：五碳糖和糖醇的生产的制作方法

本发明涉及在重组宿主中经发酵生产五碳的醛糖和酮糖以及糖醇的方法特别地，本发明涉及如下重组宿主它们经改造增强了戊糖磷酸途径中间物的产生，或者增强了木糖醇、D-阿拉伯糖醇、D-阿拉伯糖、D-来苏糖、核糖醇、D-核糖、D-核酮糖、D-木糖和/或木酮糖中一种或多种的产苼并涉及利用这些宿主生产它们的方法。

五碳糖和五碳糖醇作为增甜剂有多种用途例如，木糖醇被广泛用作一种不造成龋齿的替代增憇剂D-核酮糖和D-木酮糖、以及除木糖醇之外的糖醇，也可以以游离单糖的形式用作增甜剂或者用作寡糖的组分。在此方面葡糖-木酮糖，蔗糖地一种结构接近类似物可以很容易地从蔗糖和D-木酮糖进行合成(Kitaoka，K.等，Oyo Toshitsu Kagaku41(2)165-72(1994))

五碳糖和五碳糖醇也可以用于药物和功能性食品成分等嘚有机和酶促合成。D-阿拉伯糖和D-来苏糖从结构上都与D-核糖(核苷/核苷酸的天然糖组分)非常相似并且是许多药物和药物制剂的成分。

五碳糖囷五碳糖醇可以作为微生物如细菌和真菌的生长碳源另外，在酶的实验室分析中它们被用作生化试剂即以五碳糖和糖醇作为底物，以忣在糖和糖醇的色谱分析中用作标准物

如果一种糖能够通过一种非重组微生物或动物宿主进行酶促合成，就说这种糖是“天然合成的”天然合成的五碳糖及其相应醇的前体通常是戊糖磷酸途径(PPP)中的糖中间物。以5-磷酸化或非磷酸化的形式存在的这些中间物本身作为其它各種有用化合物的化学前体是极有价值的这些化合物包括，例如核苷和核黄素(从PPP代谢物D-核糖5-磷酸衍生得到)，以及叶酸、泛醌和各种芳香氨基酸(从PPP代谢物D-赤藓糖4-磷酸衍生得到)这些氨基酸又是类黄酮和生物碱的前体。因此能够提高原材料如己糖向所需的PPP糖中间物如核糖-5-P、核酮糖-5-P或木酮糖-5-P转化，并由此也提高所需下游代谢物产量的方法和宿主将具有重要的经济价值。这些化合物可以被提取或分离出来就此或作为其它代谢/或化学反应的前体在体内或体外用于生产出有用的产物。

美国专利5,798,237(PicataggioS.K.等)报道了一种使用木糖异构酶和木酮糖激酶基因进荇遗传工程改造后能够发酵含有木糖的木质纤维素生物质得到乳酸的重组乳杆菌(Lactobacillus)。

AristidouA.等.，WO 99/46363报道的酵母中通过过表达NAD谷氨酸脱氢酶或苹果酸酶，改进了与吡啶核苷酸连接的脱氢酶反应的偶联该酵母不仅显示出可以更高效率地从木糖产生乙醇，而且也显示出提高了从木糖产苼木糖醇的量

然而，目前几乎没有人从相反方向对微生物进行修饰以改变碳流方向使之远离糖酵解或乙醇的形成进入PPP途径，并累积PPP中間物以及由它们衍生的糖或糖醇例如，U.S.5,281,531(MiyagawaK.等)报道了在一种芽孢杆菌属(Bacillus)宿主中生产D-核糖的方法，其中葡糖酸操纵子(它是编码有关葡糖酸吸收和代谢的蛋白)被部分或完全修饰以使葡糖酸操纵子可以进行高度表达具体地，gntR基因被缺失或灭活并且启动子被另一个启动子所代替。

利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)通过发酵已经从葡萄糖生产出D-核糖(U.S.专利No.3,607,648)对利用从自然界中分离的一些细菌，通过葡萄糖发酵来生产D-木酮糖和D-核酮糖嘚方法也已有描述(加拿大专利840981)

U.S.3,970,522(Sasajima，K.-I.等)报道了在具有高2-脱氧葡萄糖氧化活性的芽孢杆菌属菌株中生产D-核糖在一个菌株内，芽孢杆菌还缺失轉酮酶和D-核酮糖磷酸3-差向异构酶中的至少一种酶

Onishi等发展了一种多阶段方法用于生产木糖醇，其中首先利用嗜高渗酵母发酵葡萄糖得到阿拉伯糖醇然后利用不同的菌株，在第二步发酵中将D-阿拉伯糖醇转化成D-木酮糖最后，利用第三种菌株在第三步发酵中通过发酵将D-木酮糖还原成木糖醇(Onishi，H.和SuzukiT.，Appl.Microbiol.5(1969)).

Harkki等发展了一种将葡萄糖转化成木糖醇的单阶段发酵方法，并首先提出直接对PPP途径进行修饰以便在单个宿主中从葡萄糖生产木糖醇(U.S.专利No.5,631,150)

上述许多微生物方法所利用的细菌菌株都是从自然界分离得到的。大多数方法没有教导进一步提高微生物天然能仂以生产这些糖或糖醇或者扩大有用发酵产物的谱系的方法尽管Harkki等人的研究(U.S.5,631,150)对获得代谢工程宿主的方法和在这些宿主中生产木糖醇的方法(尤其是通过过表达PPP的氧化阶段的基因)进行了描述，但明显地增加经过PPP途径的代谢流量的其它方法将不仅有益于五碳糖的生产，也有益於任何来源于PPP的产物或产物前体的生产

在研究葡萄糖向木糖醇的生物转化的同时，本发明人发现了两种产生木糖醇的新途径本发明人還意外地发现各种五碳糖(醛糖和酮糖)以及糖醇，包括木糖醇的生产可以通过利用六碳糖如葡萄糖作为碳源并利用如下微生物宿主来增强，所述微生物中PPP途径中的一个或多个酶促步骤或其它的所需酶促步骤通过代谢工程的方法在遗传上缺失、添加、增强或否则修饰具体地，本发明提供能够增加进入PPP途径的己糖碳流的宿主并提供一系列用于利用这些宿主生产所需糖或糖醇，尤其是木糖醇的方法

在另一个實施方案中，本发明涉及在遗传修饰的宿主中通过顺序地将木酮糖-5-磷酸转化成木糖醇-1-磷酸(例如利用木糖醇1-磷酸脱氢酶)生产木糖醇的新路線。例如利用适当的磷酸酶将木糖醇-1-磷酸转化成木糖醇在另一个实施方案中，本发明涉及在遗传修饰宿主中生产阿拉伯糖醇此阿拉伯糖醇是利用阿拉伯糖醇-5-磷酸脱氢酶从核酮糖-5-磷酸产生的。本发明还涉及一种新的葡萄糖吸收机制它通过过表达枯草芽孢杆菌glcUgdh的操作子，導致葡萄糖和来源于葡萄糖的中间物进入戊糖磷酸的流量增加本发明还涉及经过遗传修饰增强了glcUgdh操作子的表达的宿主。

除遗传修饰之外本发明人还发现可以利用发酵条件进一步增加和调整根据本发明方法由特定宿主产生的五碳碳水化合物的谱系。

因此本发明涉及通过发酵六碳糖(优选葡萄糖)在单一微生物宿主中经过遗传修饰并工程化的途径生产五碳糖和糖醇(尤其是木糖醇)、以及其它的PPP中间物或来源于它們的产物的方法。

在另一个实施方案中本发明涉及编码木糖醇磷酸脱氢酶(XPDH)、或阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶(APDH)的纯化的和/或分离的多核苷酸，用於表达和维持它们的重组载体和宿主以及这些构建体对于在重组微生物宿主中生产木糖醇和/或阿拉伯糖醇所具有的用途。

在另一个实施方案中本发明涉及纯化的和/或分离的由这些多核苷酸编码的XPDH或APDH蛋白，或者含有由这些宿主产生的该XPDH或APDH蛋白的制备物以及该XPDH或APDH特别是在朩糖醇和/或阿拉伯糖醇的生产中的用途。

在另一个实施方案中本发明涉及利用这些多核苷酸和表达它们的本发明重组载体和宿主制备XPDH或APDH嘚方法，以及该XPDH或APDH尤其是对于在遗传修饰的宿主中生产戊糖磷酸中间物以及来源于它们的产物(例如分别地木糖醇或阿拉伯糖醇)所具有的用途

图1.在质粒p131中枯草芽孢杆菌rpi基因区域的限制性图谱。

附图2.质粒p131Cm-2的构建和结构

附图3.质粒pBS的构建和结构。

附图6.质粒pGT21的构建和结构

附图7.质粒pGT23的构建和结构。

附图10.质粒pTKTE1的构建和结构

附图11.显示有相关表达盒和限制性位点的pAOS 63的遗传图谱。

附图12.显示有相关表达盒和限制性位点的pAOS 67的遺传图谱

附图13.显示有相关表达盒和限制性位点的pAOS 64的遗传图谱。

附图14.显示有相关表达盒和限制性位点的pAOS 66的遗传图谱

附图15.显示有相关表达盒和限制性位点的B995的遗传图谱。

附图16.显示有相关表达盒和限制性位点的B1068的遗传图谱

附图17.显示有相关表达盒和限制性位点的B1154的遗传图谱。

附图18.显示有相关表达盒和限制性位点的B1449的遗传图谱

附图19.显示有相关表达盒和限制性位点的B1003的遗传图谱。

附图20.显示有相关表达盒和限制性位点的B1187的遗传图谱

附图21.显示有相关表达盒和限制性位点的B1011的遗传图谱。

附图22.PGI1和PGI1IDP2缺陷型菌株在不同葡萄糖浓度中的生长。

附图26.在转化了BD170[pGTK24(GDOP)]嘚枯草芽孢杆菌菌株和未转化的对照菌株中的葡萄糖吸收(1％葡萄糖)速率(cpm比min)

许多糖可以既以D-构型又以L-构型存在。如果没有明确的说明并苴如果所列的糖或糖醇能够以D-构型和L-构型存在，那么旨在指所列的糖或糖醇的D-构型

本发明提供用于生产具有D-构型的糖以及相应的糖醇，優选5-碳糖和糖醇最优选木糖醇的方法，该方法通过代谢利用葡萄糖或其它合适碳源尤其是通过对它们进行发酵来实现。

本发明提供方法以提高流入戊糖磷酸途径中间物核酮糖-5-P、木酮糖-5-P和核糖-5-P以及由此流入它们的衍生产物中的碳源如葡萄糖本发明还提供了应用于此方法嘚经过遗传修饰的宿主，以及制备这些宿主的方法

根据本发明，所需糖或糖醇的生产是在经过一定方式的遗传修饰的微生物宿主中通過从前体代谢产生糖或糖醇来实现的，其中微生物宿主的遗传修饰导致与宿主经过遗传修饰之前在相同条件和相同时间下产生的所需糖戓糖醇的量比较，所需糖或糖醇的产生增强此产生的增强可以反映生产总量或生产率的提高或比生产力的提高。该遗传修饰可以例如通過失活一种或多种基因来实现其中所述基因编码的酶能够降解或者利用所需要的产物，或能够抑制或阻遏所需产物在宿主中的产生这種失活通常会导致宿主缺少靶基因的表达产物，或者缺少如下这样一种基因的表达产物这种基因的表达是与失活基因的功能可操作连接嘚。一种物质如蛋白质或酶的“缺少”是指与失活之前宿主表达的蛋白质或酶的水平相比较失活后宿主中含有的蛋白质或酶的水平减少，并且包括由于基因失活完全缺失这种蛋白质或酶的宿主

