抗问题呢？打孔是用0.3％trition 中5min，时间应该够了。
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谢谢两位的热心帮助。我贴上来的前两张图片应该是FITC的荧光吧，是不是这样可以说我的二抗没问题？我想后天做这样几组实验：两种对照：一种用成纤维细胞，肯定不表达白蛋白一种是去除一抗的空白对照看看与胎肝细胞的对比如何？这样的目的性是不是更好一些？
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