免疫荧光激光扫描共聚焦显微镜
Immunofluorescence laser scanning confocal microscope
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方法应用免疫荧光组织化学双标记染色技术，在激光共聚焦扫描显微镜下观察染色结果。
Methods Double label immunofluorescence histochemical staining and confocal laser_scanning microscope were used in the experiment.
激光共聚焦显微镜扫描证实了，荧光免疫微粒和巨噬细胞共同积聚在动脉硬化斑块中，并且水平与MRI的发现相关。
Confocal laser scanning microscopy confirmed the co-localization of fluorescent immunomicelles and macrophages in the atherosclerotic plaques, and the levels correlated with the MRI findings.
介绍了应用激光扫描共聚焦显微镜，结合免疫荧光技术研究卵母细胞和早期胚胎细胞骨架的方法。
This study systematically introduced the method of cytoskeleton detection in mouse oocytes and preimplantation embryos by confocal laser scanning microscopy and immunofluorescent staining technique.
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感谢您的反馈，我们会尽快进行适当修改！& [讨论帖]免疫细胞荧光图象重叠：达到激光共聚焦效果
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[讨论帖]免疫细胞荧光图象重叠：达到激光共聚焦效果
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逆卷积运算是比较专业的数学运算,可惜我也不能全部弄懂,具体用的时候必须借助软件来实现,除了我上面提到的三个软件之外,还有Motic的Mult-Focus软件也可以,只不过前三个都能找到盗版的.
ImageProPlus里面有sharpstack模块,是专门用来进行图像增强的,其中就包括j逆卷积处理;MatLab和IDL需要用里面的decovolution函数,具体可查看相应的帮助;Multi-Focus是一个比较易用的软件,专门用来仿真共聚焦图片
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用显微镜拍摄双荧光染色样品时的正规方法有两种，一种是加上专门的两染料滤光片，直接拍摄两种染料的荧光，这种专用的滤光片很贵，1000美金一个，不能通用，所以很少用。不过其效果会很好的。另一种方法是用通用的滤光片分别拍摄两种染料的荧光，然后用数字合成的方法合成一张图片，用photoshop是可以的，当然这不够&专业&。正规的作法是，用单色CCD配上适当的滤光片，分别拍摄十二位灰度的两种单色荧光图片，用imageproplus给它们加上伪彩色，然后可以合成一张双彩色的图片，还可以进行一些其他的分析处理。这个当然是比不上激光共聚焦的效果的。
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1.如何用PS8.01来合成两张不同色的荧光照片?园子里介绍的那种方法(用拷贝)效果不佳.
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在photoshop中合成照片很简单，就是在大一点的照片上加一个图层 ---- 直接粘帖另一张照片就行，这就形成的有两个图层的PHotoshop格式的图片，然后在图层工具栏里找那个透明度选项，如果是100%透明，就能合成显示两张图了，通过调整透明度，还可以变换两张照片的亮度比例，效果能好看一些。最后合并图层保存。
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2.请问:绿色跟蓝色叠加在一起成什么颜色?
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2.电脑里的纯蓝色与纯绿色相加的颜色是湖蓝色。你也一样可以用图层迭加的方法直接看。
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3.带CCD的荧光显微镜(接电脑,用软件拍照的),在观察荧光时,曝光度,时间,敏感度,像素,各种平衡,如何设置?