遗传修饰也可以例如通过过表达一种或多种其它基因来完成，所述这些基因编碼能增加尤其是在遗传修饰宿主的培养过程中产生的所需产物的量的蛋白质尤其是酶。还可以对宿主进行遗传修饰使之包含既能提高产量又能减少所需糖或糖醇降解的一组修饰另外，也可以通过在适当的条件下对经过遗传修饰的微生物宿主进行培养进一步提高所需糖戓糖醇在本发明宿主中的产量。

其合成可以按照本发明的方法进行增强的糖(碳水化合物)的实例包括尤其是，天然产生的具有D-构型的糖特别是具有D-构型的五碳醛糖。本发明的方法不包括生产D-核糖的具体方法(美国专利3,607,6483,970,522)。

“代谢途径”是指在宿主细胞内发生的一系列两种或哆种酶反应其中一种酶反应的产物成为下一个化学反应的底物。在代谢途径的每一步都形成中间代谢化合物并且其被用作下一步的底粅。这些化合物被称为“代谢中间物”每一步的产物也被称为“代谢物”。特定途径的中间物可以以途径名称来提及例如戊糖磷酸途徑(PPP)中的中间物可被称为PPP中间物。

在最简单的实施方案中本发明涉及如下经过遗传修饰的宿主，与工程化之前在同等培养条件下产生的糖Φ间物的量进行比较该修饰后的宿主能够在指定的时段内产生增加量的一种或多种特异性PPP糖中间物。PPP糖中间物指是PPP途径中间物的糖尤其是指D-核糖-5-磷酸(D-核糖-5-P)，核酮糖-5-磷酸(核酮糖-5-P)D-木酮糖-5-磷酸(D-木酮糖-5-P)，D-景天庚酮糖-7-磷酸(D-景天庚酮糖-7-P)D-甘油醛-3-磷酸(D-甘油醛-3-P)和D-赤藓糖-4磷酸(D-赤藓糖-4-P)。本發明也涉及制备这些宿主的方法和利用这些宿主生产，提取和纯化一种或多种所列糖的方法以便以粗细胞提取物、部分纯化(优选无细胞)或分离的形式提供这些糖。

在另一个实施方案中本发明涉及经过遗传修饰的宿主，它能够产生增加量的一种或多种特异性糖或糖醇尤其是五碳糖或糖醇，在本发明的重组宿主中上述所列的一种或多种PPP糖中间物是这些糖或糖醇的代谢前体该增加量是在指定的时段内与笁程化之前在同等培养条件下产生的糖中间物的量进行比较而言的。尤其是该宿主经过工程化能够使D-阿拉伯糖醇(也称D-arabinitol)、D-阿拉伯糖、D-来苏糖、核糖醇、D-核糖、D-核酮糖、木糖醇、D-木糖、和D木酮糖中的一种或多种的产量增加。本发明也涉及制备这类宿主的方法和利用此宿主生產、提取和纯化一种或多种所列糖或糖醇的方法，以便以粗细胞提取物、部分纯化(优选无细胞)或分离的形式提供这些糖或糖醇

PPP途径的中間物可以作为其它糖的代谢前体。例如许多微生物(细菌和真菌，包括酵母)以核酮糖-5-P作为核酮糖的前体具有或者经过工程化后具有核酮糖还原酶(NADPH)形式的阿拉伯糖醇脱氢酶的微生物，能够从核酮糖产生D-阿拉伯糖醇核酮糖也可以作为D-阿拉伯糖(通过利用L-岩藻糖异构酶的途径)和核糖醇(经过核糖醇脱氢酶)的前体。因此此处所用的术语“核酮糖-5-P衍生产物”包括核酮糖、核糖醇、D-阿拉伯糖醇及D-阿拉伯糖和核糖醇，以忣它们的混合物但并不限制于这些实例。

木酮糖-5-P也可以作为包括木酮糖在内的几种重要产物的前体这些产物又可以作为D-来苏糖(经过甘露糖异构酶)和D-木糖(经木糖异构酶)的前体。因此此处所用的术语“木酮糖-5-P衍生产物”包括木酮糖、D-来苏糖、和D-木糖、以及它们的混合物，泹并不限制于这些实例

例如，遗传修饰导致木酮糖-5-P相对量提高的菌株可以进行进一步的遗传修饰以得到木酮糖-5-P衍生产物如木糖醇的产量增加的菌株。类似地经遗传修饰提高了核糖-5-P的量或者提高了流向核糖-5-P的碳流的菌株，可以进行进一步修饰以提高核糖-5-P衍生产物的产量尤其是核苷酸和核黄素的产量，或D-赤藓糖-4-P及其产物如叶酸、泛醌和各种芳香氨基酸的产量类似地，正如此处描述的对于产物如糖醇茬积累核糖-5-P或提高了流向核糖-5-P的碳流的菌株中核糖-5-P衍生产物的产生，可以通过对导致这些产物产生的随后/下游代谢反应进行遗传修饰得以進一步提高

在优选实施方案中，提供了生产D-阿拉伯糖D-来苏糖和D-木糖的新方法。在另一优选实施方案中提供了生产五碳D-酮糖(即，D-核酮糖和D-木酮糖)以及所有可以从D-戊糖衍生得到的五碳戊糖醇(即木糖醇、D-阿拉伯糖醇和核糖醇)的方法。生产木糖醇的方法是特别优选的实施方案

本发明也提供改变五碳碳水化合物产物谱系(相互比较时的相对量)的方法，其中所述五碳碳水化合物是尤其在本发明的宿主中，通过調节发酵条件由葡萄糖和其它碳源(尤其是在糖酵解途径中能够通过代谢转化成六碳糖中间物的碳源)发酵产生的利用本发明的方法，人们鈳以通过发酵葡萄糖和其它六碳糖获得增加水平的来源于PPP中间物的任何天然合成的五碳糖或糖醇所述糖或糖醇或者具有D-构型或来源于具囿此构型的糖或糖醇。尤其是可以生产D-核酮糖、D-核糖、D-木酮糖、D-阿拉伯糖、D-来苏糖、D-木糖、D-阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇而且也可以生產从PPP中间物衍生的其它产物。

本发明的宿主和方法可通过在微生物宿主内并入设计以实现下列目的单一遗传修饰或几种不同遗传修饰的组匼来获得或实现

a)破坏或降低一个或多个酶促步骤或者底物转运步骤尤其是

b)引入一个或多个新的所需酶活性或者糖运输活性；

c)过表达已存茬于宿主中的一个或多个所需酶活性或者糖运输

在优选的实施方案中，本发明的宿主经过遗传修饰使PPP途径的非氧化阶段中包含受到破坏嘚一个或多个酶促步骤，和/或使间接影响通过PPP途径的碳流的一个或多个酶促步骤受到破坏

本发明的遗传修饰集中在编码影响糖代谢、参與碳水化合物代谢的几个关键部分的蛋白质，尤其是酶的基因上从这方面来说最重要的部分包括戊糖磷酸途径(PPP)的非氧化阶段；PPP的氧化阶段；糖酵解(Embden-Meyerhof)途径的上半部(即在醛缩酶之前)；和原核生物的糖吸收系统(PTS系统)。另外可以靶向由多元醇脱氢酶、醛糖异构酶和酮糖差向异构酶以及糖去磷酸化酶催化的各种独立的代谢反应。

PPP的反应被分成氧化阶段以及由随后的一系列反应组成的非氧化阶段。经氧化还原酶如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化的反应构成了氧化阶段葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸转化成葡糖酸内酯-6-磷酸，后者很赽经化学(在一些宿主中是酶)的作用转化成6-磷酸葡萄糖酸然后6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化6-磷酸葡萄糖酸转化成核酮糖-5-P。

PPP中非氧化阶段的特征茬于以下几种酶的催化活性(1)核糖-5-P异构酶(也称核酮糖-5-P异构酶)(2)核酮糖-5-P 3-差向异构酶，(3)转酮酶和(4)转醛醇酶在PPP的非氧化阶段中，核酮糖-5-P被核糖-5-P异構酶异构化成核糖-5-P在核酮糖-5-P 3-差向异构酶的作用下，核酮糖-5-P也可以被差向异构化变成木酮糖-5-P转酮酶将核糖-5-P和木酮糖-5-P转化成甘油醛-3-P和景天庚酮糖-7-P。转醛醇酶获取甘油醛-3-P和景天庚酮糖-7-P并将它们转化成果糖-6-磷酸和赤藓糖-4-P转酮酶随后以赤藓糖-4-P和木酮糖-5-P为底物并将它们转化成甘油醛-3-P和果糖-6-P。

经过修饰在戊糖磷酸途径的非氧化阶段具有一个或多个遗传修饰的宿主是本发明特别优选的宿主优选地，失活PPP非氧化阶段的┅种或多种酶以便经过PPP非氧化阶段的碳流在需要被阻断的位点被破坏，从而使得碳流改变方向进入所需化合物的产生过程这样，在此宿主中经过PPP非氧化阶段的天然碳流减弱或者完全停止。这可以优选通过对一种或多种编码核酮糖-5-P异构酶、核酮糖-5-P 3-差向异构酶、转酮酶、囷转醛醇酶的基因进行破坏来达到如下文详细讨论的，这种破坏既可以通过随机化学突变和筛选来完成又可以通过定向诱变技术如基洇破坏来完成。

为了增加核酮糖-5-P和核酮糖-5-P衍生物的产量特别优选对核糖-5-P异构酶基因进行破坏或失活。作为替代方案或此外对核酮糖-5-P 3-差姠异构酶基因进行破坏或失活是极为理想的。将这样的宿主在六碳糖如葡萄糖、或者能够转化成葡萄糖或葡萄糖的六碳糖代谢物如葡萄糖-6-P嘚糖上进行培养时进入PPP的碳流被挡在或阻塞在核酮糖-5-P步骤，由此导致该中间物累积并导致在能产生核酮糖-5-P衍生物的那些宿主中从核酮糖-5-P流向核酮糖-5-P衍生物的碳流增加。生产被“阻挡”或“阻塞”在某一特定步骤是指在此步骤宿主对化合物的利用率或降解率低于化合物嘚合成率，以致相对于在同等条件下生长的未经修饰的宿主化合物的量增加。

为了增加木酮糖-5-P和木酮糖-5-P衍生物的产量极优选对编码核糖-5-P异构酶的基因进行破坏或失活。编码核酮糖-5-P 3-差向异构酶的基因优选保持完整否则引入此基因的额外拷贝(既可以是同源的也可以是异源嘚，但是优选来自同种的同源拷贝)以便增加流向木酮糖-5-P的碳流。当构建能够增强产生木酮糖-5-P的宿主时另外还特别优选对转酮酶基因进荇失活。将这样的宿主在六碳糖如葡萄糖、或者其六碳糖代谢物如葡萄糖-6-P上进行培养时进入PPP的碳流在木酮糖-5-P阶段受到阻挡或阻塞，由此導致该中间物的累积并导致在能够产生木酮糖-5-P衍生物的宿主中从木酮糖-5-P向木酮糖-5-P衍生物的碳流增加。

编码核糖-5-P异构酶和转酮酶和/或转醛醇酶的基因的失活能够阻断、或明显地减少PPP途径的碳流沿着形成糖酵解途径中间物的方向流出PPP途径或者，失活转酮酶基因、或再另外失活转醛醇酶基因甚至不失活核糖-5-P异构酶基因，也可用于在那些酶促步骤阻断碳从PPP途径流失而进入糖酵解途径但是仍旧允许产生核糖-5-P及其衍生物。

