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酵母双杂交筛选
来源：生物在线
作者：佚名
责任编辑：lmjinfo
1. 操作流程
诱饵基因转化筛库宿主菌Y190―― 含诱饵基因的Y190 保种―― 诱饵基因的
自激活检测―― 筛库(组织库或者小文库)―― 挑选鉴定阳性克隆―― 抽提阳
性克隆中PREY 质粒并在细菌中扩增―― 猎物(Prey)质粒与诱饵(Bait)质粒共
同转化Y190，验证其相互作用
2. 1 诱饵基因转化筛库宿主菌Y190
1） 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜)，OD600 达到1.2 左右。
2） 将此3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数定)YPD 中培养4 小时左右，使培养液OD600 达到0.6。
3） 50ml 离心管收集菌液(Falcon, BD)，Eppendorf Centrifuge 5810R, 700g (1，865rpm)，5 分钟离心收集菌体，弃上清。
4） 20ml ddH2O 重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。
5） 20ml 1XTE/LiAc*重悬菌体，Eppendorf Centrifuge 5810R ，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。
6） 根据每个转化需要50&l 菌液的量加入1XTE/LiAc 重悬菌体，分装到Eppendorf 管中，每管50&l 菌液。
7） 每管加约100ng Bait 基因质粒，5&l 预变性的Carrier DNA*，500&l 1XTE/LiAc/PEG*。
8） 放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30 分钟,15 分钟时混匀一次。
9） 30 分钟后，每管加入15&l DMSO(DIMETHYL SULFOXIDE)，轻轻上下颠倒混匀。
10） 42℃水浴热激20 分钟，每10 分钟上下颠倒混匀一次。
11） 冰浴5 分钟。
12） 700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。
13） ddH2O 洗涤一次菌体。
14） 利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/-Trp 平板上。
15） 30℃培养箱培养。第2 天即可观察到克隆长出，第3 天克隆即长到所需大
Carrier DNA: Herring Testes Carrier DNA,Denatured. Clontech. 10mg/ml.未使用过的Carrier DNA 先100℃变性10 分钟，立即置于冰浴2 分钟,然后再100℃变性10 分钟，之后置于冰浴上备用。已经使用过的Carrier DNA 只需要100℃变性一次即可。
1XTE/LiAc: V10XTE:V10XLiAc:VH2O=1:1:8
1XTE/LiAc/PEG: V10XTE:V10XLiAc:V50%PEG=1:1:8
50%PEG： 50%为质量体积比。PEG3350 溶于ddH20 中一般需要加热溶解
10XTE： 0.1 M Tris-HCl, 10mM EDTA, pH7.5
10XLiAc： 1M LiAc, pH7.5
2.2 含Bait 基因质粒的Y190 保种
Bait 基因长出克隆后，一般用诱饵基因特异性引物直接在酵母菌落中PCR鉴定是否转入正确的Bait 基因的质粒，然后把经鉴定正确的克隆进行保种。
2.2.1 酵母菌落PCR
1) 用含Bait 基因的质粒作为阳性对照，用宿主菌Y190 作为阴性对照
2) 按照下列反应体系进行PCR
ExTaq Premix(Takara) 10&l (2X )
5&Primer 0.5&l (10&M)
3&Primer 0.5&l (10&M)
ddH20 8.9&l菌 0.1&l
3)按照下列反应条件进行PCR
95℃ 5 分钟
94℃ 30 秒
58℃ 30 秒
72℃ 2 分钟
72℃ 5 分钟
72℃延伸2 分钟是针对小于2Kb 的Bait 基因,对于长于2Kb 的Bait 基因要相应延长时间。
4）PCR 产物进行电泳检测
2.2.2 阳性克隆保种
1） 将阳性克隆接种到3ml 相应液体培养基中，30℃振荡培养2-3 天。
2） 700g,5 分钟,离心收集菌体。