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拍摄荧光照片时，最重要的是不能使用自动曝光，要用手动曝光，要注意画面中最亮的亮点不能有光晕，或者有颜色变黄的现象，这些都意味着曝光过度，颜色与强度都会失真的。在不得不使用自动曝光时，要把曝光调整(adjust expose)调到-4，就是降低两档曝光，也就是时间降低至正常的1/4。
如果用的是彩色CCD，还要想法把自动白平衡给关掉。否则颜色失真也会很大，会降低色饱合度 -- 最要命是的关掉白平衡后拍摄的画面似乎与镜下效果不同，颜色似乎更深一些，其实这是人眼的视觉误差。很多人更愿意把白平衡开着，如果是单色荧光样品，也就罢了，但在双染色的样品时，色饱合度高一点是绝对有好处的。
各种数码相机与CCD的操作都有所不同，具体的操作设置还得自己在说明书上找。把握住三条:一是正确曝光，二是处理好白平衡，三是一定要使用有效象素大小拍摄。一般的CCD有效象素也就一百万左右。拍摄成五六百万的格式时很可能还会更模糊。如果电脑硬盘够大，尽量保存TIFF格式图片。BMP太大，jpg格式会有颜色细节的损失，会影响光密度分析的准确性。
关于显微镜的操作可以写上一大堆帖子，只是不知在哪里贴它们比较合适。
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近来由于不能正确使用荧光显微镜,而导致无法拍出理想的结果.(偌大的实验报告竟没有一人能较好的使用它,也没有说明书).白白耗费不少时间.
希望你能继续给我们这些&镜肓&扫肓.说说如何正确用好荧光显微镜!若有电子版的说明书则更好,再谢!
顺再问三个问题:
1.做细胞免疫酶学拍照时(彩色CCD),如何把背景调成白色?再已是彩色的背景,能否再改成白色了吗?
2.以下是一张我刚合成的蓝绿荧光的重叠图像,感觉不理想,请再次指正.
3.截图软件如何才能减少像素丢失?(用hypersnap软件截图,一张图从3M,却变成了50KB?)
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这种做法简直就是掩耳盗铃, 只是让图像让外行看起来像共聚焦图像而已,其反而丢失了灰阶信息, 使图像缺乏层次,共聚焦的图像不仅仅是看起来亮而清晰,其实本质上在于其高对比高解析度, 像上面这种处理方法得出的图像只是相当于把反差增强了,信号和噪音一起增强,并没有使图像的可分辩信息增加.
正规的做法是对普通显微镜的图像进行逆卷积运算,才能得到接近共聚焦效果的图像. 透镜的成像过程就相当于对物体进行卷积运算得到物体的像,因此,理论上对像进行逆卷积运算就可以得到物体的原始信息.
逆卷积运算必须用专业图像处理软件才可以实现,比如ImageProPlus,MatLab,IDL等
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还有一个问题：两种颜色的叠加效果有时候共聚焦都很难区分：因为染料浓度不同，染料和被测物的结合效率不同，共聚焦上的激光能量不能保证完全相同——即使是同一种百分比！——所以用一般显微镜拍出来再进行叠加的照片不完全是cocolocalization，很可能是串色。
其次就是清晰度的问题了。
共聚焦的清晰度，一般显微镜很难相比的。
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photoshop is $$$
you can also do this with ImageJ (from
), a free software from NIH
1. &open& two/three gray images in ImageJ (or open RGB images, which are represent different channels, and convert to 8-bit by &Image -& Type -& 8bit&)
2. use &Process -& Enhance Contrast& to get maximal visual effect
3. use &Image -& Color -& RGB Merge& to get your figure ~~
btw, ImageJ also can do deconvolution, but you need use the scope to get the psm file商品数量：
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【讨论贴】关于共聚焦激光扫描显微镜的一切问题