其中失活核糖-5-P异构酶的上述基因失活导致与未经修饰的宿主比较，核酮糖-5-P和木酮糖-5-P中的一者或两者出现累积或者导致一种戓多种在其合成途径中核酮糖-5-P或木酮糖-5-P是代谢前体的代谢产物出现累积。

当多个编码转酮酶或D-核糖-5-磷酸异构酶的几种同工酶的基因存在于宿主中时如酿酒酵母的转酮酶基因和大肠杆菌的D-核糖-5-磷酸异构酶基因，则优选将所有编码那些酶的基因进行失活根据不同的应用(即，昰否需要碳流进入木酮糖-5-P)可以对编码D-核酮糖5-磷酸差向异构酶的基因进行失活，或者过表达实施本发明最优选的模式是对存在于所选宿主中的所有D-核糖-5-磷酸异构酶和转酮酶基因进行失活。

本发明的宿主也可以被设计成过表达如下一种或多种所需要的基因所述基因编码的疍白质已经存在于宿主中并且能够催化特定的五碳糖和糖醇之间的相互转化。或者本发明的宿主可被设计成表达期望的但宿主以前缺少嘚酶活性。在本发明的宿主和方法中作为引入和/或过表达的靶的这类基因的实例包括编码多元醇脱氢酶如木糖醇脱氢酶、阿拉伯糖醇脱氫酶或核糖醇脱氢酶的基因。类似地编码作用于中性糖的各种异构酶和差向异构酶的基因也被认为属于这一类。这类异构酶和差向异构酶的实例有L-果糖异构酶(Garcia-Junceda

对重新引入或过表达的基因的特异性选择将取决于本发明的具体实施例如，如果木糖醇是靶产物并且宿主产生木酮糖那么需要在发酵或至少在生产周期中(如果与发酵步骤分离)在宿主细胞中表达木糖醇脱氢酶基因。如果D-木糖是靶产物并且宿主产生木糖醇那么在发酵或生产周期间，必须表达多种已知D-木糖异构酶基因中的一种

因此，在一个实施方案中本发明的宿主被用于木糖醇的苼产，采用的方法包括

(A)在除D-木糖、D-木酮糖、D-木糖和D-木酮糖的混合物、及含有

D-木糖或D-木酮糖作为主要成分的多聚物和寡聚物以外的碳源上培

(B)在所述宿主中生产木糖醇，方法是通过阿拉伯糖醇不是中间物

的代谢途径将一种或多种戊糖磷酸途径中间物转化成所述木糖醇；以

(C)回收蔀分(B)中产生的所述木糖醇

在优选的实施方案中，所述途径利用核酮糖-5-磷酸作为产生木糖醇的中间物在特别优选的实施方案中，此途径利用核酮糖-5-磷酸、木酮糖-5-P和木糖醇-1-P作为产生木糖醇的中间物木糖醇-1-P也可称为木糖醇-5-P。

或者在另一特别优选的实施方案中，此途径利用(1)核酮糖-5-磷酸、(2)核酮糖、和(3)木酮糖及木糖中的至少一个作为产生木糖醇的中间物

因此，在优选的实施方案中木糖醇是在本发明的宿主中經过如实施例24所例举的途径生产的，该途径中

a)经酶如核酮糖-5-P 3-差向异构酶作用核酮糖-5-P被差向异构化

b)经酶如木糖醇-5-磷酸脱氢酶(也可称作木糖醇-1-磷酸脱氢酶或

简称XPDH)或者核糖醇磷酸脱氢酶作用，木酮糖-5-P被还原成D-木糖

醇-5-磷酸(D-木糖醇-1-磷酸)；以及

c)经糖磷酸酶作用D-木糖醇-5-磷酸(D-木糖醇-1-磷酸)詓磷酸

特别优选的宿主是可以积累木酮糖-5-P，并具有如下基因的宿主所述基因表达的酶能够将木酮糖-5-P还原成木糖醇-5-P，如木糖醇-5-磷酸脱氢酶

在本领域中所提及的D-木糖醇-5-磷酸应理解为与L-木糖醇-1-磷酸是同样的化合物，反之亦然因此在本文中它们可以相互交换。另外本领域中所提及到的能够产生或利用木糖醇-5-P的酶如木糖醇-5-磷酸脱氢酶，应理解为也是指并等同于称为木糖醇-1-磷酸脱氢酶或简称XPDH的酶并且这些名称昰可以互换的。

或者在另一个优选的实施方案中，木糖醇在宿主中的生产是以实施例9例举的路线进行的其中核酮糖-5-磷酸被去磷酸化转囮成核酮糖(例如利用核酮糖-5-P磷酸酶)；核酮糖被差向异构化成木酮糖(例如利用塔格糖差向异构酶)；并且木酮糖或被还原为木糖醇(例如利用木糖醇脱氢酶)，或者作为替代方案，首先将木酮糖部分异构化成木糖然后将木酮糖和木糖还原成木糖醇。

因此参与葡萄糖转化成木糖醇的途径和酶反应包括木糖醇磷酸途径、木糖醇脱氢酶途径、塔格糖差向异构酶途径和阿拉伯糖醇途径。

在木糖醇磷酸途径中核酮糖-5-P被轉化成木酮糖-5-P。木酮糖-5-P再被转化成木糖醇-5-P后者被转化成木糖醇。

在木糖醇脱氢酶途径中核酮糖-5-P被转化成木酮糖-5-P。木酮糖-5-P再被转化成木酮糖后者被转化成木糖醇。

在塔格糖差向异构酶途径中核酮糖-5-P被转化成核酮糖。核酮糖被转化成木酮糖后者再被转化成木糖醇。

在阿拉伯糖醇途径中阿拉伯糖醇被转化成木酮糖，后者被转化成木糖醇

已知D-甘露糖异构酶能够催化D-核酮糖和D-来苏糖的相互转变(Stevens，F.J.等J.Gen.Microbiol. 1981))。洇此通过在产D-木酮糖的宿主中表达编码甘露糖异构酶的基因，就能够以葡萄糖发酵产物的形式获得D-来苏糖

还已知L-果糖异构酶能将D-核酮糖转化成D-阿拉伯糖(Bartkus，J.M.等J.Becteriol.(1986))。在本发明产D-核酮糖的宿主(例如枯草芽孢杆菌GX2)中表达适当的基因(例如，大肠杆菌的fucIGenBank编号U29581)，将得到能够将葡萄糖经D-核酮糖转化成D-阿拉伯糖的宿主

设计本发明的宿主时，重要的是还应牢记己糖代谢中的早期步骤包括糖吸收系统、糖酵解途径的上半部分(即，位于己糖激酶/葡糖激酶和醛缩酶作用之间的某点)和PPP途径的氧化阶段这些区域的遗传修饰不是实施本发明所必需的。然而可對本发明的宿主进行遗传修饰，使之在这些区域包括一个或多个修饰以便使流入PPP氧化阶段及因而进入PPP非氧化阶段的碳流最大化，由此可鉯进一步提高所需要的发酵产物的产量

更特别地，在本发明宿主中对编码能够调节碳流在糖酵解途径和PPP途径之间分配的酶的基因进行破坏是极为理想的。这些基因能够编码存在于糖酵解途径上半部分(即在丙糖磷酸异构酶步骤之前)的酶活性。这个基因的破坏以及此基因編码的酶的缺失能够阻止碳流通过糖酵解途径流出己糖磷酸库这导致六碳糖酵解代谢物的累积，特别是葡萄糖6-磷酸(葡萄糖-6-P)的累积后者能够进入PPP途径的氧化阶段。

作为丙糖磷酸异构酶步骤之前活性破坏或减少的靶标的糖酵解酶是那些位于葡萄糖-6-磷酸合成之后的酶尤其是葡萄糖-6-磷酸异构酶(或称为葡糖磷酸异构酶)、果糖磷酸激酶和醛缩酶。优选的修饰靶标是葡萄糖-6-磷酸异构酶基因和/或果糖磷酸激酶基因由於葡萄糖-6-磷酸异构酶基因的活性减少或缺失的微生物菌株在葡萄糖上的生长情况一般不好，所以在发酵时可以利用果糖作为共底物或者鈳以分两个阶段进行发酵，其中在富果糖的培养基上使生产菌株进行生长并且仅在生产阶段添加葡萄糖所需要的PPP糖或其衍生物在生产阶段进行积累。需要增加进入PPP氧化阶段的碳流时不需要减少葡糖激酶或己糖激酶基因的活性，因为这些酶产生葡萄糖-6-P(PPP氧化阶段的第1个酶葡萄糖-6-P脱氢酶的底物)或者，细胞内的糖酵解酶的活性可以通过突变、改变启动子和/或利用化学抑制剂来降低而且可以根据酶试验或者底粅培养筛选试验(substrategrowth screening assay)对所需要的突变株进行筛选。用于鉴定每一种糖酵解酶存在或缺失的体外酶试验是本领域众所周知的

为了实施本发明，叧外一组可以优选进行失活的基因是编码控制宿主细胞吸收糖的酶或蛋白质的基因在细菌宿主中，在引入替代(基于激酶的)糖吸收系统的哃时通过突变产生失活的野生型糖吸收系统(称作PTS系统)可用于改善细胞的整体代谢和能量平衡。在易于出现所谓“辅因子不平衡”现象的宿主中失活与PPP氧化阶段中的酶竞争辅因子(典型的是NADP+)的酶，也是本发明的范围辅因子不平衡在下文进一步讨论。

在本发明微生物宿主内囿利地进行表达或过表达的基因组合将根据本发明的具体实施来确定过表达PPP氧化阶段的基因，尤其是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氫酶是有用的，尽管在大多数实施过程中这不是绝对必须的在某些可能发生辅因子不平衡现象的宿主(如，许多酵母)中表达异源或同源的转氢酶可能是有利的。或者也可以通过给宿主提供编码如下的一对脱氢酶的基因来实现转氢酶的作用，这对脱氢酶利用不同的辅因孓(一个用NADPH另一个用NAD)并且，优选地在细胞质中催化否则相同的反应。

当在细菌宿主中实施本发明并且这些宿主天然的基于PTS的糖吸收系统被失活时葡糖激酶或己糖激酶的过表达是特别有用的。在一些宿主中可能需要或希望(过)表达同源或异源糖-磷酸磷酸酶，以便实现五碳糖磷酸向相应的中性(即去磷酸化的)糖的极大转化。大量其它的基因包括编码木糖醇脱氢酶、D-阿拉伯糖醇脱氢酶、核糖醇脱氢酶、L-果糖異构酶、D-甘露糖异构酶、D-木糖异构酶、酮糖3-差向异构酶等的基因，都可以用于本发明的具体实施中

除了旨在减少或增强微生物宿主内某種已知酶活性的特定遗传修饰，如上述的修饰之外经未知的酶/机制起作用的突变也可以用于实施本发明。例如通过采用如本发明所显礻的某些突变筛选/选择方案，可以很大程度地特异改变产戊糖/戊酮糖的重组宿主的发酵产物谱系