3） 加入1：1 的液体培养基和Sterile Glycerol Solution*混合溶液。
4） 充分悬浮菌体，放于-80℃保存。
Sterile Glycerol Solution: 65%(V/V) glycerol, 0.1M MgSO4, 0.5mM Tris-HCl, pH7.4
2.3 Bait 基因的自激活检测
一般采用膜检的方法，检测LacZ 基因的表达情况。膜检方法如下:
1) 将阳性克隆菌落影印于滤纸上。
2) 将滤纸完全浸于液氮中，时间长于30 秒，取出后晾干。
3) 培养皿加入适量显色液*(新鲜配制)，垫一层滤纸，让其完全湿润，将冻溶后的滤纸铺在上面，使显色液渗透到表层。9cm 培养皿加2ml 显色液，15cm培养皿加5ml 显色液。
4) 盖上皿盖，放置在37℃培养箱中，避光放置。
5) 20 分钟后开始观察有无变蓝的阳性结果并记录，一般以3 小时为准，特殊情况下可以看过夜是否变蓝。
6)反应过后打开皿盖，将滤纸烘干，保存并记录。
显色液: 100ml Z buffer,0.27ml &?mercaptoethanol,1.67ml X-gal
Z buffer: 16.1g/L Na2HPO4?7H20, 5.50g/L NaH2PO4?H2O, 0.75g/L KCl, 0.246g/L
MgSO4?7H2O,pH7.0。室温可以存放一年。
X-gal: X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indoly-&-D-galactopyranoside) 溶于DMF
(N,N-dimethylformamide)中，终浓度为20mg/ml。
2.4 诱饵基因筛库
2.4.1 转化法筛选组织库
1) 5-10 个2mm 克隆接种于1ml SD/-Trp 液体培养基中，混匀后转入150ml
SD/-Trp 振荡培养20 小时(过夜)，至 OD600=1.2 左右。
2) 150ml 培养液转入1000ml YPDA(YPD+Adenine)中混匀，此时OD600=0.2~0.3。
3) 培养约4~5 小时至OD600 0.6。
4) 500ml 离心管收集菌液。Beckman Coulter Centrifuge Avanti J-25(以下步骤均使
用此离心机),700g,5 分钟,RT(室温)。同时将2000&l Carrier DNA 预变性两次。
5) 500ml ddH2O 洗涤一次，700g, 5 分钟,RT，收集菌体。
6) 30ml 1X TE/LiAC 洗涤菌体(预先配制50ml 1X TE/LiAC), 转入100ml 离心管。
7) 700g, 5 分钟, RT。(预先配制50ml 1XTE/LiAC/PEG)。
8) 加入12ml 1X TE/LiAc 重悬菌体。
9) 加入100~500&g 文库DNA, 2000&l 预变性的Carrier DNA，轻轻混匀。
10)加入50 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。
11)30℃孵育45 分钟，每15 分钟混匀一次.
12)加入3.2ml DMSO, 轻轻混匀.
13)42℃热激20 分钟,每10 分钟混匀一次.
14)冰浴5 分钟.
15）700g,5 分钟，收集菌体.
16）加入1000ml YPDA,30℃振荡培养60 分钟.
17）700g, 5 分钟，收集菌体.
18) 加入2ml 0.9％ NaCl 悬浮菌体，终体积约5ml 左右。取20&l 菌液做滴度测定， 其余菌液200&l/ 块， 涂布于15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM3-AT(3-amino-1,2,4-triazole)平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长状态。
19) 滴度(转库效率)测定： 20&l +180&l NaCl(0.9％) 1:10 ；
20&l +180&l NaCl(0.9％) 1:100；
20&l +180&l NaCl(0.9％)1:1000；
20&l +180&l NaCl(0.9％) 1:10000
20&l +180&l NaCl(0.9％) 1:100000
1:00；1:100000 三种浓度各取100&l 涂布SD/-Trp/-Leu 平板
20) 转库效率的计算：对生长在SD/-Trp/-Leu 平板上的克隆计数，挑选克隆数在30-300 之间稀释度计算转库效率
转库效率计算实例：
.. 在1：10000 转库效率计数平板上长出100 个克隆(稀释度=0.0001)
.. 总悬浮体积= 5ml