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发现论坛里涉及共聚焦激光扫描显微镜的知识很少，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM) 是继电镜之后形态学上很先进的研究工具。它可以说是显微镜CT，可以进行光学切片，观察切面的多个层面，可以进行三维重建，又可以对靶蛋白等进行定量分析。这是其他的工具难以实现的。现在鉴于共聚焦激光扫描显微镜在科研中的应用也越来越多，在此发起有关共聚焦的话题。希望各位畅所欲言，有经验的请留下您的宝贵经验，比如共聚焦实验过程中需要注意哪些问题？共聚焦可以用来干些什么？有问题的也可以借这个平台在此发问。期待各位的热情参与查看完整版本请点击这里：
#甜# ( 15:04:02)
具体可应用于下列领域：
1.细胞生物学：细胞结构，细胞骨架，细胞膜结构、流动性、受体，细胞器结构和分布变化，细胞凋亡；
2.生物化学：酶、核酸、FISH（荧光原位杂交）、受体分析；
3.药理学：药物对细胞的作用及其动力学；
4.生理学：膜受体，离子通道，细胞内离子含量、分布、动态分析；
5.遗传学和胚胎学：细胞生长、分化、成熟变化，细胞组织的三维结构甚至再***的结构，染色体分析，基因表达，基因诊断；
6.神经生物学：神经细胞结构，神经递质的成分、运输和传递，递质受体，离子内外流，神经组织（如大脑皮质）结构、细胞分布；
7. 微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构（表面和内部结构）；
8.病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断，肿瘤诊断，自身免疫性疾病的诊断，HIV，宫颈上皮细胞涂片诊断；
9.生物学，免疫学，环境医学和营养学；
koook5695 ( 15:04:27)
想知道一下：
1 研究大分子构象的改变时，怎么做荧光探针标记？
2 分辨率能不能达到 0.1 nm 级别？
mimili_901 ( 15:04:48)
不知楼主在有没有用过共聚焦显微镜观察过转到植物组织中的GFP荧光，不知观察的条件和效果如何？能否看到保卫细胞，叶绿体细胞等结构，望指点一二，目前正在做细胞器的GFP荧光定位实验。
hustwb ( 15:05:13)
请问楼主，本人利用脂质体转染pSUPER-EGFP空载质粒到人CD4+T细胞系Jurkat细胞（悬浮），G418筛选后，PBS洗涤2次后上镜检测，发现荧光极弱，属于若有若无型的，但是同样质粒转染SGC7901荧光很强，请问该怎么处理
utt0989 ( 15:05:30)
楼主，提一个貌似跟共聚焦比较远的问题：如何用Image J软件分析共聚焦图片的荧光强度？或者其他软件也行。
gemei0115 ( 15:06:18)
共聚焦激光扫描显微镜主要是一个实验仪器使用问题，就是如何排出漂亮的图，如果分析这些数据。这些东西不动手操作几乎不能提出问题，而且仪器有厂家区别，因此操作也不尽相同。同时，仪器属于精密仪器，一般国内实验室有专人负责。看视野的和拍片子的不是同一人，因此很难真正自己去精益求精。这可能也是园内没什么人讨论这个问题的原因吧。
共聚焦激光扫描显微镜的应用确实可以很广泛，但原理的知晓对于具体应用其来进行实验研究并无太多帮助。就如果knockout小鼠，IPS的获得，原理大家都懂，但绝大多数人搞不出来一般，生物科学毕竟是门实验科学。因此建议大家提问实验操作中遇到的问题。
我遇到的问题是：
1.哪个公司的488二抗好用，在多处叠加扫描，或荧光信号较弱时不容易淬灭。
2.扫描时有些细胞核和所感兴趣的东西不在一个层面，如果使得叠加的图片更加漂亮。
wanglaoshi ( 15:06:54)
1.哪个公司的488二抗好用，在多处叠加扫描，或荧光信号较弱时不容易淬灭。
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当然，Dylight488也还不错
dog002 ( 15:07:15)
好吧，看到大家对confocal的热情。
传统我们都认为confocal是用来拍照的，就是成像研究方法，无论是你用染料，还是免疫荧光，还是质粒转染，都试图用confocal来拍照。好吧，那么你的confocol太省心了，这些顶多都是把它当作荧光显微镜或链接实时采集图像CCD的荧光显微镜。对于”共聚焦“，还没有好好利用。confocal相当于细胞CT，所以就看你怎么用了，其中根据它的光路和激光管的配置，可以做FRAp，Fret等，扫描可以线扫，3D 扫描构建，都是confocal轻松搞定的，而且是区别当今流行的活细胞系统或TIRFM的，所以要用好confocal，首先要了解confocal和你实验的目的和要求。当然前提你要有相关的染料或质粒。比如以往的染料，如flu3或flu5，confoal都只能提示半定量数据，而现在Fura2，就可以定量了。