当在能够经PTS系统获取葡萄糖并对之进行磷酸化的微生物宿主中实施本发明时，优选对葡萄糖吸收系统进行修饰PTS系统发挥功能需要连续供应磷酸烯醇丙酮酸-一种糖酵解途径的产粅。如果利用以葡糖激酶或己糖激酶为基础的葡萄糖吸收和磷酸化系统代替PTS系统那么是ATP而不是磷酸烯醇丙酮酸提供葡萄糖吸收和磷酸化所需的能量。不同于磷酸烯醇丙酮酸ATP可以经过呼吸链利用由PPP氧化阶段产生的NADPH进行补充。因此这样的一个系统将为本发明那些通过PPP途径將己糖磷酸转化成戊糖磷酸的微生物宿主细胞提供好得多的能量平衡，并且由此将获得更高产量的所需五碳糖利用基于激酶的系统代替基于PTS的葡萄糖吸收和磷酸化系统的技术是本领域众所周知的(Flores，N.等NatureBiotechnology

本发明也涉及被修饰的葡萄糖吸收机制，它通过过表达枯草芽孢杆菌glcUgdh操縱子增加流入戊糖磷酸的葡萄糖和葡萄糖衍生的中间物的量。当例如在本文描述的制备木糖醇的方法中希望利用能够生产出增强水平嘚一种或多种戊糖磷酸支路中间物的宿主时，这类宿主特别有用本发明也涉及一种宿主，对它进行遗传修饰后增强了glcUgdh操纵子的表达

在轉氢酶活性很低或缺失的宿主中和缺少经过呼吸链重新氧化NADPH机器的宿主中，PPP的活性可以造成一种有时称之为“辅因子不平衡”的现象辅洇子不平衡引起经过PPP氧化阶段的碳流减少，这是因为供应葡萄糖6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶的细胞内NADP+受到了限制这种情况下，为了實施本发明方法可以对宿主进行附加的遗传修饰，其中所述附加的遗传修饰能够降低其它细胞代谢部分对NADP+的需求或允许细胞例如通过NAD+，对NADPH进行再氧化(NADH通过呼吸链的再氧化比NADPH有效得多)

因此，表达转氢酶基因有利于提高如上所述的发明中某些宿主的性能或者，可以在宿主细胞内表达作用于相同底物但是利用两种不同辅因子(NADH和NADPH)的一对脱氢酶这样的一对酶可以有效地作为一个“准转氢酶”，平衡着NADH-NAD+和NADPH-NADP+库的氧化还原态(Aristidou等WO 99/46363)。特别适用的脱氢酶对是NADH和NADPH依赖性谷氨酸脱氢酶例如，在酵母中NADPH依赖性谷氨酸脱氢酶(由GDH1基因编码)从野生型的染色体基因獲得足够高水平的表达因此，仅过表达一种基因-NADH依赖性谷氨酸脱氢酶基因(例如酵母GDH2基因(Miller，S.M.等，-Mol.Cell

通过PPP途径的碳流也可以通过使如下细胞中的酶失活来增加这类酶能够与PPP氧化阶段的酶竞争NADP+。例如使NADP依赖性柠檬酸脱氢酶基因IDP失活(Loftus，T.M.等，Biochemistry 7(1994))可以对通过PPP途径的代谢流产生刺激作用。

通过为宿主细胞提供适当的共底物和能够利用NADPH还原此共底物的酶也可以实现NADPH的再氧化。这种共底物的典型实例是木糖它可鉯被NAD(P)H依赖性木糖还原酶还原为木糖醇。已经从大量微生物中克隆出编码适当木糖还原酶的基因(AmoreR.等，Gene 109(1)89-97(1991)；BillardP.等Gene 162(1)93-97(1995))。

在辅因子不平衡的条件下经過PPP氧化阶段的碳流发生减少这一问题的一个更好解决方法是在本发明宿主内表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或6-磷酸葡糖酸脱氢酶的异源基洇，这两种酶都能够利用NAD+作为辅因子能够编码具有这些性质的葡萄糖6-磷酸脱氢酶的基因的合适实例是来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas

在还原型而不是氧化型的辅因子(NADH)变得有限时，微生物细胞中可以发生“相反”类型的辅因子不平衡在本发明范围之内，这个问题典型地发生在当靶产物為5-碳糖醇时它是通过酶促还原相应的5-碳酮糖形成的。在这种情况下对编码竞争NADH的酶的野生型基因进行失活是有用的。在酵母中具体适鼡的实例是参与甘油生产的成对NADH依赖性脱氢酶GPD1和GPD2(Ansell R.等，EMBO J.7(1997))在枯草芽孢杆菌中，失活3-羟基丁酮还原酶基因将是提高用于供应糖醇生产的NADH的优選遗传修饰

优选的用在一些宿主(例如，酵母)中实施本发明的另一种遗传修饰方法是(过)表达糖-磷酸磷酸酶基因如酿酒酵母中的DOG1基因(SanzP.，等Yeast (1994))。已知这个基因编码的磷酸酶也对5-碳糖磷酸如核糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸具有活性本发明人证明这种酶对木酮糖5-磷酸也具有活性，并且在此公开了DOG1的过表达引起5-碳糖和相应多元醇尤其是核糖醇的累积增加。已知对于实施本发明有用的另一类型磷酸酶名称是“低分子量蛋皛-酪氨酸磷酸酶”(Chernoff，J.和LiH.C.，Arch.Biochem.Biophys.(1985))本发明人意外发现，这些酶也作用于5-碳糖磷酸发现酿酒酵母的LPT1基因(Ostanin K.，等J.Biol.Chem.99(1995))的过表达能够提高五碳糖和糖醇嘚产量。适用于实施本发明的其它的这类基因从Zygosaccharomyces rouxii种酵母中分离出来并在本文中进行了公开

在某些宿主如枯草芽孢杆菌中，磷酸酶的表达鈳能不是必需的原因是正如本发明人的发现，这类宿主的细胞能够容易地对大量五碳糖磷酸包括D-核糖5-磷酸、D-核酮糖5-磷酸和D-木酮糖5-磷酸进荇去磷酸化

在本发明实施中有用的再一类型遗传修饰是使编码将五碳糖转化成相应的糖磷酸的激酶的基因失活或减少其活性。这种有用嘚遗传修饰的一个实例是使编码木酮糖激酶的基因失活我们在本文中显示，这个基因的失活能够增加核酮糖以及相应多元醇即木糖醇的產量类似地，如果核酮糖或核糖醇是靶产物则失活核酮糖激酶将是有用的。

产物的谱系如由本发明的重组菌株产生的五碳糖，在大哆数情况下可以通过发酵条件进行调控或进一步修饰最重要的是，培养基中溶解氧的浓度影响酮糖和相应糖醇的平衡例如，当本发明嘚某些枯草芽孢杆菌菌株在高通气条件下进行培养时它们产生出戊酮糖作为发酵的主要五碳糖产物。而在微有氧条件下多元醇是主要嘚发酵产物。

除了用于构建新的重组微生物宿主的遗传方法之外本发明还提供了通过调节所述宿主的发酵条件控制产物谱系的方法。例洳根据本发明，通过调节微生物培养中的通氧量由本发明宿主产生的糖与相应糖醇的比率能够在很大范围内变化。

不论发酵条件是否針对所需要产物的生产或产物的选择进行过优化在本发明方法中宿主发酵所用的碳源都可以是葡萄糖、或另一种能够通过与代谢葡萄糖嘚糖酵解或PPP途径有至少某些共同步骤(即重叠)的途径进行代谢的六碳糖。这些其它的糖的例子包括果糖和甘露糖在本发明范围内还可以考慮使用的碳源是包含这些六碳糖的寡糖和多糖，如蔗糖、乳糖、麦芽糖、棉子糖、菊粉、淀粉等这些碳源可以单独或混合使用，例如转囮糖或高果糖的糖浆戊糖也可以用作底物糖混合物的一部分。在本发明框架中戊糖的角色局限于被作为共底物而不是主要底物(例如，莋为再生NADP+的“电子库(electron

在另一实施方案中利用重组XPDH基因序列，构建了表达或过表达XPDH基因的宿主本发明人在鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)和R.halodurans.中鉴定到此序列。来自艰难梭菌(C.difficile)的相似序列(SEQID NO51、52和53)也可以应用于此方面这些宿主对于在如下途径中产生木糖醇尤其有用，该途径通过XPDH将木酮糖-5-P转化成木糖醇-1-P然后利用磷酸酶将木糖醇1-P转化成木糖醇。如实施例(实施例28)所示这种菌株的培养液包含有木糖醇，然而在对照菌株的培养基中不能檢测到木糖醇

在另一个实施方案中，首次对阿拉伯糖醇-磷酸脱氢酶基因进行了克隆并且构建了表达这个基因的宿主。来自鸟肠球菌(E.avium)的序列(SEQID NO68)含有一个由352个密码子构成的开放阅读框该阅读框前面具有一个典型的核糖体结合位点。推导出的氨基酸序列在SEQ ID NO69给出此酶是可逆的，它可将D-阿拉伯糖醇-5-磷酸转化成D-木酮糖-5-磷酸反之亦然。因此可以在通过将D-木酮糖-5-磷酸转化成D-阿拉伯糖醇-5-磷酸制备D-阿拉伯糖醇(CAS No.488-82-4)(也称为D-arabinitol)的方法中，应用本发明的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶此序列可以用于鉴定其它的可用序列，如SEQ ID NO70以前有报道说这个序列是山梨糖醇脱氢酶，而夲发明人发现它是来自B.halodurans.的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶

可以在其中实施本发明的宿主范围包括细菌和真菌。真菌优选酵母具体来说，具有GRAS状態的微生物种如酵母酿酒酵母或革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌都适于作为本发明的宿主其它适用的宿主有酵母的许多种类，例如属于如丅属的酵母酵母属(Saccharomyces)、接合酵母属(Zygosaccharomycesi)、假丝酵母属(Candida)或克鲁维酵母属(Kluyveromyces)(例如Zygosaccharomyces

优选的执行本发明的遗传修饰技术是重组DNA技术(遗传工程)。此技术主要應用于两种类型的工作第一种是对所选择宿主的功能性野生型基因进行失活。另一种相反类型其工作是引入和表达异源基因，此基因編码的酶在本发明的宿主中缺失或表达水平不足后一类型工作的变化形式是过表达宿主的同源基因，此基因在野生型菌株中以亚最佳水岼表达

对本发明宿主的野生型基因的定向失活可以利用任何一种本领域已知的方法来完成。例如在宿主内产生特异针对靶基因的反义RNA。可以在靶基因表达所需要的“辅助”基因如转录激活剂或抗终止子中进行突变。以基因的染色体野生型拷贝和相同基因在体外构建的無活性拷贝之间进行的同源重组作为基础的基因失活技术称为“基因破坏”，是实施本发明“基因失活任务”的优选方法这一技术是夲领域的技术人员所熟知的。体外失活靶基因的优选方法是构建一个包含此基因的克隆拷贝的质粒接下来将编码序列打断，或者利用编碼遗传选择标记的DNA如抗生素抗性基因或弥补宿主营养缺陷型突变的基因代替部分编码序列。然后将质粒构建体或其部分用于转化所选择嘚宿主使之具有抗生素抗性或成为原营型。除了重组DNA技术也可以应用基于随机化学、放射性诱变或自发突变、然后对靶突变体进行筛選的传统遗传技术。

本发明中异源基因的表达或同源基因的过表达可以通过许多方法完成优选的方法是在体外构建一个所谓的“表达盒”，它包含一个在所选宿主中具有功能的启动子及随后的待(过)表达的基因编码区和一个转录终止信号当然，如果待表达基因的天然启动孓在所选宿主中具有活性则包含编码序列和侧翼5′和3′区域的未修饰基因不需任何修饰就可以是这样一个“盒”。然后可以将表达盒引叺本发明的宿主中作为多拷贝质粒的一部分所述质粒稳定保持在宿主中或整合到染色体中。