.. 文库质粒用量=100&g
转库效率 = = 5 X 105cfu/&g
21)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长7-14 天后，会有阳性克隆生长出来，阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。
2.4.2 筛选小文库
2.4.2.1 转化法
1)5~10 个2mm 克隆接种于2ml SD/-Trp 液体培养基中，摇20 小时(过夜)，至OD600=1.2 左右。
2) 2ml 培养液转入20ml YPDA 中，此时OD600=0.2~0.3。
克隆数(cfu)X 总悬浮体积
涂板体积X 稀释度X 文库用量(&g)
=cfu/&g DNA
100cfu X (5mlX103&l/ml)
100&l X 0.0001 X 100&g
3) 培养约4~5 小时至OD600 0.6。
4) 用50ml 离心管收集菌液，Eppendorf Centrifuge 5810R(以下步骤均使用此离心机),700g,5 分钟,RT。同时将Carrier DNA 预变性两次。
5)10ml ddH2O 洗涤一次，700g, 5 分钟,RT，收集菌体。
6) 10ml 1X TE/LiAc 洗涤菌体(预先配制1X TE/LiAc)700g, 5 分钟, RT。(预先配
制1XTE/LiAC/PEG)。
7) 加入600&l 1X TE/LiAc 重悬菌体。
8） 加入2&g 小文库DNA，20&l 预变性Carrier DNA，轻轻混匀。
9） 加入2.5 ml 1XTE/LiAc/PEG, 剧烈涡旋混匀。
10) 30℃孵育45 分钟，每15 分钟混匀一次。
11) 加入160&l DMSO, 轻轻混匀。
12) 42℃，热激20 分钟,每10 分钟混匀一次。
13) 冰浴5 分钟。
14) 700g,5 分钟,收集菌体。
15) 加入20mlYPDA,30℃摇60 分钟。
16) 700g,5 分钟，收集菌体。
17) 加入200&l 0.9％NaCl 悬浮菌体,取20&l 菌液做滴度测定，其余菌液涂布于一块15cm SD/-Trp/-Leu/-His/+30mM 3-AT 平板上。第三天起要注意观察平板酵母克隆生长状态。
18) 滴度测定：方法同筛选组织文库。
19)筛库完成，菌在SD/-Trp/-Leu/-His+30mM3-AT 平板上生长7-14 天后，会有阳性克隆生长出来。阳性克隆一般大于3mm。挑取少量菌做膜检(方法见3)。从膜检变蓝的酵母菌中抽提prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。
2.4.2.2 Mating 法
1)将带有小文库基因的质粒分别转入Y187 中(方法见1)，保存甘油菌(方法见2.2)。将甘油菌扩增并保存到96 孔板(Corning Incorporated costar 3599)中，每个孔对应一条小文库基因，-80℃冻存备用。
2) 将Y190 菌液(携带pGB-诱饵基因质粒)平铺在15cm 培养皿中, 用96 孔replicator(sigma)影印到15cm SD/-Trp 平板上。将Y187 菌(携带pACT2-小文库基因质粒)用96 孔replicator 从96 孔板中影印到15cm SD/-Leu 平板上。
3)生长48-72 小时，观察菌落生长情况，每个菌落长至3-5mm，分别印至绒布上。再从绒布上影印到15cm 2xYPD 平板上。Y190 菌(携带PGB-X 诱饵质粒)的
96 个克隆和Y187 菌(携带pACT2-小文库基因质粒)的96 个克隆一一对齐，影印到一起，使其发生Mating。30℃培养20~24 小时。
4)Mating 完成， 再用绒布把菌落从2xYPD 平板影印至SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板上。
5)30℃培养5~14 天，在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板生长出来的克隆做膜检(方法见3)。
6)对膜检显蓝色的菌落做PCR 鉴定(方法见2.1)是否为对应的小文库基因，并用此基因的prey 质粒与Bait 质粒做共转验证。
2.4.3 注意事项
1) 2XYPD 平板培养基应该稍微薄一些，这样培养基比较透明容易观察，可以尽量保证Y 190 菌和Y187 菌克隆对齐。
2) 因为Y190 为Adenine 缺陷菌株，所以菌落为红色。而Y187 非Adenine 缺陷菌株。所以菌落为白色。为了便于操作，一般先把Y187 菌影印到2XYPD平板，然后再影印Y190 菌。
