辐照大鼠颌下腺细胞,做western blot试剂盒怎么看蛋白质分子量的改变

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【求助】关于皮肤组织提蛋白做WesternBlot的问题
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这个帖子发布于4年零248天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
问题已解决悬赏丁当:5
我用皮肤组织提取蛋白做Western,试了好几次都没有结果。 反复排除了其他技术上及抗体的问题,而且用细胞提取的蛋白也能做出结果,最后的结论是提取蛋白这一步可能有问题。 我用的方法是:将皮肤取下的剪碎后用锡箔子装好放入液氮,之后再跟液氮一起进行研磨,跟蛋白裂解液一起移入匀浆器(冰浴中)裂解液1-2h,离心即可提可蛋白,蛋白裂解液中要加蛋白酶抑制剂。 请教各位万能的坛友,问题出在哪里,还有哪些需要改进的地方?多谢!!
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我做过小鼠裸鼠的皮肤组织,WB检测内参和目的还挺正常的。你提完蛋白后蛋白浓度有多大,我提取的蛋白浓度在5-8mg/ 检测过内参吗?内参都检测不出来吗?
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我觉得楼上说的有道理。可能是目的蛋白在培养的细胞中表达尚可,所以WB可以检测出来;但细胞在组织中的数量相对少,组织中大量的基质细胞,裂解后出来很多杂蛋白,相当于把你的目的蛋白稀释了。是否可以先消化下组织,去除一些基质细胞呢?或者,按你原来的流程,裂解液过下柱子,先把一些杂蛋白去掉?冻干裂解液,再重新溶解,以求提高目的蛋白上样量?
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我也在用大鼠皮肤实验遇到楼主一样问题 请问楼主解决了没 是什么解决方法
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那你是把组织和锡箔纸一起放到液氮里研磨的吗?
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请问你用的匀浆器是自动的那种吗?
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关于丁香园如何提细胞的组蛋白做western blot?目前在做western blot 不清楚怎么提细胞中的组蛋白怎么提,是用特殊的细胞裂解液吗?还是可以直接用核蛋白提取试剂盒呢?麻烦高手帮帮小弟.
最后派对°莭峙
你的意思就是提取核蛋白,提取核蛋白和提取全蛋白用的裂解液是不一样的.一般情况下我们都是买试剂盒,里面包含有细胞裂解液和核裂解液,按照说明书实用就行了.1 20mmol/L的Hepe(PH 7.9)2 420mmol/L NaCl3 1.5mmol/L MgCl24 2%Igepal5 0.5mmo/L EDTA6 20%甘油7 1mmol/L DTT8 0.25mmol/L PMSF9 5ug/ml Aprotinin10 5ug/ml Pepstatin11 5ug/ml Leupeptin或者你可以按照这个配,这个是细胞核裂解液.做法就是,你按顺序提了全蛋白以后把上清弃掉,在沉淀中加入这个核裂解液,震荡然后离心,此时上清就是核蛋白了.
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干嘛非要提组蛋白呢?直接提取细胞总蛋白,然后用组蛋白的抗体检测就是了,裂解液就用一般的就是了
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【求助】western blot 能否定量的检测蛋白的表达量?
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这个帖子发布于9年零27天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我的细胞经过处理后,看某一蛋白的表达量,可以用western blot 检测样品蛋白表达量的高低吗?western 做出的结果用什么软件分析它的蛋白表达量?
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楼主,你用western blot 做出来的图像上只会有你的目的蛋白条带,顶多可能有一些非特异性显色的条带,这是没有检测表达量的基础的,要想检测目的蛋白的表达量可以就用SDS-PAGE检测处理后的细胞液,再用凝胶分析软件分析目的蛋白条带的表达水平。有现成的仪器就可以通过分析凝胶得到目的蛋白的表达量,如果没有仪器可以用数码相机将SDS-PAGE结果拍照后保存到电脑中,通过软件分析,凝胶分析软件可以在DXY找到。
有一个western blot 的图片,请参考。
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因为我的蛋白还是未知蛋白,其大小也未知,通过它的一抗确定其在凝胶的位置,western 的结果照片,可以分析其表达量吧!
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western 只是能确定你目标蛋白的位置,只是特异性条带,非特意性很多多是显不出来的你可以跑一块SDS-PAGE,一半拿去western确定目标蛋白的位置知道位置以后可以用凝胶分析软件算一下表达量
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用持家基因做western ,进行半定量,可以吗?哪种方法更有效一些?我觉得凝胶分析软件更好一些。
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