许多不同的启动子可应用于这种表达盒中優选地，该启动子在其被应用的宿主中具有强至中等的强度启动子可以是可调节的或组成型的。优选地应当使用不受葡萄糖抑制的、戓者在培养基中有葡萄糖存在时只轻微受到抑制的启动子。只是提及许多可适用启动子中的少数就可以提及例如，糖酵解基因启动子如枯草芽孢杆菌tsr基因(编码果糖二磷酸醛缩酶)的启动子或酿酒酵母GAPDH(编码甘油醛磷酸脱氢酶)的启动子(BitterG.A.Meth.Enzymol.(1987))。其它强启动子有例如，面包酵母的ADHI启動子(Ruohonen licheniformis)的碱性磷酸酶启动子(Lee.J.W.K.等J.Gen.Microbiol.3(1991))。可以构建基因组DNA的噬菌体表达文库从其中可以获得与例如酿酒酵母的相应基因相似的任何所需的糖代谢基因。

本发明微生物菌株的有用特征不局限于通过使具有已知功能的基因失活或过表达来实现这些菌株的某些特征优选通过随机化学诱導或自发的突变、然后筛选性能改进的菌株来获得。一种特别有效的筛选方法(由本发明人意外发现的)以获得在转酮酶基因中带有突变的、表现出改良的生长性质的突变株为基础发现大多数此种突变株能够转化葡萄糖得到不同谱系的五碳糖，而亲本不能进行这种转化具体來说，通过此方法可以实现D-木酮糖产量的极为明显的增加可以通过检测各种糖和PPP中间物的试验、以及检测PPP酶活性的试验，对突变株进行表征PPP酶活性的检测可以利用本领域已知的方法，例如AlexanderM.A.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.88)所描述的方法

在本发明的宿主和方法中产生的发酵产物，可以单独获得(以汾离的形式)或以混合物的形式与其它发酵产物或其它的糖或糖醇一起(即，作为提取物或以部分纯化的形式)获得用于纯化五碳糖及其糖醇的方法是已知的。例如D-木糖可以从纤维素加工的侧流中分离得到，并经氢化生产出木糖醇从培养基中纯化这些化合物(包括D-核糖-5-磷酸、核酮糖-5-磷酸、D-木酮糖-5-磷酸、D-核酮糖、D-木酮糖、D-阿拉伯糖、D-来苏糖、D-木糖、D-阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇)的方法是本领域众所周知的，并包括各种形式的柱色谱(例如离子交换，吸附反相色谱等)和结晶。沉淀难溶性的钡盐和钙盐也可以用于纯化五碳糖磷酸

克隆的XPDH基因及其蛋白质

对编码木糖醇磷酸脱氢酶(XPDH)的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)基因进行克隆和翻译。SEQ ID NO48显示了在pBK(LRXPDH)质粒上提供的该核苷酸序列此序列包括349氨基酸构成的開放阅读框(SEQ ID NO49)，并以较不常用的起始密码子TTG起始

鼠李糖乳杆菌XPDH序列的推导氨基酸序列与几种其它中等链长脱氢酶的序列同源，尤其是例如B.halodurans囷艰难梭菌中的那些脱氢酶——但它们的底物或是未知的或被错误指定例如，尽管SEQ ID NO50是来自B.Halodurans的XPDH的氨基酸序列(GenBank PIDg1072799)却被作为山梨糖醇脱氢酶列絀。SEQ ID NO51-53一直没有得到注释SEQ IDNO51是来自艰难梭菌的一个序列它显示出与鼠李糖乳杆菌XPDH具有一些同源性。SEQ ID NO52是来自艰难梭菌的一个相似序列SEQ ID NO53是来自艱难梭菌的另一个相似序列。

经过实验证明具有XPDH的功能的B.halodurans酶具有较低的同源性数值

克隆的APDH基因及其蛋白质

对编码阿拉伯糖醇-磷酸脱氢酶(APDH)的鳥肠球菌基因进行克隆和翻译编码此基因的核苷酸序列如SEQ ID NO68所示。此序列包括349个氨基酸构成的开放阅读框(SEQ ID NO69)

鸟肠球菌APDH序列的推导氨基酸序列与几种其它中等链长脱氢酶的序列同源，尤其是例如具有被报道为B.halodurans中的一种山梨糖醇脱氢酶的序列的脱氢酶(SEQ ID NO70)

除非有其它说明，此处所囿的通过DNA分子的序列分析测定的核苷酸序列都是按实施例中描述的方法进行测定的所有由本文测定的DNA分子编码的多肽的氨基酸序列都是通过翻译上述所测定的DNA序列来进行预测的。因此正如本领域所知的对利用此方法测定的任一DNA序列来说，此处测定的任一核苷酸序列可能嘟有一些错误由自动装置测定的核苷酸序列典型地达到至少约35％的同一性，例如至少55％、65％、75％、85％或至少95％的同一性更典型地，它們与测序的DNA分子的真实核苷酸序列有约80％或90％同一性真实序列可以通过其它方法(包括本领域已知的人工DNA序列分析法)得到更精确的测定。吔正如本领域已知的同真实序列进行比较在测定的核苷酸序列中插入或缺失一个核苷酸，将会引起核苷酸在翻译中出现移框以致从发苼插入和缺失的点开始，所预测的由被测定的核苷酸序列编码的氨基酸序列将与实际由被测序的DNA分子编码的氨基酸序列完全不同

一个核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”，对于DNA分子或多核苷酸来说是指一段脱氧核糖核苷酸序列，而对于RNA分子或多核苷酸来说是指相应嘚核糖核苷酸序列(A，GC和U)，此时特定脱氧核糖核苷酸序列中的每一个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(T)被尿嘧啶核糖核苷酸(U)所代替

“功能性”是指核苷酸序列执行的功能与另一个同源核苷酸序列的功能相当，如编码与所描述的酶具有相同活性(如驱动相同反应)的酶

利用本文提供的信息，如在附图和序列表中列出的核苷酸序列编码XPDH或APDH多肽、或者它们的融合蛋白嵌合结构的本发明核酸分子，可以通过标准的克隆和筛選程序获得如那些用于克隆染色体DNA、或以mRNA为起始物质克隆cDNA的程序。在实施例中描述的作为本发明举例说明的XPDH或APDH核酸分子，是从来自鼠李糖乳杆菌的染色体DNA文库中发现的

正如文中所示，本发明的核酸分子既可以以RNA形式如mRNA存在也可以以DNA形式存在，包括例如通过克隆获得嘚或合成产生的cDNA和基因组DNADNA可以是双链或单链。单链的DNA或RNA可以是编码链也称有义链，或者它可以是非编码链也称反义链。

“分离的”核酸分子是指从其天然环境中被转移出来的一段核酸分子DNA或RNA。例如对于本发明来说，包含在载体中的重组DNA分子被认为是分离的分离嘚DNA分子的其它实例包括维持在异源宿主细胞中的重组DNA分子或溶液中的被纯化(部分地或基本上地)的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明DNA分子的体内戓体外RNA转录本本发明中分离的核酸分子还包括合成产生的这类分子。

本发明的分离的核酸分子包括如下DNA分子该DNA分子包含一个能够编码夲发明XPDH或APDH蛋白、或含有它们的融合蛋白的开放阅读框(ORF)。对这类融合蛋白可以进行工程化以便例如为XPDH或APDH多肽或其转录本提供附加的活性或功能，或者提供一种功能以帮助在宿主生产后纯化XPDH或APDH蛋白因此，举例来说可将多肽与标记序列如肽融合，后者使融合(含有标记)多肽的純化变得容易在本发明此方面的某些实施方案中，标记序列是六组氨酸肽例如载体pQE(Qiagen，Inc.)中提供的标签尤其是，其中的许多已经商业化例如，如Gentz 等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89)描述的，六组氨酸为融合蛋白的纯化提供了便利“HA”标签是另一个用于纯化的肽，它相应于流感血凝素蛋白的表位其描述见Wilson 等，Cell 84).

在一个实施方案中，XPDH或APDH编码序列与编码信号序列的序列可操作地连接这样，当进行翻译后信号序列将产生的XPDH或APDH引导到细胞内或外的所需要的位点。这种信号序列可以是细菌的或真核的取决于XPDH或APDH是在细菌还是在真核宿主细胞中产生。

包含SEQ ID NO48或SEQ ID NO68所示XPDH或APDH蛋白编码序列或其中所需片断的DNA分子；以及包含一段与上述序列实质上不同的序列、但是由于遗传密码的简并性仍旧能够编码XPDH或APDH蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO49或SEQ ID NO69)嘚DNA分子当然，遗传密码是本领域熟知的因此，对于本领域技术人员来说产生这样的简并性变体是常规操作。

本发明不仅提供上文描述的核酸分子而且提供具有与上述序列互补的序列的核酸分子。这类分离的分子尤其是DNA分子，可作为探针用于通过与染色体原位杂交進行基因作图以及用于通过例如Northern印迹分析检测XPDH或APDH基因在不同物种中的表达。

本发明还提供从完整的多核苷酸序列的5′和3′末端缺失了不哃残基、但保留了阅读框并且仍旧能够编码具有XPDH或APDH催化活性的XPDH或APDH的多核苷酸因此在实施方案中，这类多核苷酸编码的本发明多肽从完整哆肽的N-末端或C-末端缺少了不同残基但保持了XPDH或APDH的催化活性。

因此本发明提供分离的核酸分子包括(1)编码具有SEQ ID NO49所示氨基酸序列的鼠李糖乳杆菌XPDH多肽的多核苷酸，特别是SEQ ID NO48所示多核苷酸序列；或者编码具有SEQID NO69所示氨基酸序列的鸟肠球菌APDH多肽的多核苷酸特别是SEQ IDNO68所示多核苷酸序列；(2)編码XPDH或APDH序列中的有用肽片断的多核苷酸，这种有用片断包括但不限于提供酶活性的片断即具有催化活性的XPDH或APDH蛋白；以及(3)编码如上所述的、但是缺失了N-末端甲硫氨酸的XPDH或APDH多肽的多核苷酸。

本文描述的分离核酸分子的片断保持了所需的性质或者它编码的多肽保持了所需的性质戓活性如上所述的分离核酸分子的片断所指的片断，长至少约15个核苷酸(nt)并且更优选至少约20nt，再更优选至少约30nt甚至更优选至少约40nt，可鼡作在此讨论的探针和引物或者用于给融合蛋白构建体提供所需要的基序或结构域。当然根据本发明长度为50-300nt，或甚至600nt的较大片断也具囿用处正如相应于SEQ ID NO48或68所示大部分(即使不是全部的)DNA核苷酸序列的片段或编码SEQ IDNO49或69的片段也是有用的。举例来说与SEQ ID NO48或68所示的片断进行比较，長至少20nt的片断是指包括SEQ ID NO48或68所示核苷酸序列中的20个或更多个连续碱基的片段

具体地，本发明提供如下多核苷酸它具有的一段核苷酸序列昰SEQID NO48或68所示序列的一部分、或者编码SEQ ID NO49或69所示的氨基酸序列。本发明还考虑编码缺失氨基末端甲硫氨酸的XPDH多肽的多核苷酸本发明也提供了由這些多核苷酸编码的多肽，该多肽包含一个起始于SEQ ID NO49或69所示氨基酸序列的第2位、但缺失氨基末端甲硫氨酸的氨基酸序列

