rna琼脂糖凝胶电泳泳操作应注意哪些环节

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-11-30 18:43 标签： dna琼脂糖凝胶电泳
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琼脂糖凝胶电泳_琼脂糖凝胶电泳原理_琼脂糖凝胶电泳步骤
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。
实验目的： 1．熟悉的操作特点。 2．掌握人类的基本原理。 3．熟悉人类基因组DNA提取的基本方法。 4．熟悉琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。 实验原理： 用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚﹑氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75%乙醇洗涤DNA沉淀，真空干燥后，溶
是分子实验的基础技术，电泳迁移速率主要受到一些因素影响DNA的分子大小、DNA分子的构象、琼脂糖浓度、嵌入染料的存在、电源电压、离子强度影响。
血清脂蛋白电泳主要涉及两个过程：一、血清脂蛋白的预染;二、预染的血清脂蛋白电泳分离。本文总结了血清脂蛋白琼脂糖凝胶电泳、试剂与器材以及操作步骤。
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糖凝胶电泳资讯血清蛋白琼脂糖凝胶电泳实验操作方法中国教育装备采购网点击(82)次我要分享
　　【试剂】
　　1、苏丹黑染色液
　　将苏丹黑B加到无水乙醇中至饱和，摇荡使乙酰化。用前过滤。上海创赛科技提供，苏丹黑B，GR ，商品编号：D16-G，价格431元。
　　2、巴比妥缓冲液
　　称取巴比妥钠15.4g、巴比妥2.76g及EDTA0.29g，加水溶解后再加蒸馏水至1000mL(pH为8.6，离子强度0.075)，为缓冲液。上海创赛科技提供巴比妥酸，Barbituric acid，99.5%,用于糠醛衍生物的比色分析及测定，67-52-7 ,商品编号：C16-B10490-25g，价格290元。
　　3、凝胶缓冲液
　　取三羟甲基氨基甲烷1.212g、EDTA0.29g及NaCl5.85g，用蒸馏水溶解后，稀释至1000mL，pH为8.6。上海创赛科技提供77-86-1,三羟甲基氨基甲烷,Tris&99%,级,商品编号：C84-g，价格65元。
　　4、琼脂糖凝胶
　　称取琼脂糖0.45 g溶于50 mL凝胶缓冲液中，再加水50 mL。在水浴中加热至沸，待琼脂糖完全溶解后，立即停止加热。
　　【操作】
　　1、预染血清
　　血清0.2mL中加苏丹黑染色液0.2mL，混合置37℃水浴中染色30分钟，离心(2000转/分)约5分钟。以除去悬浮于血清中染料沉渣。
　　2、制备琼脂糖凝胶板
　　将已配制好的0.5%琼脂糖凝胶于沸水浴中加热融化，用吸管吸取凝胶溶液浇注在载玻片上，约3 mL。静置半小时后凝固(天热时需延长，也可放入冰箱中数分钟以加速凝固)。
　　3、点样
　　将剪好的滤纸条对折，以折边在距凝胶一端2cm处切一点样口。将毛细管插入预染好的血清中，待吸入部分血清后，取毛细管使其有样品的一端靠于点样口端部，停靠3秒左右。
　　4、电泳
　　将凝胶板平放入电泳槽中，使加样端接在阴极一侧，用四层滤纸或纱布做成&引桥&，敷于胶板的两端，各搭住凝胶板约1cm左右，&引桥&的另一端浸于内的巴比妥缓冲液中。接通电源，首先调节电流为3-4mA/凝胶板，电泳10-15分钟;然后调节电流为6-7mA/凝胶板，电泳30-40分钟，即可观察到分离的区带。
　　5、保留电泳图谱
　　可将电泳后的凝胶板(连同载玻片)放入清水中浸泡脱盐2小时，然后放烘箱(80℃左右)中烘干即可。
　　【注意事项】
　　1、电泳样品应为新鲜的空腹血清。
　　2、加热溶化琼脂时，须防止水份蒸发过多。琼脂糖凝胶最好随用随制，以免凝胶表面干燥，影响分离效果。
　　3、制作凝胶板时琼脂糖浓度一般选用0.5%左右为宜，高于1%以上&-脂蛋白部分较紧密，&和前&-脂蛋白部分不够清晰;低于4.5%则凝固性较差，图谱不清。
　　4、点样口要大小适宜，边缘整齐、光滑，否则会影响电泳图谱。
　　5、在&-脂蛋白前若出现较浅区带，可列为前&-脂蛋白。
　　【正常参考范围】
　　&-脂蛋白　　　
　　&-脂蛋白　　　
　　前&-脂蛋白　　　0~28%
　　乳糜微粒　　　
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&&&&&&&&&&&&琼脂糖凝胶电泳注意事项
常见问题及注意事项
1.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶.
2.琼脂糖凝胶易于破碎,操作时要轻缓.
3.电泳时应注意电源线路,预防触电.
4.溴化乙淀具有致癌作用,配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套.并在专门的实验室内使用.
5.紫外线对人体有损伤作用,开灯时间不宜太长,注意防护.
6.DNA带形状模糊:DNA加样过多;电压太高;凝胶中有气泡.
7.质粒DNA的存在形式有3种,①共价闭环DNA(cccDNA),常以超螺旋形式存在;②开环DNA(ocDNA),此种质粒DNA的两条链中有一条发生一处或多处断裂,因此可以自由旋转从而消除张力,形成松弛的环状分子;③线状DNA,因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成.因此质粒DNA电泳的结果中有可能出现三条泳带,它们的泳动速度为:cccDNA
& 线状DNA & ocDNA.
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1,琼脂糖:不同厂家＼不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同,影响DNA的迁移及其荧光背景的强度,应有选择的使用.
2,凝胶的制备:凝胶中所加的缓冲液应该与电泳槽中的相一致,溶化的凝胶应该及时倒入板中,避免倒入之前凝固结块,倒入板中的凝胶应该避免出现气泡,以免影响电泳结果.
3,电泳缓冲液:为保持电泳所需的离子强度和PH,应经常更新电泳缓冲液.
4,样品加入量:一般情况下,0.5CM宽的梳子可加0.5微克的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片断的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清楚;反之,则应该适当减少加样量,但是上样量过多会造成加样孔超载,从而导致拖尾或扩散,对于较大的DNA此现象更明显.
5,DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品中应该使用同样的缓冲条件以消除这种影响.
6,DNA迁移率取决于琼脂糖的浓度,迁移分子的形状及其大小.采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度.小片断DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳,以提高分辨率.
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