另外，想提一点，有些实验者，先染色或转染，先上显微镜扫张图片，作为第一张，然后又拿回培养箱培养或加相关处理，然后又拿回显微镜，扫图片对比。这时候已经没有意义了，虽然你reuse你的上张图片参数，可是严格意义上，所有标本离开载物台就不能再和以前数据对比了，所以建议购买相关chamber，给药灌流细胞，当然你也可以自制这些。
mickeylin ( 15:07:36)
很高兴看到这个帖子。我近期准备做T细胞与树突状细胞共培养实验，请问楼主有没有相关的protocol，谢谢！
mickeylin ( 15:08:05)
补允一下，我准备用荧光抗体标记，共聚焦检测。
#甜# ( 15:08:37)
这是我从站里复制的前辈的资料，希望对大家有用
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请教Fure-2测钙是怎么回事？急！谢谢
请教细胞内ca2＋，camp和pkc的检测
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荧光显微镜下的多彩细胞世界----荧光染色探讨
求助：有关激光共聚焦象显微镜测量活细胞内钙火花测定
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求助：关于细胞内钙离子浓度的测量还有一问
请教一个激光共聚焦试验的问题！谢谢！
（请教）免疫荧光问题
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求助）荧光染色
（请教）用共聚焦观察免疫组化结果比一般光镜好狠多吗？
请问共聚焦显微镜的用途？
激光扫描共聚焦显微镜的基本原理和主要生物学应用
请教：fura-2 和钙在细胞中的荧光发射峰谁看到过？
免疫荧光组织化学技术
激光共聚焦扫描显微镜在生物学上的应用
Re:（请教）关于激光共聚焦荧光双标的几个问题
3N4G ( 15:09:16)
我打算用lscm测平滑肌细胞内钙离子浓度，定量，单纯比较两种平滑肌细胞的钙离子浓度差异有无统计学意义，看了一些文章觉得这个是不是有点大材小用了。
还有就是问一下专家，做出来的图片能不能对细胞内钙离子分布的区域差异做一分析那。
有谁做过类似的吗，可能提供一下步骤。
2541 ( 15:10:03)
想知道一下：
1 研究大分子构象的改变时，怎么做荧光探针标记？
2 分辨率能不能达到 0.1 nm 级别？
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光学显微镜分辨率受衍射极限限制，一般分辨率只有0.5-1微米。
即使近几年光学纳米显微成像技术的突破，也只能达到30-100纳米。
虽然有的报道能到达5纳米左右的分辨率，但许多限制条件不容易实现。
wood533 ( 15:11:03)
我想用荧光标记三个蛋白，共聚焦示踪，大家说能行得通吗？
yes4 ( 15:11:35)
我想用荧光标记三个蛋白，共聚焦示踪，大家说能行得通吗？
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当然可以，标记三个蛋白注意不要窜色就行。
fei1226com ( 15:12:06)
我打算用lscm测平滑肌细胞内钙离子浓度，定量，单纯比较两种平滑肌细胞的钙离子浓度差异有无统计学意义，看了一些文章觉得这个是不是有点大材小用了。
还有就是问一下专家，做出来的图片能不能对细胞内钙离子分布的区域差异做一分析那。
有谁做过类似的吗，可能提供一下步骤。
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您好，非常想请教您的问题：我的共聚焦显微镜对染料的要求有以下几种：fluo-3，fluo-3/fura red ,fluo-4,fluo-5N,fura red (ca -free).我也是想定量观察加药前后细胞内钙离子浓度的变化，不知道能不能选用Fura-2啊？请教您用的是哪个荧光染料啊？希望得到您的指点，非常非常感谢.
qumm1985 ( 15:12:31)
想请教一下：为什么很多文章上confocal拍出的照片都是整块的色彩图片，而我拍的都是散点组成的图片？
特别是细胞核的蓝色，我看别人都是整个的，很完整。我每次拍都是一堆的散点组合。
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