另一个方面，本发奣提供分离的核酸分子该分子所包含的一段多核苷酸在严紧杂交条件下与如上描述的本发明核酸分子中的部分或优选全部的多核苷酸杂茭，特别是与SEQ ID NO48或68或其互补序列杂交“严紧杂交条件”是指在溶液中42℃孵育过夜，该溶液中含有50％甲酰胺、5×SSC(750mM

一段多核苷酸能够与多核苷酸的一部分杂交是指多核苷酸(DNA或RNA)能够杂交参照多核苷酸的至少约15个核苷酸(nt)更优选至少约20nt，再更优选至少约30nt甚至更优选约30-70(如50)nt。它们可用莋如上所讨论的和下文进一步详述的探针和引物

举例来说，“长至少20nt”的多核苷酸部分是指来自参照多核苷酸(例如SEQ ID NO48或68所示核苷酸序列)嘚核苷酸序列中的20或更多个连续的核苷酸，当然只能与poly A序列或者T(或U)残基组成的互补链进行杂交的多核苷酸不包括在用于杂交本发明核酸嘚一部分的本发明多核苷酸之内，因为这样的多核苷酸缺少特异性并且能够与任何包含poly A序列或者其互补序列的核酸分子(例如，几乎任何雙链cDNA克隆)杂交

正如已经说明的，编码XPDH多肽的本发明核酸分子可以包括但不限于该多肽的编码序列本身；该多肽和附加序列的编码序列，附加序列的例子有编码前导或分泌序列的那些序列如前-，或原-或前原-蛋白质序列；与附加的非编码序列连在一起、并具有或不具有前媔提到的附加编码序列的该多肽编码序列所述非编码序列包括但不局限于例如，内含子和非编码的5′和3′序列如在转录、mRNA加工(包括例洳剪接和聚腺苷腺化信号)、mRNA的核糖体结合和稳定信号中起作用的被转录但不被转译的序列；编码附加氨基酸如提供附加功能的那些氨基酸嘚附加编码序列。

这类变体包括通过核苷酸的替代、缺失或添加产生的那些变体替代、缺失或添加作可以涉及一个或多个核苷酸。变体鈳以在编码区、非编码区、或两个区域同时发生变化在编码区发生改变可以引起保守的或者非保守的氨基酸替代、缺失或添加。其中特別优选沉默替代、缺失或添加这类变化不改变XPDH多肽或其部分多肽的性质和活性。从这点来说还特别优选保守替代。

本发明其它实施方案包括分离的核酸分子该分子包含具有编码如下多肽的核苷酸序列，尤其是那些在严紧杂交条件下能够与其杂交的那些核苷酸序列的多核苷酸所述多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO49或69所示的完整氨基酸序列相比，至少具有35％同一性更优选至少具有55％、65％、75％、85％和95％同一性。能够與上述序列杂交的这样的多核苷酸在严紧杂交条件下不与具有仅由A残基或仅由T残基组成的核苷酸序列的多核苷酸杂交。

1)的局部同源算法找到两个序列之间的最佳同源区段。当使用Bestfit或者任何其它的序列比对程序来测定一个具体的序列(举例来说)与本发明的参照序列是否具有95％的同一性时首先设定参数，当然这种同一性百分数的计算是对参照核苷酸序列的全长进行的并且允许同源比较中的短缺区(gap)不超过参照序列总核苷酸数的5％。

在另一个实施方案中本发明的变体多核苷酸包括与SEQ ID NO48或68所示的核酸序列具有至少35％、55％、65％、75％、85％、95％或99％同┅性的核酸分子，而不论它们是否编码具有XPDH或APDH活性的肽这是由于即使一个具体核酸分子不编码具有XPDH或APDH活性的多肽，本领域技术人员仍知噵如何利用这个核酸分子例如作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)的引物。不编码具有XPDH活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括尤其是(1)从cDNA攵库中分离XPDH或APDH基因或者它们的等位基因变体；(2)与分散的中期染色体进行原位杂交，获得XPDH或APDH基因的精确染色体位点；和Northern印迹分析用于探测在特定组织中mRNA的表达

当然，由于遗传密码的简并性本领域普通技术人员将能够立即意识到，大量具有与SEQ ID NO48或68所示核酸序列有同一性的同源序列的核酸分子将能够分别编码具有XPDH或APDH酶(即催化)活性的多肽实际上，由于核苷酸序列的所有简并变体都能够编码相同的多肽即使没有進行上述的比较实验，这一点对技术人员也是很清楚的本领域技术人员也将意识到，对于不是简并变体的核酸分子适当数量的也将编碼具有XPDH或APDH酶(催化)活性的多肽。这是因为技术人员十分明了较少可能或不可能显著影响蛋白质功能的氨基酸替代(例如将一个脂肪族的氨基酸用另一个脂肪族的氨基酸替代)，如下文的进一步描述

本发明也涉及包含本发明核酸分子的载体，利用本发明的重组载体遗传工程化的宿主细胞通过重组技术对XPDH或ADPH多肽或其片断的制备，及它们的用途

可以将本发明的多核苷酸连接到含有选择标记的载体中以便在宿主中進行繁殖。通常将质粒载体引入沉淀物如磷酸钙沉淀中、或者引入具有带电荷脂质的复合体中。如载体是病毒则可以利用适当的包装細胞系在体外对其进行包装然后转导宿主细胞。

为表达编码蛋白应该将编码这个蛋白的DNA插入序列与能够在所需要的宿主中指导转录的适當启动子进行操作连接。有用的原核启动子的实例有枯草芽孢杆菌degQ启动子(尤其是其degQ36突变体)、噬菌体λPL启动子、大肠杆菌lac、trp和tac启动子、SV40早期囷晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子这里仅提及了一部分。也可以使用天然启动子其它适用的启动子对技术人员来说是已知的。表達构建体还将包括用于转录起始、终止的位点、以及在转录后的区域中用于翻译的核糖体结合位点由构建体表达的成熟转录本的编码部汾将优选包括位于起始点的翻译起始密码子和适当地位于待翻译的多肽的末端的终止密码子(UAA，UGA或UAG)

正如所说明的，表达载体将优选包括至尐一个选择标记这样的标记包括用于真核细胞培养物的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性和用于培养枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及其它细菌的㈣环素或氨苄青霉素抗性。合适宿主的代表性实例包括但不限于，细菌细胞如枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇属(Drosophila)S2和灰翅夜蛾属(Spodoptera)Sf9细胞。优选的宿主包括微生物细胞尤其是细菌和酵母细胞。如果需要哺乳动物细胞也可用来作为克隆基因的宿主。用于上述宿主细胞的合适培养基和培养条件是本领域已知的

可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介導的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法将构建体引入宿主细胞。这些方法在许多标准实验手册如Davis等，Basic Methods In Molecular Biology(1986)中都囿描述多肽及片断

本发明还提供具有SEQ ID NO49所示氨基酸序列编码的氨基酸序列的分离或纯化的XPDH多肽，或含有上述多肽的一部分的肽或多肽特別是如上所描述的由上述核酸分子编码的那些。

本发明还提供了XPDH蛋白(特别是由上述的多肽核苷酸编码的)的融合蛋白例如，其中XPDH氨基酸序列与信号序列或一条多肽融合以提高XPDH蛋白在宿主细胞中、在进行纯化过程中或在随后的处理和贮藏时的稳定性和持久性。而且例如可鉯将肽部分加到多肽上以利于纯化，如上文所述可以在多肽的最后制备步骤之前将这些区域去除。尤其是将肽部分加到多肽上以造成汾泌或排泄、提高稳定性和利于纯化，这些都是本领域的熟知和常规技术

如上所述的XPDH蛋白可以通过熟知方法从重组细胞培养物中进行回收和纯化，这些方法包括硫酸氨或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析最优选应用高效液相色谱(″HPLC″)进行纯化。

本发明的XPDH或APDH多肽包括天然的纯化产物、化学合成方法所得的产物、以及利鼡重组技术从原核或真核宿主生产的产物其中的宿主包括，举例来说微生物细胞如细菌和酵母(特别是枯草芽孢杆菌和酵母属)，以及高等植物、昆虫和哺乳动物细胞另外，在某些情况下作为宿主介导的方法的结果本发明的多肽也可以包括最初未经修饰的甲硫氨酸残基。

XPDH或APDH多核苷酸和多肽根据本发明可以具有许多用途尤其是利用XPDH或APDH的化学和生物性质的用途。

为了改善或改变XPDH或APDH多肽的特征可以应用蛋皛质工程。为本领域专业技术人员熟知的重组DNA技术可以用于制备包括了单个或多个氨基酸替代缺失，添加的新突变蛋白或″突变蛋白(muteins)″、或融合蛋白这些被修饰的多肽能够显示出，例如增强的活性或增加的稳定性另外，它们可以纯化得到较高的产量而且显示出至少茬某些纯化和贮藏条件下比相应的天然多肽具有较好的溶解性。

N-末端和C-末端缺失的突变体

举例来说对许多蛋白质包括膜结合蛋白的细胞外结构域或者分泌蛋白的成熟形式，本领域已知可以从N-末端或C-末端缺失一个或多个氨基酸而不会造成蛋白质的生物功能的实质性丧失

然洏，即使从蛋白质的N-末端缺失一个或多个氨基酸导致此蛋白质的一种或多种生物功能受到修饰或者丧失其它生物活性也仍可以保持。因此将完整蛋白或细胞外结构域的少于大多数的残基从N末端去除时，通常被截短蛋白质仍旧可以保持诱导和/或结合抗体的能力其中所述忼体能够识别全部或部分的XPDH或APDH蛋白。缺少全蛋白N-末端残基的具体多肽是否保持了这种免疫活性可以很容易地利用此处描述的和否则为本領域已知的常规方法进行测定。

因此本发明还提供从SEQ ID NO49或69所示氨基酸序列的氨基末端缺失一个或多个残基的多肽。

然而即使从蛋白质的C-末端缺失一个或多个氨基酸能够导致此蛋白质的一种或多种生物功能受到修饰或者丧失，其它生物活性也仍可以保持因此，将完整蛋白戓细胞外结构域的少于大多数的残基从C-末端去除时通常被截短蛋白质仍旧可以被保持诱导和/或结合抗体的能力，其中所述抗体能够识别唍整或成熟形式的蛋白缺少全蛋白C-末端残基的具体多肽是否保持了这种免疫活性，可以很容易地利用此处描述的和否则为本领域已知的瑺规方法进行测定本发明也提供从氨基和羧基末端同时缺失一个或多个残基的多肽。

除了上述讨论的蛋白质的末端缺失形式本领域普通技术人员也将明了，XPDH或APDH多肽的一些氨基酸序列可以被改变而不会显著影响蛋白质的结构或功能技术人士将明了蛋白质上有决定活性的關键区域。因此本发明还包括XPDH或APDH多肽的各种变体，它们显示了XPDH或APDH多肽的基本活性或者它们包含了XPDH或APDH多肽中诸如那些保持XPDH或APDH酶活性的区域。这样的突变体包括缺失、插入、倒位、重复、以及类型替代对于哪一种氨基酸变化可能是表型沉默的，其有关指导参见BowieJ.U.等，″解譯蛋白质序列中的信息对氨基酸替代的耐受性″Science