3)Mating 时应该设置阳性对照，以便监测Mating 情况是否良好。
2．5． 抽提酵母质粒
1） 膜检变蓝的阳性克隆用牙签涂布在SD/-Trp-Leu-His+30mM3-AT 平板上，约2cm2，然后放置于30℃培养箱中培养3~4 天。
2) 取一Eppendorf 管，加入30&l 5u/&l Lyticase。把菌用牙签刮到lyticase 中，Vortex充分悬浮。37℃孵育30 分钟。
3) 加入170&l Lysis Buffer 使终体积为200&l。再加入200 & l 玻璃珠
(425-600microns)，200&l 酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，vortex 剧烈振荡5 分钟。
4) 12,000rpm 离心10 分钟，将上清转入一干净Eppfendorf 管中。注意，不要把蛋白转移过去。
5) 加入8&l 10M NH4Ac 和500&l 无水乙醇，混匀，-80℃放置1 小时。
6) 12,000rpm 离心10 分钟，去上清。
7) 加入500&l 70%乙醇洗涤沉淀，12,000rpm 离心5 分钟。
8) 弃上清，真空抽干沉淀。
9) 将沉淀重悬于10&l ddH2O 中，一般取2~3&l 转化大肠杆菌(Escherichia coli)。
Lyticase: 将Lyticase 干粉溶解在1XTE 中，终浓度为5u/&l。
Lysis Buffer: 50mM Tris-HCl(pH8.0), 0.1% Triton X-100 , 0.5% SDS
2.6 酵母质粒的扩增
一般用电转的方法，把从筛库所得的阳性克隆中抽提的Prey 质粒在大肠杆菌中扩增
2.6.1 大肠杆菌(Escherichia coli)电转感受态制备
1) 挑一单克隆接入3ml LB 培养基，摇培14~16 小时至 OD600=1.0~1.2
2) 将摇培后的菌液转接1L LB 培养基, 摇培4~5 小时至OD600=0.7-0.8
3) 离心收菌，10ml 冰水溶解
4) 5000g，2oC 离心10 分钟收菌，400ml 冰水将菌重悬，冰浴10 分钟
5) 5000g，2oC 离心10 分钟收菌，40ml 预冷10%甘油重悬，冰浴10 分钟
6) 5000g，2oC 离心10 分钟收菌，加1ml 10%甘油重悬
7) 用枪测量重悬后的菌液体积，加入与菌液等体积的10%甘油(注：等体积10%甘油指重悬后的菌液体积减去1ml。例：加入1ml10%甘油后重悬菌液体积为
4ml，则加入10%甘油量为3ml)
8) 分装到Eppendorf 管中，每管100&l，冰上操作。
9) -80oC 冰箱保存。
10) 取出两管做阴性、阳性对照。
LB：10g/L 蛋白冻,10g/L NaCl；5g/L 酵母提取物。121oC，20 分钟灭菌。
10%甘油：V 甘油：V 水=1：9
2.6.2 电 转
1)从-80oC 冰箱取出感受态，至冰上溶解。同时，将电转杯至冰上冷却，打开电转仪准备30 分钟。
2)感受态溶解后，将要转化的质粒(或连接产物或其他要转化的物质)加入感受态，用枪吹打均匀(注意，不要产生气泡)。电转时有必要进行阴性对照、阳性对照，以检验感受态是否被污染及感受态是否正常，有利于在出现问题时寻找原因。
3)将混合后的感受态加入预冷的电转杯(Eppendorf,CAT.No.)。(注意，不要产生气泡)
4) 擦干电转杯上电极两边的壁。
5) 将电转杯放入电转仪，启动电极。
6) 电击后，用1ml SOC*将感受态洗出，37oC 孵育45 分钟。
7) 6,000rpm，3 分钟离心收菌。
不同电转杯的最适电压各不相同，经实验：
1mm 电转杯的最适电压为V
4mm 电转杯的最适电压为V
8mm 电转杯的最适电压为V
SOC: 20g/L 蛋白胨，5g/L 酵母提取物，0.5g/L NaCl，2.5mM KCl，pH7.0。121oC，20 分钟灭菌。冷却至60 oC 以下时，每升加入20ml 灭菌的1M 葡萄糖溶液。该溶液使用前每升加入5ml 灭菌的2M MgCl2。
2.7 Prey 质粒与Bait 质粒共转Y190(参考1)
1) 3 个1mm 克隆接种于3mlYPD 液体培养基30℃振荡培养20 小时(过夜)，
OD600 达到1.2 左右。
2) 将这3ml 菌液接入大体积(体积视转化个数确定)YPD 中培养4 小时左右，使
培养液OD600 0.6。
3) 50ml 离心管收集菌液，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。