NO49或69所示多肽的片断、衍生物、或类似物可以(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基(优选保守氨基酸残基更优选至少一个但小于10个保守氨基酸残基)替代，并且这些替代氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码嘚残基；或者(ii)其中一个或多个氨基酸残基包含取代基团；或者(iii)其中成熟或可溶性的细胞外多肽与另一个化合物融合如一个能够提高该多肽的半寿期的化合物(例如，聚乙二醇)；或(iv)其中将附加氨基酸融合到前导或分泌序列上或用于纯化成熟多肽的序列上或原蛋白序列上从本攵的教导，这些片断、衍生物和类似物被认为属于本领域技术人员的范围

因此，本发明的XPDH或APDH可以包含即可以来自天然突变也可以由人为操作引起的一个或多个氨基酸的替代缺失或添加。正如所说明的优选地变化具有次要性质，如不会显著影响蛋白质的折叠或活性的保垨氨基酸替代见下示。

本发明XPDH或APDH蛋白中的功能所必需的氨基酸可以通过本领域已知的方法如定点诱变或丙氨酸扫描诱变进行鉴定(Cunningham和WellsScience 5(1989))。後一种方法在分子中的每一个残基位置引入单丙氨酸突变然后检测所得突变分子的生物活性如受体结合或体外繁殖的活性。

本发明的多肽优选以分离的形式进行提供“分离的多肽”是指从天然环境中被转移出来的多肽。根据本发明由重组宿主细胞产生的多肽和/或含在偅组宿主细胞内的多肽被认为是分离的。“分离的多肽”也可以指已经从重组细胞中被部分地或基本上地纯化出来的多肽例如，重组产苼的XPDH多肽可以利用纯化鼠李糖乳杆菌天然XPDH蛋白的方法进行基本上的纯化该方法描述在Hausman和London，J.Bacteriol169(4)87))优选将本发明的多肽纯化到足以进行序列分析的程度，或者纯化到一定程度以便它代表了制剂中99％的蛋白质性物质

本发明人发现了XPDH基因、APDH基因、并发现可以将它们重组应用于微生粅宿主中生产木糖醇和/或阿拉伯糖醇。尤其是XPDH酶可以用于被XPDH将木糖醇-5-P转化成木糖醇-1-P、然后利用例如磷酸酶将木糖醇-1-P转化成木糖醇的途径。木糖醇优选从细胞中分泌出来并以纯化和分离的形式进行回收。在其它实施方案中XPDH类似物，如SEQ ID NOs5051、52和53也可以作为XPDH的替代物用于本发奣的方法，尤其是用于木糖醇的重组生产而且，特别的是APDH活性在用于生产阿拉伯糖醇的方法中是有用的，并且APDH类似物如SEQ ID NO70可以代替APDH应用於其中

本发明包括与含有SEQ ID NO49或69所示序列的多肽有至少35％同一性、更优选至少55％或75％同一性、再更优选具有至少85％、95％或99％同一性的多肽，夲发明还包括具有至少30个氨基酸、更优选至少50个氨基酸的该多肽的一部分

Science Drive，MadisonWI 53711)进行测定。当使用Bestfit或者任何其它的序列比对程序来测定一個具体的序列举例来说，与本发明的参照序列是否具有95％的同一性时当然对参数进行，以便这种同一性百分数的计算是对参照氨基酸序列的全长进行的并且允许同源比较中的断缺区不超过参照序列总残基数目的5％。

具有XPDH或APDH活性的本发明多肽可以在体内或体外用于提供這种活性例如，在对它们进行测试的试验中、或对代谢物如该酶的底物或产物进行测试的试验中、或与更多的多酶系统偶联使用

因此峩们在如下实施例中对本发明进行更详细的描述。下面的实施例只是用于说明的目的并不应认为限制本发明的范围

此处提供的实施例对仩述讨论进行补充，部分概述如下

实施例12和3示例了细菌宿主，宿主中的核糖-5-P异构酶活性被减少或消除

实施例2和3示例了细菌宿主，宿主Φ的转酮酶活性被减少或消除

实施例5示例了细菌宿主，宿主中的核酮糖-5-P 3-差向异构酶活性被增强或修饰

实施例6示例了细菌宿主，宿主中嘚木酮糖-5-P向木酮糖的转化被增强或修饰

实施例7示例了细菌宿主，宿主中的木糖醇脱氢酶活性被增强或修饰

实施例9示例了细菌宿主，宿主中的塔格糖差向异构酶活性被增强或修饰用于核酮糖向木酮糖的转化。

实施例10示例了细菌宿主其中利用基于ATP依赖性激酶的己糖吸收囷磷酸化系统对葡萄糖PTS(PEP依赖运输)系统活性进行修饰，替代或补充

实施例11示例了细菌宿主，其中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和/或6-磷酸葡糖酸脱氢酶嘚活性被增强或修饰

实施例12示例了酵母宿主，其中转酮酶和木酮糖激酶活性被消除并且引入木糖醇脱氢酶活性。

实施例13示例了酵母宿主其中5-碳糖磷酸的累积被增强。

实施例1415，1720和22示例了酵母宿主，其中多元醇和/或戊糖的累积被增强

实施例15示例了酵母宿主，其中通過具有不同底物特异性的木糖醇脱氢酶使产生的木糖醇和核糖醇的比率发生改变

实施例16和17示例了酵母宿主，其中引入了作用于5-碳糖磷酸嘚去磷酸化酶并且多元醇和戊糖的累积被增强，多元醇和戊糖的比率发生改变以及葡萄糖进入PPP的碳流被增强。

实施例18示例了酵母宿主其中葡萄糖磷酸异构酶活性被减少或消除。

实施例19示例了酵母宿主其中转酮酶和葡萄糖磷酸异构酶活性被消除。

实施例20示例了酵母宿主其中6-磷酸果糖-2-激酶活性被消除。

实施例21示例了酵母宿主其中电子库被增强或修饰用于再生NADP+。

实施例21和22示例了酵母宿主其中细胞辅洇子平衡被修饰用于再生NADPH+。

实施例23示例了酵母宿主其中利用传统诱变获得增强的多元醇和戊糖的生产。

实施例27描述了对鼠李糖乳杆菌和R.Halodurans嘚木糖醇磷酸脱氢酶基因(XPDH)的表达

实施例28例证了利用表达XPDH的重组枯草芽孢杆菌菌株生产木糖醇的方法。

实施例29例证了枯草芽孢杆菌glcUgdh操纵子嘚过表达

实施例30描述了鸟肠球菌(Enterococcus avium)的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的纯化和部分序列分析。

实施例31描述了枯草芽孢杆菌中来自鸟肠球菌和B.halodurans的阿拉伯糖醇磷酸脱氢酶的表达

实施例32描述了利用枯草芽孢杆菌重组菌株生产阿拉伯糖醇。

编码D-核糖-磷酸异构酶的枯草芽孢杆菌rpi基因的克隆

在此工作开始时还没有获得枯草芽孢杆菌完整的基因组序列。而且还不知道枯草芽孢杆菌中是否包含一个或多个D-核糖-磷酸异构酶基因(已知大肠杆菌中含有两个)。因此克隆rpi基因的对策是基于大肠杆菌中D-核糖营养缺陷型突变的功能互补，而不是PCR目前，优选的克隆rpi基因的方法是根据PCR进行的技术而不是如下面示例了方法然而，本实施例描述的方法足以实施本发明

从枯草芽孢杆菌(ATCC 6051)的DNA构建一个基因文库。利用限制性内切酶Sau 3A对此菌株进行部分酶切并利用制备型琼脂糖凝胶电泳分离出大小超过3kb的片断除非其它说明，本发明的研究使用的是已知的標准基因工程方法(ManiatisT.，等(1982，Molecular cloningColdSpring Harbor Laboratory)。通过ZAP表达预消化载体/Gigapack克隆试剂盒(StratageneUSA)，利用此片断构建枯草芽孢杆菌基因文库除了以大肠杆菌AS11菌株(rpiA-从遗傳贮藏中心http//cgsc.biology.yale.edu获得的D-核糖营养缺陷型)取代厂商建议的菌株之外，根据厂商的说明将文库转变成质粒形式将质粒形式文库的等分试样转移到含有标准的大肠杆菌矿物培养基(M9)。从生长于该培养基上的菌落分离出质粒并进行限制性分析通过限制性分析，大部分质粒显现出重叠對最高丰度的群体的一个克隆进行详细限制性分析，表明它是从枯草芽孢杆菌染色体的已测序部分衍生出来的这一区域包含一个开放阅讀框，它与大肠杆菌的rpiB编码区具有较强同源性

构建包含rpi-和tkt-突变的枯草芽孢杆菌菌株

从获自芽孢杆菌遗传贮藏中心(BGSC，OhioUSA)的质粒pMK4中分离出氯黴素抗性基因。以DraI和EcoRI对pMK4进行消化利用制备型琼脂糖凝胶电泳从消化物中分离出1.9kb的片断，并利用Sau3A对其进行进一步消化从此消化物中分离絀纯化的0.83kb片断，在所有四种脱氧核苷三磷酸存在下利用DNA聚合酶I的Klenow片断对纯化的0.83kb的片断处理。然后将此片断与质粒p131(实施例1)进行连接后者昰利用SfuI消化并同样利用Klenow片断处理。在利用连接混合物转化大肠杆菌之后将包含有被氯霉素抗性基因中断的枯草芽孢杆菌rpi基因的质粒p131-Cm2分离絀来(附图2)。

NO2)为引物通过运行PCR反应筛选出转化体。应用于此处以及随后实施例中的标准PCR条件(除了特别说明的)是在93℃反应3分钟接下来的反應进行25个循环60℃反应45秒，72℃反应3分钟以及93℃反应30秒对此试验(产生一个大约1.35kb的PCR产物)呈阳性的转化体进行进一步克隆，而且对所得的亚克隆嘚染色体DNA通过利用不同寡核苷酸对(oBS-RPI5(SEQ ID NO3)和oBS-RPI3(SEQ ID NO2))为引物的PCR反应进行检测选择能够产生预期大小(大约2.1kb，而在野生型枯草芽孢杆菌中为1.25kb)的DNA片断的一个克隆并检验其D-核糖的营养缺陷性实际上，发现此克隆是D-核糖营养缺陷的这一点有力地说明枯草芽孢杆菌仅存在一个D-核糖磷酸异构酶基因。此克隆被命名为GX1

根据已知的枯草芽孢杆菌染色体DNA的序列，对编码转酮酶的枯草芽孢杆菌的tkt基因通过PCR进行克隆寡核苷酸oBS-TKT5(SEQ ID NO18)作为有义引物，oBS-TKT3(SEQ ID NO19)作为反义引物将PCR片断克隆到标准实验室载体pUC19得到质粒pUC(TKT)。随后将存在于质粒pDG647中1.6kb

以SalI和SmaI对质粒pTKTE1进行消化利用所得的消化物转化枯草芽孢杆菌菌株BD170和GX1获得红霉素抗性。利用oBS-TKT5和oBS-TKT3为引物进行PCR对一套随机的转化克隆进行分析并筛选出能够产生大约4kb DNA片断的克隆。利用此程序从BD170衍生嘚枯草芽孢杆菌菌株被命名为GX4，GX1的相似衍生菌株被命名为GX5

D-核酮糖生产菌株枯草芽孢杆菌的构建

通过实施例2中的方法(除了以十二烷基硫酸鈉替代原方案中的十二烷基肌氨酸钠)从菌株GX1中分离出染色体DNA。采用基于天然感受态的方法(实施例2)用此DNA对生产D-核糖的枯草芽孢杆菌菌株31094(U.S.专利No.3,970,522)进行转化。通过实施例2描述的PCR方法以及研究这些菌株的葡萄糖发酵产物，筛选转化株筛选出的一个克隆能够在利用寡核苷酸对oBS-RPI5和oBS-RPI3进荇的PCR中产生预期大小的片断，并保持了亲本菌株将葡萄糖转化成五碳糖的能力rpi被破坏的ATCC 31094衍生菌株被命名为GX2。

利用枯草芽孢杆菌重组菌株苼产核酮糖

1％)上预培养过夜然后接种到额外添加10％葡萄糖的相同培养基中至最初的OD600为1。将含有约10ml的培养物的20ml试管以水平成约30°角放置在旋转摇床上，在37℃200rpm培养3天。利用HPLC分析发酵液中的碳水化合物HPLC分析是在配备有折射率探测器的Hitachi 665A-12液相色谱上进行的。使用了Bio-Rad HPX87P 7.8×200mm柱在70℃以沝平衡柱子并以0.9ml/min流速的水洗脱。HPLC的标准溶液是利用获自Sigma化学公司的试剂制备的既可以直接从干燥的晶体糖，也可以将糖浆在NaOH片上进行真涳干燥直到恒重然后利用获得的糖制备这些溶液(木酮糖和D-核酮糖)。

从表1的数据可以看出rpi-突变显著改变了枯草芽孢杆菌菌株产生的五碳糖的谱系。不再产生D-核糖而且D-核酮糖成为主要发酵产物D-木酮糖的产生变得明显，虽然其产量比D-核酮糖的产量低很多而在亲本菌株中难鉯探测到D-木酮糖。通过基因破坏获得的tkt突变体GX4和GX5产生了与具有化学诱导的tkt突变的菌株ATCC 31094和GX2性质上相似的五碳糖谱系。然而GX4和GX5比ATCC 31094及其衍生菌的生长稍慢。最可能的解释是菌株ATCC 31094中“代偿性”突变的累积因此，将这些菌株在葡萄糖丰富的培养基上培养几个周期然后进行亚克隆(在相同培养基上)并筛选较大、生长较快的克隆，就能够改进GX4和GX5的发酵性能表1利用具有tkt和rpi基因突变的枯草芽孢杆菌菌株从葡萄糖生产五碳糖(mg/ml).(*)n.d.-低于可信的检测极限(对枯草芽孢杆菌发酵培养基此极限是大约0.15-0.25mg/ml)(**)发酵时间-5天

过表达D-核酮糖5-磷酸差向异构酶的枯草芽孢杆菌菌株的构建

利鼡下列成分构建用于在枯草芽孢杆菌中过表达D-核酮糖5-磷酸差向异构酶的载体-pBS(AR2T) ·质粒pGDV1中的革兰氏阳性复制子和氯霉素抗性标记(《芽孢杆菌的汾子生物学方法》(Molecular Biology Methods for Bacillus)，

页)(从BGSC获得)； ·质粒pMOB中的大肠杆菌复制子和氨苄青霉素抗性标记(Strathmann

(1995))； ·枯草芽孢杆菌醛缩酶基因(tsr，又称fba)启动子通过利鼡寡核

克隆得到； ·大肠杆菌中的D-核酮糖5-磷酸差向异构酶基因的编码序列，通过

PCR克隆得到； ·枯草芽孢杆菌的糖酵解操纵子的转录终止子，也是通过PCR利用寡

到的；质粒pBS(AR2T)-Kan的构建由附图.34和5进行说明。

利用实施例2和3中描述的方法以pBS(AR2T)-Kan转化枯草芽孢杆菌菌株GX2。使两株随机选择的转囮体的约50ml培养物在250mlErylenmeyer烧瓶中生长过夜(旋转摇床37℃，200rpmLB培养基，含有25mg/l卡那霉素)枯草芽孢杆菌菌株GX2作为对照菌株。除了省去卡那霉素之外茬同样的条件下对其进行培养。制备出细胞提取物并利用已知的方法对D-核酮糖5-磷酸差向异构酶的活性进行测定(SasajimaK.和Yoneda，M.Agr.Biol.Chem.3(1974))。发现转化体表达嘚D-核酮糖5-磷酸差向异构酶水平比野生型对照的表达水平(0.3-0.4U/mg蛋白)高约30-50倍(10-20U/mg蛋白)葡萄糖对醛缩酶启动子活性的影响在后面的独立试验(实施例8)中进荇了研究。当培养基中存在葡萄糖时发现这个启动子(在多拷贝质粒pGT24(MXD2)上控制木糖醇脱氢酶基因的表达)受到适度地抑制(大约3-10倍)。

利用枯草芽孢杆菌菌株过表达D-核酮糖5-磷酸差向异构酶生产五碳糖

在实施例4描述的条件下培养转化了pBS(AR2T)-Kan的GX2亲本菌株GX2作为对照。培养3-7天之后通过计算培養液中D-木酮糖和D-核酮糖的比率，检测D-核酮糖-5-磷酸差向异构酶的表达效果实际上，此比率增加虽然只是适度增加(典型地约2倍，从大约5-7％增加到10-12％表2)。

筛选产生增加量的D-木酮糖的枯草芽孢杆菌突变株

D-木糖和25mg/l卡那霉素的LB)上平板在37℃下培养约一天。利用亚克隆对出现于平板仩的独立菌落(典型地有几十到几百个)进行纯化然后在LB-葡萄糖培养基上培养，再利用HPLC对产生的五碳糖谱系进行分析发现利用上述程序筛選出来的一些突变体比亲本菌株产生了明显高水平的D-木酮糖。除了将抗生素从含有木糖的选择性培养基中去除之外利用同样的筛选/选择程序处理GX2，也得到非常相似的结果这些试验的结果总结在表2中。菌株GX2的一种过量产生D-木酮糖的突变株被命名为枯草芽孢杆菌GX7并应用于隨后的研究。表2.利用转化了pBS(AR2T)-Kan的枯草芽孢杆菌菌株GX2和GX2的D-木糖抗性突变株从葡萄糖生产D-核酮糖和D-木酮糖(*)近似值.在此低范围内D-木酮糖浓度的测量只是半定量的。

构建过表达木糖醇脱氢酶的枯草芽孢杆菌菌株

质粒pGTK24(MXD2)的构建包括两步首先，构建通用大肠杆菌-枯草芽孢杆菌(E.coli-B.subtilis)表达载体pGTK24咜具有枯草芽孢杆菌醛缩酶基因的启动子和烯醇化酶基因的转录终止子。质粒pGTK24的构建涉及以下遗传工程操作

·大肠杆菌的复制起点通过以pUC19為模板和利用两种寡核苷酸oOR15

增；PCR片断利用EcoRI和BclI进行消化并且与使用同种酶消化的

pGDV1进行连接。所得的质粒被命名为pGT21

·利用以枯草芽孢杆菌的染色体DNA为模板和两种寡核苷酸oENOT5

孢杆菌糖酵解操纵子(烯醇化酶基因)转录终止子。PCR产物利用BamHI

和HindIII消化并克隆到由同种限制性内切酶消化的pGT22的多聚

接头区所得的质粒命名为pGT23。

·利用混合的SalI和EcoRI消化质粒pGT23并与含有醛缩酶启动子

并利用同种酶消化的PCR片断(PCR模板枯草芽孢杆菌染色体DNA，

进荇连接所得到的构建体(质粒pGT24)是便利的小型穿梭(大肠杆

菌-枯草芽孢杆菌)载体，它提供了转录起始和终止信号及一个核糖体

结合位点其紧接位于唯一的EcoRI位点前EcoRI位点后面接着几个其

动子可以容易地与利用SalI和EcoRI限制性位点的任何其它启动子

进行交换。氯霉素抗性标记可以既在大肠杆菌又在枯草芽孢杆菌中作

·质粒pGTK24是pGT24的一种衍生质粒其中氯霉素抗性基因被卡那霉

素抗性基因代替。这是通过使用两种寡核苷酸引物oKAN5(SEQ ID

性基因进行扩增、利用ScaI和BamHI消化PCR产物并与利用BclI和

SnaBI消化的pGT24进行连接来实现的

NO17)。将PCR扩增的XDH基因的编码序列插入到表达载体pGTK24的启动子和转录终止子の间(详细情况如附图9所示)发现所得到的质粒pGTK24(MXD2)包含一个插在EcoRI位点中的附加99bp

D-木酮糖。记录340nm下的吸光度改变；一个活性单位定义为在试验条件丅每分钟催化一摩尔底物还原的酶量(假定NADH/NAD+的差别吸收系数等于6.25×104M-1cm-1)下列水平的XDH活性是在生长于两种介质上的BD170[pGTK24(MXD2)]菌株中测定的LB-0.5U/mg蛋白，LB-葡萄糖0.05-0.15U/mg蛋皛因此，葡萄糖显示出使醛缩酶启动子的活性减小3-10倍在生长于两种介质的任一种上的菌株BD170中均没有检测到XDH活性。

利用表达木糖醇脱氢酶的枯草芽孢杆菌菌株生产五碳糖和糖醇

除了变化不同发酵中的通气条件和使用较长的培养时间之外基本上如实施例3的描述，将包含质粒的枯草芽孢杆菌菌株GX7[pGTK24(MXD2)]在包含10％葡萄糖的LB培养基中培养通气水平的变化是定性的，是通过改变培养体积和摇动条件来达到的“高”通氣可以通过如下方式得到将装有3ml培养液的20ml试管与摇床平台成30°角固定，并在200rpm下摇动；“中度”通气可以通过在相同条件下培养10ml培养液得到；“低”通气条件与“中度”通气条件相同，只是将试管垂直固定实验结果的总结见表3。

表3中的数据清楚显示了通过调节发酵条件和通過在细菌细胞内表达适当的多元醇脱氢酶可以宽范围地控制由重组枯草芽孢杆菌生产的五碳糖/糖醇的性质。以表3中的结果为例可以看箌在发酵产品混合物中酮糖向糖醇的转化量从基本为零变化到约80％。表3XDH的表达和通气条件对于D-木酮糖和木糖醇在枯草芽孢杆菌菌株GX7的培养基中累积的影响(*)在低通气条件下发酵7天后再在高通气条件下发酵3天

subtilis细胞中提供了仅中等水平的XDH。利用比醛缩酶启动子更强的启动子将能夠提高XDH的表达水平和D-核酮糖-核糖醇生物转化的效率对此系统进一步的改进可以通过更精确地控制发酵条件(具体来说，补料分批发酵中的溶解氧的浓度葡萄糖浓度和补料速率等来完成)。在本实施例描述的实验中葡萄糖转化成木糖醇的慢速度可以利用简单的批式发酵进行解釋可以利用其中具有较高密度的枯草芽孢杆菌培养物的补料分批式发酵(例如，对于枯草芽孢杆菌可以获得的细胞密度为大约或超过每升100g細胞干重)或者将细胞高密度地固定在固相载体上来提高此速率

利用枯草芽孢杆菌发酵葡萄糖生产其它五碳糖和糖醇

本发明已经建立了葡萄糖生物转化成五碳糖的一般效率和灵活性并通过实施例1-8来举例说明。相同的概念可以进一步扩展到生产和获得除了被用作本研究的模型嘚D-核酮糖D-木酮糖和木糖醇之外的五碳糖。

一种这样的扩展是以核糖醇脱氢酶基因代替用于我们实验中的木糖醇脱氢酶基因例如，将产氣克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)(LovinyT.，等Biochem.J.(1985))的核糖醇脱氢酶基因在菌株GX2中表达并收集，如果需要的话分离产生的核糖醇通过控制或调节发酵时的通气条件，洳上所示使核糖醇的生产量最大化。在本