4) 20ml ddH2O 重悬菌体，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。
5) 20ml 1XTE/LiAc 重悬菌体，700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。
6) 根据每个转化需要50&l 菌液的量加入1XTE/LiAc 重悬菌体，分装到Eppendorf
管中，每管加50&l 菌液。
7) Prey 质粒分别与Bait 质粒和pGB 质粒(无Bait 基因)共转，每种质粒都加入约
300ng；另外再加入5&l 预变性的Carrier DNA，500&l 1XTE/LiAc/PEG。
8) 放置于30℃培养箱或者水浴中孵育30 分钟,15 分钟时混匀一次。
9) 每管加入15&l DMSO，轻轻上下颠倒混匀
10) 42℃水浴热激20 分钟，每10 分钟上下颠倒混匀一次。
11) 冰浴5 分钟。
12) 700g，5 分钟离心收集菌体，弃上清。
13) ddH2O 洗涤一次菌体。
14) 利用残余液体重悬菌体，涂布于SD/-Trp/-Leu 平板上。
15) 30℃培养箱培养。第2 天即可观察到克隆长出，第3 天克隆即长到所需大小。
16) 用滤纸印大约十几个克隆进行膜检(方法见3)。
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标题: 请问酵母双杂交能否筛选核蛋白？
摘要: 请问酵母双杂交能否筛选核蛋白？比如已知一种蛋白能够入核，想寻找能与其结合的核蛋白，能否用酵母双杂交呢？据说酵母双杂交一般筛选的都是胞浆蛋白，没有核蛋白的，这种说法是否准确？为什么呢？希望高手赐教：） 关键词:[酵母双杂交]……
比如已知一种蛋白能够入核，想寻找能与其结合的核蛋白，能否用酵母双杂交呢？据说酵母双杂交一般筛选的都是胞浆蛋白，没有核蛋白的，这种说法是否准确？为什么呢？希望高手赐教：）
这种情况用免疫共沉淀就可以了，用不着酵母双杂交吧。
原来的酵母双杂交本来就过用来筛选核内蛋白质与蛋白质间相互作用的。后来为了扩大其作用范围，发展了一系列其它杂交体系，进而能分析胞质中蛋白相互作用，如Sos恢复系统，它将GEF蛋白与蛋白质X融合，将蛋白质Y与豆酰化信号相连，使用权Y定位于膜上。这样，若X和Y 结合，X连同的蛋白（GEF）就会定于膜上，从而得以靠近膜上的Ras蛋白，激活ras途径，完成Sos过程，在36度生长。
酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立(Fields,S. and Song,O-K.1989)。典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-binding domain，BD)和转录激活结构域(transcription-activating domain，AD)。前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。酵母双杂交系统就是利用杂交基因通过激活报道基因的表达来探测蛋白－蛋白的相互作用。
酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库， 能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
同时，酵母双杂交系统也可应用于确定两个已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域，利用此系统已分析和测定了多种重要结构域，如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域 ， p21cip1蛋白与增殖细胞膜抗原(proliferating-cell nuclear antigen，PCNA) 的结合序列等。此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域，绘制蛋白质联系图谱，在药物设计等许多方面。
一些局限性
首先，双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。其次，酵母双杂交系统的一个重要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域杂交蛋白在无特异激活结构域的情况下可激活转录，从而引起报告基因的表达， 产生“假阳性”结果。
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电话：021-酵母双杂交紧急请教!! - 实验交流 - 生物秀
标题: 酵母双杂交紧急请教!!
摘要: [酵母双杂交紧急请教!!] 酵母双杂筛库共转化后，一个酵母克隆中可能含有不止一个AD的质粒，在这一步大家是如何让多个AD质粒分离的？是按照系统3的说明书来做的吗？那需要X-a-Gal，我没有买，我的显色试验是用Colony-lift Filter Assay来做的，用的是X-Gal。在这一步我该如何做呢？这个步骤是否是必须要做的呢？因为系统2的说明书中并没有提及这一点，但我认为这个问题在酵母中普遍存在，所以在系统2中也不例外 关键词:[酵母 酵母双杂交 质粒 克隆 共转化 质粒转化 大肠杆菌]……
酵母双杂筛库共转化后，一个酵母克隆中可能含有不止一个AD的质粒，在这一步大家是如何让多个AD质粒分离的？是按照系统3的说明书来做的吗？那需要X-a-Gal，我没有买，我的显色试验是用Colony-lift Filter Assay来做的，用的是X-Gal。在这一步我该如何做呢？这个步骤是否是必须要做的呢？因为系统2的说明书中并没有提及这一点，但我认为这个问题在酵母中普遍存在，所以在系统2中也不例外，不做的话对后续试验影响有多大呢？敬请高手指点！！此外，酵母质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)一定要用电转吗？CaCl2法肯定转不进去吗？我这里没有电转仪怎么办呢？
没人理？自己顶一下。
朋友们，帮忙出出主意吧！！
如何让多个AD质粒分离：我以前做的时候是多次划酵母单克隆平板外加x-gal 检验，也就是不断稀释，直至确定每一个酵母里面只含有一个AD的质粒。用x-gal：这得由你的报告基因系统来决定。用电转还是钙转：电转的效率要比钙转高很多，而一般双杂交酵母里的质粒都是低拷贝的，从中抽提出来的质粒量很少。我用的是电转，每次长出来的克隆都不是很多；没有试过钙转，你可以先试一下，不行的话就用电转了。
让AD质粒分离这个过程是不是挺长的呀？如果阳性的克隆较多的话，这一步的操作就很费功夫了。请问你是如何操作的呢？是划-Trp/-Leu双缺板，然后将长出的克隆在滤纸上进行显色吗？还是用X-a-Gal在培养皿中就直接进行显色？
是划3缺板，这样就能把杂的AD质粒ko掉了，我当时做的时候稀释了两轮，另外一个师兄他只做了一轮就已经很纯了。x-gal检测是更进一步的确定留住的阳性AD质粒。我是在滤纸上显色的。
楼上的朋友，再请教一下,如何判断是否纯了呢？我这样的想法不知道对不对？滤纸上显色时是把划板长出的所有克隆都涂到滤纸上，如果显色全都还是蓝色的话就继续再划一轮直至出现白色克隆，表明已经分开了。这里有两个问题：1. 划板时，当全都还显蓝色时，应该挑哪一个克隆继续划板？还是都挑？2. 因为酵母中的AD质粒可能不止一个，是否有那种可能，即使有白色克隆出现了也并不代表酵母中就只有一个AD质粒了？我还没做过，也许问的问题偏颇，望见谅。期待你的回答！！
如果你还没有做到这一步的话,我建议你买X-a-Gal,省时间又省力气,很快就会变蓝的,如果你在三缺上挑的克隆,假阳性是很高的.
楼上说的有理，我使用的x-gal,可能相对于你所说的x-a-gal是比较麻烦了一些。我的Y2H系统说明书上就是用的x-gal来检测其中一个报告基因的表达，也就是确保两个相互作用的蛋白的存在。就按部就班了！使用三缺板就是为了给予一个选择压力把杂的AD质粒淘汰掉以达到纯化的目的，纯化完一轮后，我们是把质粒抽出，转到E.coli里面选择扩增，在每个平板里面平行地挑出3个克隆进行酶切、电泳，如果3个酶切产物的条带大小一致，我们就认为得到的AD质粒是比较纯了的，拿到的质粒便可直接测序；反之不纯，需要进一轮纯化。写了一堆，不知道能不能帮你解决疑问。可能还会有更方便快捷的方法的。这也是我以前做Y2H时碰到的问题，映象很深刻，当时也是向里面的朋友求助的。呵呵^_^希望你实验能够顺利！
这次我明白了,谢谢啊!谢谢bluefield，更感谢zhangxiao715一直以来的帮助！
呵呵，同一条战线上的朋友，何必言谢呢！
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